3*Flag-hPAK4重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在COS7細胞中的表達與定位

張紅艷，王春玉，李彥姝，王迪，李豐

(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)教研室，細胞生物學(xué)衛(wèi)生部重點實驗室，遼寧沈陽 110001)

Rho家族鳥苷三磷酸酶(Rho、Rac、Cdc42)作為調(diào)節(jié)不同細胞進程的分子開關(guān)，參與從細胞黏附、遷移到細胞生存、凋亡的過程［1］。p21活化的激酶(PAKs)是Cdc42和Rac下游重要的靶蛋白。到目前為止，PAK家族共有6個成員［2］，所有成員都包含一個高保守的絲氨酸蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，其激酶活性與PAKs執(zhí)行細胞功能有關(guān)［2］。PAKs與多種細胞內(nèi)蛋白相互作用，提示PAKs是多向性激酶，參與多種細胞信號通路，例如:參與細胞骨架的信號通路，參與細胞生存通路［3］。根據(jù)結(jié)構(gòu)和序列同源性將PAKs分為兩大類:Ⅰ類 PAK成員包括 PAK1、PAK2、PAK3，Ⅱ類 PAK成員包括 PAK4、PAK5、PAK6［4］。

PAK4是目前研究較為廣泛的Ⅱ類PAK，并且表達廣泛，胚胎及成年組織中均有表達，尤其在前列腺、睪丸、結(jié)腸組織中高表達［5］。PAK4與腫瘤關(guān)系非常密切，PAK4在許多腫瘤細胞系中和源于乳腺、肺、胰腺、結(jié)腸、前列腺的腫瘤中高表達［6-9］。PAK4的研究對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及治療有非常重要的作用。本研究構(gòu)建3*Flag-hPAK4質(zhì)粒，純化PAK4蛋白，研究PAK4相互作用蛋白，為腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提供依據(jù)，可以使用標簽抗體Flag觀察PAK4在細胞中的定位。

1 材料與方法

1． 1 菌株、細胞和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α感受態(tài)為本實驗室制備，MCF-7乳腺癌細胞系和COS7細胞為本實驗室保存，3*Flag載體購自Sigma公司。

1． 2 主要試劑

PyrobestTMDNA polymerase、dNTP、DNA 電泳凝膠回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑、限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ均購自大連 TaKaRa公司;TRIzol RNA提取試劑購自Invitrogen公司;DNA marker、Protein marker購自GenScript公司;T4 DNA連接酶購自NEB公司;Flag抗體購自上海Genomics公司;HRP標記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Alexa Fluor 594、DAPI購自 Invitrogen公司;引物合成、DNA測序由上海生物工程有限公司完成;ECL發(fā)光試劑盒購自購自GE Healthcare公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1． 3 MCF-7乳腺癌細胞RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

MCF-7細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至90%融合，提取細胞總RNA。在3.5 cm直徑的培養(yǎng)板中加入1 ml TRIzol，用移液器反復(fù)吹打，直到細胞全部裂解。RNA提取過程按照Invitrogen公司提供的TRIzol說明書進行操作。測RNA的OD260和OD280值，計算比值和濃度。將MCF-7提取的RNA稀釋到濃度為 1 μg·μl－1，進行反轉(zhuǎn)錄。操作步驟按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。

1． 4 hPAK4全長基因擴增

設(shè)計hPAK4擴增的PCR引物，并在引物中加入了EcoRⅠ和BamHⅠ兩個限制性酶切位點。上游hPAK4引物為5'-TCCAGAATTCCATGTTCGGGAAGAG GAAG-3'，下游 hPAK4引物為 5'-ATATTGGATCCT CATCTGGTGCGGTTCTG-3'。以MCF-7 cDNA為模板PCR擴增hPAK4全長編碼序列。

