黏細(xì)菌生物活性物質(zhì)的研究

劉冰花

(成都大學(xué)醫(yī)護(hù)學(xué)院,四川成都 610091)

0 引 言

黏細(xì)菌是最高等的原核生物,可滑動(dòng),具有多細(xì)胞行為,屬于好氧的革蘭氏陰性桿菌[1].由于黏細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢,難于分離純化,對(duì)其活性物質(zhì)的研究相對(duì)滯后.近年來(lái),黏細(xì)菌作為可產(chǎn)生豐富多樣生物活性物質(zhì)的微生物類群逐漸受到科研工作者的重視.迄今為止,研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了黏細(xì)菌產(chǎn)生的幾百種結(jié)構(gòu)不同的化合物,這些化合物中許多是以前從未發(fā)現(xiàn)過(guò)的.本文對(duì)1999年至今科研人員在黏細(xì)菌生物活性物質(zhì)方面的研究工作進(jìn)行綜述,以期對(duì)黏細(xì)菌進(jìn)一步的研究工作有所幫助.

1 黏細(xì)菌生物活性物質(zhì)功能研究

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),一株黏細(xì)菌可以產(chǎn)生多種不同功能的生物活性物質(zhì),并且黏細(xì)菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)奇特,表現(xiàn)出菌株特異性,而不是種或?qū)偬禺愋?

1.1 黏細(xì)菌抗腫瘤活性研究

近10多年來(lái),關(guān)于黏細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性物質(zhì)的報(bào)道很多,例如:Ahn等[2]從黏細(xì)菌Myxococcus fulvus的次級(jí)代謝物中分離得到myxothiazol和一種新物質(zhì)KR-025,并發(fā)現(xiàn)myxothiazol和KR-025對(duì)人類腫瘤細(xì)胞均有明顯抑制作用;施曉瓊等[3]從黏細(xì)菌菌株Myxococcus xanthus 095B06中分離到5種明顯抑制腫瘤細(xì)胞SMMC-7721、Hela的生長(zhǎng)的活性物質(zhì),它們分別為Avermectin A1a、Avermectin A2a、Avermectin B1a、Avermectin B2a、麥角甾-7,22-雙烯-3,5,6-三醇(賽勒維甾醇).李健、胡瑋等[4,5]從黏細(xì)菌Corallococcus coralloides Cc9736菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中分離到一種具有抑瘤活性的生物活性物質(zhì)CcC;馬中良、李艷利等[6-8]從纖維堆囊菌菌株so oe cpu-1中均發(fā)現(xiàn)了對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有良好抑制作用的SCC;郭文杰等[9-11]從菌株P(guān)olyangium vitellinum JsW103和另外6株黏細(xì)菌菌株中也發(fā)現(xiàn)了活性較強(qiáng)的抗腫瘤物質(zhì).

此外,從相關(guān)的報(bào)道中可以看到,堆囊菌屬和黏球菌屬產(chǎn)生抗癌活性物質(zhì)的幾率較高,研究人員在研究中發(fā)現(xiàn)纖維堆囊菌子實(shí)體不但對(duì)于腫瘤細(xì)胞如肝癌Be17402株系具有很強(qiáng)的體外殺傷活性,其子實(shí)體提取物灌胃對(duì)小鼠無(wú)毒性反應(yīng),并能夠明顯抑制移植瘤S180的生長(zhǎng)[12].同時(shí),研究人員還發(fā)現(xiàn)同一株黏細(xì)菌的代謝產(chǎn)物可以有多個(gè)組分具有抗腫瘤活性,但這些代謝產(chǎn)物在在抗腫瘤機(jī)制上可能具有顯著的多樣性[13].這些研究說(shuō)明,黏細(xì)菌在抗腫瘤藥物的開發(fā)方面具有極大的潛力.

