植物抗壞血酸過氧化物酶基因家族研究進(jìn)展

李 娜,陸 海

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)

1 植物APX的酶學(xué)特征與催化機(jī)制

植物因在光合作用時(shí)釋放大量的氧而面臨著嚴(yán)峻的氧化脅迫.此外,植物在受到逆境脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量氧自由基,引起膜脂的過氧化、膜蛋白發(fā)生聚合等反應(yīng),從而破壞其生物膜的結(jié)構(gòu)和功能,損傷植物細(xì)胞.提高植物體內(nèi)氧自由基代謝途徑中的酶活力,可以增強(qiáng)植物抵御氧化脅迫的能力,從而增強(qiáng)植物耐逆能力.植物體內(nèi)清除氧自由基的酶有超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX,EC1.11. 1.11)、谷胱甘肽還原酶(GR)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)等.其中,SOD、APX和GR可形成高效的抗壞血酸—谷胱甘肽循環(huán).APX是以抗壞血酸(AsA)為電子供體的一種過氧化物酶.APX是植物體內(nèi)尤其是葉綠體中清除H2O2的關(guān)鍵酶[1].

APX催化的反應(yīng)為,2AsA+H2O2→2MDA(單脫氫抗壞血酸自由基)+2H2O.APX的催化循環(huán)屬于過氧化物酶的“乒乓機(jī)制”,其反應(yīng)如下(R表示卟啉或保守Trp殘基,MDA為單脫氫抗壞血酸,反應(yīng)速率為類囊體型APX的數(shù)值)[1]:

目前,APX基因序列已經(jīng)在菠菜、豌豆、擬南芥、西紅柿、水稻、馬鈴薯等植物中分離獲得[2-4].此外,豌豆APX蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)也已得到鑒定[5].研究表明,APX是一種包含原卟啉IX的血紅蛋白,它的分子量大約是30 kD,單體存在,但有幾種cAPX則以同二聚體形式存在[6].植物過氧化物酶超家族的特征是:含組氨酸(His-42)和精氨酸(Arg-38),末端的組氨酸與天冬酰氨(Asn-71)側(cè)鏈以氫鍵相連,而天冬酰氨(Asn-71)則以氫鍵與主鏈羰基谷氨酸(G lu-65)的羰基相連;在鄰近血紅素的位點(diǎn),組氨酸(His-163)與血紅素鐵結(jié)合,并與天冬氨酸(Asp-208)形成很強(qiáng)的氫鍵,這6個(gè)殘基在幾乎所有的APX中都是保守的[7].

2 植物APX基因家族成員組成與細(xì)胞內(nèi)分布

高等植物的APX存在著多種同工酶:一種是光合器官型,又稱葉綠體型同工酶,包括位于基質(zhì)中的APX(sAPX)和同類囊體膜結(jié)合的APX(tAPX);另一種是非光合器官型,在植物細(xì)胞的胞漿、線粒體和乙醛酸循環(huán)體中均有發(fā)現(xiàn).另外,根據(jù)APX各同工酶所在細(xì)胞中內(nèi)位置的不同,APX可分為胞質(zhì)APX同工酶APX(cAPX)、質(zhì)體基質(zhì)APX同工酶APX(sAPX和mitAPX)、過氧化物酶體APX(mbAPX)同工酶和葉綠體類囊體膜APX同工酶APX(tAPX),前兩者屬于可溶性同工酶,后兩者為膜結(jié)合同工酶.在細(xì)胞內(nèi),不同位置的APX同工酶具有不同的生化特性,即具有不同的分子量、底物特異性、最適pH值和對抗壞血酸的穩(wěn)定性[8].研究證明,葉綠體APX同工酶比胞質(zhì)APX同工酶、過氧化物酶體APX同工酶更加不穩(wěn)定,在無抗壞血酸存在的條件下會(huì)迅速失活[1].

此外,研究還發(fā)現(xiàn),在擬南芥中至少有6個(gè)基因編碼的APX蛋白,分別是:2個(gè)胞質(zhì)APX同工酶基因(At1g07890和At3g09640),2個(gè)過氧化物酶體APX同工酶基因(At4g35000和At4g35970),一個(gè)類囊體膜束APX同工酶基因(At1g77490),一個(gè)葉綠體/線粒體APX同工酶基因(At4g08390)[9].