1． 5 3*Flag-hPAK4表達載體的構(gòu)建

將3*Flag載體和hPAK4 PCR片段分別用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，凝膠回收純化產(chǎn)物。將兩個片斷用T4 DNA連接酶常溫連接2 h，然后16℃連接過夜，取5 μl轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，37℃培養(yǎng)過夜。挑取菌落，接種于含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定外源基因的插入，質(zhì)粒DNA送上海生物工程有限公司進行測序分析。

1． 6 3*Flag-hPAK4瞬時轉(zhuǎn)染COS7細胞系

COS7細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞鋪于六孔板至70% ～80%融合，按照Abmart公司提供的TranSmarter轉(zhuǎn)染六孔板的說明書進行操作。

1． 7 蛋白質(zhì)提取與Western blotting鑒定

轉(zhuǎn)染24 h后，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗兩遍。在細胞中加入60 μl含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，用橡皮刮刀將細胞緩慢刮下。收集所有液體到新的離心管中，冰上放置10 min裂解細胞。13 000×g 4℃離心30 min，將上清轉(zhuǎn)到新的離心管中，取上清5 μl，選用G250考馬斯亮藍方法進行蛋白定量。

將蛋白定量后，取 80 μg總蛋白經(jīng) 10%SDS-PAGE凝膠分離，4℃過夜40 V恒壓轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5% 脫脂奶粉封閉1 h。用Flag抗體(1∶1 000稀釋)室溫孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(1∶5 000稀釋)孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。ECL顯影。

1． 8 共聚焦激光掃描顯微鏡觀察3*Flag-PAK4細胞內(nèi)定位

將3*Flag-PAK4轉(zhuǎn)染到COS7細胞中，24 h后用4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX100通透細胞膜，山羊血清封閉1 h，anti-Flag抗體(1∶150稀釋)室溫孵育1 h，PBS洗3 次，每次 10 min，Alexa Fluor 594(1∶100稀釋)室溫孵育1 h，PBS洗3次，每次10 min，DAPI(1∶1 000稀釋)室溫孵育 20 min，PBS洗 3次，每次10 min，使用50%甘油封片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察，紅色區(qū)域為PAK4蛋白在細胞內(nèi)的定位，藍色代表細胞核。

1． 9 免疫沉淀

將COS7細胞均勻分配，鋪于兩個10 cm培養(yǎng)板中至 70% ～80%融合，按照 Abmart公司提供的TranSmarter轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作。其中一個轉(zhuǎn)染3*Flag空載，另一個轉(zhuǎn)染3*Flag-hPAK4質(zhì)粒。24 h后收集細胞，使用免疫沉淀裂解液裂解細胞，10 000 r·min－1離心30 min，轉(zhuǎn)移上清到新的 EP 管中，加入4 μl anti-Flag抗體，4℃旋轉(zhuǎn)1 h，加入50%Protein A beads 30 μl 4℃旋轉(zhuǎn)3 h，用免疫沉淀裂解液洗滌3次，500×g離心2 min，棄上清。加入等體積的2*loading buffer，SDS-PAGE凝膠分離，4℃過夜40 V恒壓轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5% 脫脂奶粉封閉1 h。用anti-Flag抗體(1∶1 000稀釋)室溫孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(1∶5 000稀釋)孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。ECL顯影。

2 結(jié) 果

2． 1 PCR反應(yīng)擴增hPAK4基因全長

以MCF-7 cDNA為模板，特異性的引物進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增hPAK4基因全長。擴增條件為95℃5 min預(yù)變性;95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進行30個循環(huán);72℃ 10 min，溫度降至4℃。1%水平瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色后，在紫外燈下觀察結(jié)果(圖1)。

2． 2 重組質(zhì)粒3*Flag-hPAK4的構(gòu)建及鑒定

將重組質(zhì)粒3*Flag-hPAK4用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后得到約6 100 bp和1 800 bp的兩條帶(圖2)，重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果表明質(zhì)粒構(gòu)建成功，經(jīng)過測序分析，外源系列在NCBI-Blast比對結(jié)果與hPAK4編碼序列一致。