1.2 黏細(xì)菌抗細(xì)菌活性研究

黏細(xì)菌可以產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的抗細(xì)菌抗生素,例如,Irschik等[14]從纖維堆囊菌So ce750和So ce1045菌株的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)etnangien,研究證明其是一種新的能有效抑制 G+的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,同時(shí),etnangien還可以抑制細(xì)菌和病毒的核酸聚合酶活性;Menche等[15]從纖維堆囊菌So ce1045菌株中又發(fā)現(xiàn)了etnangien的類似物methyl ester etnangien,其對(duì)G+的抑制作用更強(qiáng),抑制RNA聚合酶的活性與etnangien相當(dāng),但對(duì)DNA聚合酶不起作用, methyl ester etnangien比etnangien更容易從纖維堆囊菌的發(fā)酵液中獲得,并且在中性條件下結(jié)構(gòu)比etnangien穩(wěn)定.

另外,Ahn等[16]從土壤中分離到纖維堆囊菌K M1003,并從該菌的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了 Sorangiadenosine,其是一種新的倍半萜烯腺苷,實(shí)驗(yàn)證明,Sorangiadenosine即可抑制 G+,又可抑制 G-;H?fle等[17]發(fā)現(xiàn)黏細(xì)菌Stigmatella erecta Pd e32菌株可以產(chǎn)生抗細(xì)菌物質(zhì)5-nitroresorcinol(5-硝基間苯二酚).

此外,還有許多在黏細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)抗細(xì)菌活性物質(zhì)的相關(guān)報(bào)道,例如,Gaspari等[18]評(píng)價(jià)了97株黏細(xì)菌產(chǎn)生的抗菌化合物的產(chǎn)量,發(fā)現(xiàn)其中62株有抗菌活性,同時(shí),在一個(gè)純化菌株中發(fā)現(xiàn)了一種由黏細(xì)菌產(chǎn)生的典型的抗生素Myxovirescin,在3株黏細(xì)菌中檢出了可抑制原核生物蛋白質(zhì)合成的,而通常由放線菌產(chǎn)生的異硫霉素(Althiomycin);劉迎等[19]從黃海邊土壤中篩選到具有廣譜抗菌活性的白色黏細(xì)菌So ce cpu-1;殷建華等[20]發(fā)現(xiàn)黏細(xì)菌CS211菌株對(duì)蠟狀芽孢桿菌、藤黃八疊球菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌具有很強(qiáng)的抑制作用;劉冰花等[21,22]發(fā)現(xiàn)黏細(xì)菌Angiococcus sp.菌株胞外物、胞內(nèi)物均具有抗菌活性,且抗菌譜不同,其中胞外物對(duì)G+細(xì)菌有較強(qiáng)的抑菌作用,胞內(nèi)物對(duì)部分G+細(xì)菌及G-細(xì)菌有抑菌作用.

1.3 黏細(xì)菌抗真菌活性研究

近年來(lái),研究人員從黏細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了大量的抗真菌物質(zhì),例如,Bode等[23]從黏細(xì)菌纖維堆囊菌 So ce705和So ce690的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)獨(dú)特的leupyrrins A1,實(shí)驗(yàn)證明它能夠較好地抑制真菌和小鼠的成纖維細(xì)胞;Kundim等[24]從黏細(xì)菌 Cystobacter fuscus AJ-13278菌株中分離得到3種新的抗真菌的不穩(wěn)定的化合物(6E,10Z)-2′-O-methylmyxalamide D、2′-O-methylmyxalamide D 和 (6E)-2′-Omethylmyxalamide D;馬輝等[25]從黏細(xì)菌Myxococcus fulvus HW-1的發(fā)酵液中分離出9種抑制抗真菌的化合物(1-9).在這9種化合物中,有7種是環(huán)二肽,化合物7、8和9屬于非天然氨基酸組成的環(huán)二肽,均是首次從天然產(chǎn)物中得到的,化合物4、7、8和9均是首次在黏細(xì)菌的次生代謝產(chǎn)物中分離得到的.同時(shí),利用稻瘟霉模型和紙片擴(kuò)散法對(duì)分離得到的單體化合物進(jìn)行抗菌活性評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)化合物4、5、7、8和9對(duì)稻瘟霉的生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用,化合物4不但能中度抑制稻瘟霉的生長(zhǎng),并且能引起菌絲體末端膨大,化合物4、5、7、8和9對(duì)枯草芽孢桿菌有明顯抑制作用.