2004年,Teixeira等[10]在水稻中分離出了8個(gè)APX同工酶基因,其中有2個(gè)胞質(zhì)APX同工酶(Os-APX1和OsAPX2),2個(gè)假定的過氧化物酶體同工酶(OsAPX3和OsAPX4),還有4個(gè)假定的葉綠體APX同工酶(OsAPX5-OsAPX8),其中OsAPX8被認(rèn)為是類囊體膜束APX同工酶.同時(shí),通過使用GFP作為標(biāo)簽對OsAPX3和OsAPX6 2個(gè)同工酶在細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)中的定位,證明了OsAPX3定位于過氧化物酶體內(nèi),而OsAPX6定位于線粒體內(nèi).

有研究表明:APX同工酶在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的定位由蛋白質(zhì)C、N端區(qū)域的導(dǎo)肽和跨膜結(jié)構(gòu)決定[11];過氧化物酶體APX同工酶的導(dǎo)肽組成C端的跨膜結(jié)構(gòu)域,該導(dǎo)肽富含纈氨酸(Valine)和丙氨酸(Ala),并且伴隨一個(gè)含有約5個(gè)氨基酸殘基的正電荷區(qū)域[12];過氧化物酶體APX同工酶通過粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)直接定位于過氧化物酶體,并且暴露于胞質(zhì)[13];與過氧化物酶體APX同工酶不同,所有的葉綠體APX同工酶在其N端具有羥基化的肽段,該部分在成熟蛋白質(zhì)中將被加工處理[14].另外,類囊體膜結(jié)合APX同工酶在其C端擁有一段跨膜的疏水結(jié)構(gòu)[15].

3 植物APX的組織與發(fā)育特異性表達(dá)調(diào)控

對植物來說,不同部位、不同組織的APX活性存在明顯差異.

謝小群等[16]對黃芩一年生植株種子、花瓣、頂芽、葉和根中APX活性的測定結(jié)果表明,不同部位、不同組織的APX活性差異顯著.其總活力順序依次為,頂芽＞葉＞根＞種子＞花瓣.試管苗生長過程中,APX的總活力和比活力變化趨勢與試管苗生長趨勢呈現(xiàn)較好的一致性,即在生長初期,APX活性處于較低水平,7d后試管苗生長旺盛,代謝活動(dòng)加強(qiáng),生物量迅速增加,APX活性也隨著代謝作用加強(qiáng)而急劇上升,此后,營養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗,生長逐漸緩慢, APX活性下降.

Gadea等[17]對番茄果實(shí)的研究表明,在番茄成熟后期,因H2O2急劇積累,其CAT活性降到較低水平,而APX及GR受衰老影響不大,仍具有一定活性.所以,抗壞血酸—谷胱甘肽循環(huán)可能在成熟后期及衰老過程中的H2O2代謝中發(fā)揮重要作用.

馮晴等[18]的研究表明,在小麥葉片衰老過程中,APX比CAT活力下降得晚,表明APX在小麥葉片衰老的中后期起著比CAT更重要的清除H2O2的作用.APX酶的增加,可能是衰老進(jìn)程對基因表達(dá)的調(diào)節(jié).CAT存在于過氧化體、乙醛酸循環(huán)體等微體中,而APX則存在于葉綠體、線粒體、乙醛酸循環(huán)體和細(xì)胞質(zhì)中,葉綠體是產(chǎn)生 H2O2的主要場所,因此,APX清除H2O2要比CAT更直接.此外,在葉片衰老過程中,APX活力下降較晚,可能與AsA-GSH循環(huán)途徑中的單脫氫抗壞血酸自由基還原酶、雙脫氫抗壞血酸還原酶及谷胱甘肽還原酶的調(diào)節(jié)有關(guān).

4 植物APX的誘導(dǎo)表達(dá)特性

研究表明,在臭氧、SO2、Fe、Cu、百草枯、熱擊、強(qiáng)光等逆境條件下,細(xì)胞質(zhì)APX轉(zhuǎn)錄水平增加,而在冷、熱、紫外光、H2O2、鹽、百草枯等脅迫時(shí),過氧化物酶體APX的轉(zhuǎn)錄水平增加.而葉綠體APX正相反,在外界條件刺激下,其轉(zhuǎn)錄水平很少改變.但也有研究表明,在干旱時(shí),小麥的類囊體APX活性增加[19],菠菜葉片中APX活性明顯增加[20].另外,水楊酸(SA)能夠抑制APX活性,用特定電磁波處理作物干種子和發(fā)芽種子能顯著提高其APX活性.Spundova等[21]的研究表明,抗旱性不同的 2個(gè)小麥品種,其葉綠體基質(zhì)APX和類囊體結(jié)合的APX在幼苗期對抗旱響應(yīng)表現(xiàn)明顯不同,說明不同定位的APX可能在H2O2清除中發(fā)揮著不同作用.