此外,H?fle等[17]發(fā)現(xiàn)黏細(xì)菌 Stigmatella erecta Pd e32菌株產(chǎn)生一種新的抗真菌物質(zhì)aurachin P((1′R,2′S,3′R)-1′-aurachin A);Steinmetz等[26]從Myxococcusfulvus菌株中發(fā)現(xiàn)了抗真菌物質(zhì)myxothiazol Z;朱斌等[27]發(fā)現(xiàn)黏細(xì)菌NUST03菌株可以產(chǎn)生一種強(qiáng)烈抑制黑曲霉的抗生素.

1.4 黏細(xì)菌產(chǎn)生酶活性研究

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),黏細(xì)菌次級(jí)代謝物中不但有豐富的抗生素,而且有豐富的酶資源,如纖維素酶、木聚糖酶、溶栓酶等.閆章才[28]首次對(duì)溶纖維素黏細(xì)菌降解纖維素的機(jī)制進(jìn)行了初步研究,發(fā)現(xiàn)纖維素降解酶以復(fù)合體的方式組織在菌體細(xì)胞表面.侯配斌[29]以S09733-1為研究對(duì)象首次對(duì)纖維堆囊菌降解纖維素類物質(zhì)的基本特性進(jìn)行了較為全面的表征,而且進(jìn)一步證明了其纖維素降解酶類以一種高效的多酶復(fù)合體形式分布于細(xì)胞表面,履行相關(guān)的功能.上述研究首次在好氧細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)類似的降解酶類組織形式存在,突破了纖維素酶復(fù)合體的厭氧界限,具有重要的理論意義.

此外,趙曉飛等[30]從黏細(xì)菌Angiococcus sp.的發(fā)酵液中分離出一種具有抗凝溶栓雙活性的蛋白MF-1,并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究,首次從黏細(xì)菌中分離得到具有較高抗凝和溶栓雙活性的且穩(wěn)定不易失活的MF-1蛋白;劉敏等[31]以純化菌株Sorangium cellulosum So 9733-1為材料,對(duì)其產(chǎn)木聚糖酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,得出的適宜培養(yǎng)條件組合是,以濾紙粉為碳源,以(NH4)2SO4為氮源,pH值為7.0,溫度為30℃;殷建華等[32]發(fā)現(xiàn)黏細(xì)菌Myxococcus xanthus CMC 0605菌株產(chǎn)生的纖維素酶的最適pH為6.0～7.0,最適溫度40℃.

2 黏細(xì)菌生物活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究

近年來(lái),科研人員采用氣—液色譜、氣—相色譜、氣—質(zhì)色譜、核磁共振等先進(jìn)技術(shù),對(duì)部分黏細(xì)菌活性物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了闡明(見表1),但仍有很多黏細(xì)菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)到目前還沒有弄清楚.

3 黏細(xì)菌活性物質(zhì)的生物合成

在研究黏細(xì)菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)性質(zhì)的同時(shí),科研人員也密切關(guān)注著這些活性物質(zhì)在黏細(xì)菌體內(nèi)的合成途徑.從1999年至今,研究人員采用同位素標(biāo)記等方法已經(jīng)弄清楚了黏細(xì)菌多種活性物質(zhì)的合成途徑,例如,aurachin P、5-nitroresorcinol、myxothiazol Z、土臭味素[36,37]、異偶數(shù)脂肪酸[38]、myxochelins A和B[39].

表1 1999年至今已闡明結(jié)構(gòu)的主要黏細(xì)菌生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物及產(chǎn)生菌

此外,Tse等[40]開發(fā)了一個(gè)在大腸桿菌中用于epothilone前體定向生物合成的埃博霉素合成酶的模塊6-9系統(tǒng),為了系統(tǒng)地探討了該系統(tǒng)生物合成的潛力,研究人員還研究了在這個(gè)工程研究途徑中最關(guān)鍵的第一個(gè)模塊——EpoD-M6,接受、延長(zhǎng)和處理底物的能力,發(fā)現(xiàn)EpoD-M6被表達(dá)、被純化,并且證明其同時(shí)接受酰基輔酶A和acylSNAC底物,被測(cè)試的底物中,除了較多的復(fù)雜的天然底物外,octanoylSNAC和3 octenoylSNAC被證明是優(yōu)秀的底物.該研究成果將有利于epothilone類似物和相關(guān)復(fù)雜的聚酮前體的定向合成.

4 黏細(xì)菌生物活性物質(zhì)基因研究

為了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)黏細(xì)菌,研究人員對(duì)它的基因產(chǎn)生了興趣,特別是黏細(xì)菌決定生物活性物質(zhì)的基因.

張曉元[41]研究發(fā)現(xiàn),纖維堆囊菌S09733-1木聚糖酶XynB為內(nèi)切木聚糖酶,由398個(gè)氨基酸殘基組成,完整基因全長(zhǎng)1 197 bp,該酶N端大約100個(gè)氨基酸與數(shù)據(jù)庫(kù)中的現(xiàn)有序列沒有任何同源性,功能未知.高昂[42]研究了XynB N端結(jié)構(gòu)域的功能,結(jié)果顯示,XynB中氨基酸114～398為糖基水解酶家族10保守區(qū),氨基酸1～113功能未知,在此基礎(chǔ)上,成功構(gòu)建了木聚糖酶XynB N端結(jié)構(gòu)域、C端結(jié)構(gòu)域和完整XynB的異源表達(dá)質(zhì)粒,并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá),經(jīng)過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn),推測(cè)XynB的N端結(jié)構(gòu)域不具有底物結(jié)合區(qū)等與木聚糖降解有關(guān)的功能,XynB N端結(jié)構(gòu)域與XynB在細(xì)胞中的定位有關(guān).上述研究為更加深入地研究XynB N端結(jié)構(gòu)域的功能打下了基礎(chǔ).

此外,Sandmann等[43]在黏細(xì)菌Angiococcus disciformis An d48里轉(zhuǎn)入了一個(gè)鑒別次級(jí)代謝物生物合成基因編碼調(diào)節(jié)器的轉(zhuǎn)座子,并用HPLC分析了1 200個(gè)轉(zhuǎn)座子突變體的抽提物,發(fā)現(xiàn)其中6個(gè)突變體的myxothiazol產(chǎn)量增加了30倍,通過(guò)轉(zhuǎn)座子及插入位點(diǎn)旁的序列鑒定,發(fā)現(xiàn)一些無(wú)活性基因編碼類似于細(xì)菌調(diào)節(jié)器的蛋白質(zhì),如二組分系統(tǒng)和絲氨酸—蘇氨酸蛋白激酶.然而,其他基因產(chǎn)物不類似于任何具有特征的蛋白質(zhì),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明通過(guò)引入轉(zhuǎn)座子的方法鑒別次級(jí)代謝物的調(diào)節(jié)基因是一種有價(jià)值的方法;Perlova等[44]發(fā)現(xiàn)了一株新的生長(zhǎng)迅速的嗜熱黏細(xì)菌菌株Corallococcus macrosporus GT-2,對(duì)該株黏細(xì)菌的理化性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn),株菌的發(fā)酵時(shí)間和生長(zhǎng)周期都比其他黏細(xì)菌短,同時(shí)將黏細(xì)菌Stigmatella aurantiaca中產(chǎn)生活性物質(zhì)myxochromides的基因組通過(guò)轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)入GT-2菌株,發(fā)現(xiàn)異源宿主GT-2菌株myxochromides的產(chǎn)量明顯高于Stigmatella aurantiaca菌株.