目前,研究人員對于擬南芥與水稻的相關(guān)研究研究 比 較 系 統(tǒng)[22,23].比 如,擬 南 芥 AtAPx1 (At1g07890)基因在植物的不同組織都有表達(dá),并且其表達(dá)水平受各種脅迫條件的調(diào)節(jié),AtAPx2 (At3g09640)基因在光合維管束鞘細(xì)胞層的表達(dá)受光照和植物損傷的調(diào)控.AtAPx1同工酶是擬南芥消除活性氧的重要成員.此外,Davletova等[9]通過使用基因敲除方法的研究表明,在植物受到光照脅迫條件下,胞質(zhì)APX同工酶在保護(hù)葉綠體免受損傷方面發(fā)揮重要作用.

Teixeira等[24]揭示了水稻APX基因家族各基因在不同組織和各種環(huán)境脅迫條件下的表達(dá)水平的相互協(xié)調(diào)性.Hong等[25]報(bào)道了水稻根中的APX8(Os-APX 8)受鹽濃度的影響較大,運(yùn)用半定量反轉(zhuǎn)錄PCR方法,分別檢測了水稻APX1～APX8 mRNA的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在150 mmol/L和200 mmol/L NaCl條件下,水稻根部的OsAPX8表達(dá)量有所增加,但是其他家族成員的表達(dá)量卻不受影響,而在300 mmol/L NaCl的條件下,APX家族成員有著更復(fù)雜的變化, OsAPX8表達(dá)量有所增加,OsAPX7的表達(dá)量有所下降,但APX基因家族其他成員的表達(dá)量卻不受影響.同樣,外源脫落酸(ABA)的使用同樣會(huì)提高根中OsAPX8的表達(dá)水平.

D’Arcy-Lameta等[3]研究了在3種脅迫條件下(逐漸干旱、快速干燥、施用外源脫落酸ABA)碗豆葉子中的4種APX同工酶(細(xì)胞質(zhì)APX、過氧化物酶體APX、葉綠體基質(zhì)APX、類囊體APX)的基因表達(dá)情況,研究表明,在干旱脅迫下,耐旱型植株的APX酶活基本不變,而干旱敏感型植株的APX酶活較對照增加了78%,這與有些文獻(xiàn)中的報(bào)道相矛盾,作者分析指出,酶的活性應(yīng)該視加于植物上的脅迫以及植物本身對脅迫的抗性和敏感性而定.干旱引起的膜損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞隔區(qū)的破壞,因此不可能在水分脅迫下準(zhǔn)確地測定不同的細(xì)胞隔區(qū)的APX活性.為了更好地了解每種APX同工酶的作用,作者還克隆了不同同工酶的基因,分別研究它們在不同脅迫下的表達(dá)水平.研究表明,在快速干燥和施用外源ABA時(shí),干旱敏感型植株的細(xì)胞質(zhì)APX和過氧化物酶體APX的基因轉(zhuǎn)錄增加,而耐旱型植株相應(yīng)同工酶的轉(zhuǎn)錄水平保持穩(wěn)態(tài).

Park等[26]在成功克隆甘薯的swAPX1基因后,又研究了該基因在各種非生物和生物脅迫下的表達(dá)情況.swAPX1基因只在甘薯的成熟葉片和培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞中表達(dá),在莖、儲(chǔ)藏根和非儲(chǔ)藏根中卻沒有表達(dá),而且在懸浮細(xì)胞的生長過程中,swAPX1的表達(dá)量不斷的增加.通過 RT-PCR方法,Park等發(fā)現(xiàn)swAPX1基因在葉片中的表達(dá)受各種非生物脅迫條件的調(diào)控.損傷、50 mmol/L甲基紫精、440 mmol/L過氧化氫或100μmol/L脫落酸條件下,swAPX1基因的表達(dá)量均明顯升高.另外,在細(xì)菌病原體感染的條件,swAPX1基因的表達(dá)量也會(huì)增加.同時(shí),該結(jié)論也證明了swAPX1基因在清除甘薯葉片中的過氧化氫方面發(fā)揮了重要作用,從而有利于植株克服非生物和生物脅迫造成的氧化損傷.

Yabuta等[27]的研究表明,在轉(zhuǎn)基因煙草中,葉綠體APX在清除活性氧體系中發(fā)揮著很重要的作用,它保證了葉片的葉組織在水—水循環(huán)和光合作用中維持能量.Davletova等[9]的研究發(fā)現(xiàn),在擬南芥中,如果缺乏細(xì)胞質(zhì)APX時(shí),會(huì)導(dǎo)致葉綠體和過氧化物酶體的的H2O2清除系統(tǒng)瓦解,從而不能清除光合作用和光呼吸中產(chǎn)生的H2O2,因而導(dǎo)致了H2O2含量升高,蛋白發(fā)生氧化.Hossain等[28]的研究發(fā)現(xiàn), APX的活性降低是引起劍蘭的花衰老的決定條件,所以,細(xì)胞質(zhì)APX作為活性氧清除體系中的中心物質(zhì)也是極其重要的,作用機(jī)制可能涉及到一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo).

5 植物APX在基因工程中的應(yīng)用

現(xiàn)已證實(shí),增強(qiáng)植物耐逆性的途徑之一是提高植物體內(nèi)抗氧化酶類活性及增強(qiáng)抗氧化代謝的水平.轉(zhuǎn)基因植物中APX的過量表達(dá),已經(jīng)被證明可以提高轉(zhuǎn)基因植物的抗性.目前,研究人員已從棉花、擬南芥等植物中克隆了APX基因,并進(jìn)行了部分轉(zhuǎn)基因植物的研究.例如,擬南芥中tAPX的過量表達(dá)增強(qiáng)了對除草劑(Paraquat)誘導(dǎo)的光合氧化脅迫和氧化氮誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抗性[19].此外,Wang等[29]將一個(gè)細(xì)胞質(zhì)APX(cAPX)基因轉(zhuǎn)入番茄中過量表達(dá),結(jié)果顯著提高了轉(zhuǎn)基因番茄的抗寒和抗鹽能力.Sarowar等[30]將一個(gè)辣椒APX基因轉(zhuǎn)入煙草,同樣提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧化脅迫與抗真菌能力,同時(shí),該實(shí)驗(yàn)室研究人員也將一個(gè)楊樹過氧化物酶體APX基因轉(zhuǎn)入煙草,同樣提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱耐鹽能力[31].Sun等[32]將StAPX基因轉(zhuǎn)入煙草,同樣提高了轉(zhuǎn)基因煙草幼苗的對鹽與滲透脅迫的抗性.

此外,APX轉(zhuǎn)基因的反義表達(dá)可以研究是否提高植物體的維生素C含量,也可以研究呼吸作用多條線路的選擇性.Tarantino等[33]的研究表明,在擬南芥中降低類囊體APX的表達(dá)導(dǎo)致對百草枯和一氧化氮抗性的顯著下降.Rizhsky等[34]的研究表明, APX及CAT的雙反義植物比APX或CAT單反義植物對氧化脅迫更不敏感.

6 結(jié) 語

隨著分子生物學(xué)技術(shù)與基因工程的迅猛發(fā)展,研究人員通過分離等技術(shù)手段得到了各種植物的抗逆基因,如APX、SOD、POD等.但是,目前的研究已不僅僅局限于對各種抗逆基因的分子克隆和蛋白的活性分析,學(xué)者們更關(guān)注的是其在各種脅迫條件下功能的調(diào)節(jié)以及每個(gè)成員之間的相互關(guān)系.

APX同工酶的表達(dá)狀況受處于各種脅迫條件下的各個(gè)細(xì)胞區(qū)室的分別調(diào)控.因此,研究APX在植物細(xì)胞中的定位,比較逆境脅迫下細(xì)胞內(nèi)APX同工酶對于氧化脅迫的敏感性以及它們活性的大小將成為今后研究的一個(gè)方向.同時(shí),APX基因家族每個(gè)成員在植物發(fā)育的不同時(shí)期的表達(dá)調(diào)節(jié)和各個(gè)成員之間的相互協(xié)調(diào)關(guān)系也是研究的一個(gè)熱點(diǎn).另外,在APX同工酶表達(dá)過程中涉及的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo),以及H2O2作為第二信使方面的研究也是一個(gè)重點(diǎn).

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