5 提高黏細(xì)菌生物活性物質(zhì)產(chǎn)量的方法

想把黏細(xì)菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)從發(fā)酵液中提取并純化,就必須提高黏細(xì)菌產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的產(chǎn)量.

王寧等[45]在研究一株可降解黃曲霉毒素B1的黏細(xì)菌的產(chǎn)酶條件時(shí),通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)化的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件.李越中等[46]研究影響纖維堆囊菌So ce 90菌株合成epothilone的條件時(shí),發(fā)現(xiàn)在指數(shù)期接種、低氮高碳培養(yǎng)、某些鹽離子如CuSO4、較高濃度的氨基酸混合物和乙酸鹽對(duì)epothilone的合成有益.劉迎等[19]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加So ce cpu-1次級(jí)代謝產(chǎn)物的粗提物作為誘導(dǎo)物可提高菌株So ce cpu-1次級(jí)代謝物的產(chǎn)量.羅立新等[47]發(fā)現(xiàn)在利用纖維堆囊菌發(fā)酵生產(chǎn)epothilone的工藝中,添加環(huán)式糊精到發(fā)酵培養(yǎng)基中不僅可以吸附產(chǎn)物同時(shí)不影響菌體的生長(zhǎng),還可以減弱產(chǎn)物抑制的現(xiàn)象.

6 黏細(xì)菌生物活性物質(zhì)化學(xué)合成

黏細(xì)菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)已經(jīng)引起了眾多化學(xué)合成研究人員的極大興趣.1999年至今,已經(jīng)有多種黏細(xì)菌產(chǎn)活性物質(zhì)通過(guò)化學(xué)合成方法進(jìn)行了全合成,例如,crocacins A-D[48]、epothilone A和epothilone B[49]、(-)-Ratjadone[50]、(+)-Crocacin D[51]、(-)-Disorazole C1[52]、(-)-Apicularen A[53]、tubulysin的類似物[54]、Melithiazole C[55]、tubulysin U、tubulysin V和它的差向異構(gòu)體epitubulysin V(不是天然產(chǎn)物)[56].

此外,Krebs等[57]通過(guò)一系列化學(xué)方法合成了黏細(xì)菌Chondromyces crocatus產(chǎn)生的ajudazol A的右半部分的側(cè)鏈.H?fle等[58]用化學(xué)方法半合成了黏細(xì)菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)Aurachin E.Smith等[59]建立了高效合成黏細(xì)菌次級(jí)代謝物(+)-sorangicin A的藥效基團(tuán)二氧雙雜環(huán)[3.2.1]辛烷中心的合成途徑.

值得一提的是,由黏細(xì)菌 Sorangium cellulosum分泌的具有抗腫瘤活性的epothilones目前已經(jīng)作為抗癌新藥在全球范圍內(nèi)進(jìn)行治療小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、晚期乳腺癌、復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤等癌癥的臨床試驗(yàn).

7 結(jié) 論

近10多年來(lái),研究人員對(duì)于黏細(xì)菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)的研究已經(jīng)取得了極大的進(jìn)展和大量的成果.但總體上看,對(duì)于黏細(xì)菌這類藥用潛力很大的細(xì)菌群體來(lái)說(shuō),上述研究工作還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,比如在抗生素的研究方面,研究人員發(fā)現(xiàn)了很多黏細(xì)菌可以產(chǎn)生抗生素,但對(duì)這些活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究工作還顯得有些滯后.同時(shí),關(guān)于黏細(xì)菌生物活性物質(zhì)基因工程方面以及其在農(nóng)業(yè)方面的研究工作也顯得有些單薄.相信隨著人們的關(guān)注,將會(huì)有越來(lái)越多的人力與物力投入到黏細(xì)菌的研究中,從而加快黏細(xì)菌的開發(fā)與應(yīng)用的進(jìn)程.

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