圖1 PCR擴增hPAK4基因Fig 1 PCR amplification of the full length hPAK4

圖2 BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒3*Flag-hPAK4Fig 2 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid 3*Flag-hPAK4

2． 3 Western blotting檢測蛋白表達

分別將3*Flag空載和3*Flag-hPAK4轉(zhuǎn)染COS7細胞，24 h后收集細胞，提取蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，Western blotting檢測蛋白表達，轉(zhuǎn)染3*FlaghPAK4，見一明顯條帶(圖3)，空載體對照組未出現(xiàn)反應(yīng)條帶。3*Flag-hPAK4分子質(zhì)量約為68 kDa，為質(zhì)粒本身的3*Flag標簽分子質(zhì)量(1．65 kDa)和hPAK4分子質(zhì)量68 kDa之和。表明構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒在COS7細胞中表達。

2． 4 3*Flag-hPAK4在細胞內(nèi)的定位

通過共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察3*FlaghPAK4在細胞內(nèi)的定位(圖4)，激發(fā)光分別為594 nm(紅色)，340 nm(藍色)。

圖3 Western blotting檢測3*Flag-PAK4融合蛋白的表達Fig 3 Western blotting detect the expression of 3*Flag-PAK4 fusion protein using anti-Flag mAb

圖4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察3*Flag-PAK4在COS7細胞內(nèi)的定位Fig 4 Confocal microscopy pictures of COS7 cells show the subcellular localization of 3*Flag-PAK4

2． 5 免疫沉淀

分別將3*Flag空載和構(gòu)建的3*Flag-hPAK4轉(zhuǎn)染COS7細胞，24 h后收集細胞，提取蛋白，使用anti-Flag抗體沉降蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳，Western檢測到被沉降的3*Flag-hPAK4蛋白的表達(圖5)。

3 討 論

Ⅱ類PAK是多向性的激酶，參與多種細胞功能，包括細胞運動、神經(jīng)元生長的調(diào)節(jié)、激素信號通路、基因轉(zhuǎn)錄、細胞存活等。因此這些蛋白參與癌癥的進展和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。其中PAK4是Ⅱ類PAK中發(fā)現(xiàn)最早，也是目前研究的最為廣泛的成員。有證據(jù)表明PAK4通過兩條不同的通路促進細胞存活:PAK4增加BAD 磷酸化水平［10］和延遲半胱天冬酶分裂［10-11］。在正常的細胞中PAK4能使細胞周期停滯，在高表達PAK4的細胞中，上調(diào)P53和細胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達［12］。PAKs影響細胞運動和細胞存活通路，已經(jīng)成為癌癥的治療靶點。研究證明Ⅱ類PAK的活性影響癌細胞的性能。PAK4高表達是致癌的［6］，PAK4能抑制癌細胞凋亡，PAK4與腫瘤壞死因子α受體復(fù)合物相互作用，促進細胞存活通路［13］。體內(nèi)試驗表明PAK4能促進腫瘤發(fā)生，PAK4表達缺失減弱V12Ras引起的腫瘤發(fā)生［14］。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是多階段、多基因參與的過程，相關(guān)基因的調(diào)節(jié)機制異常復(fù)雜［15］。利用3*Flag-PAK4質(zhì)粒研究PAK4對腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲的影響很有意義。

圖5 3*Flag抗體免疫沉淀PAK4蛋白Fig 5 3*Flag antibody immunoprecipitate PAK4 protein

本研究為了能在真核細胞中表達PAK4蛋白，用于在體或離體的實驗研究，深入探討PAK4的生物學(xué)功能，利用DNA重組技術(shù)將PAK4重組到3*Flag載體中，通過酶切和測序保證擴增片段的正確性;通過Western blotting方法證實融合蛋白的正確性。融合蛋白中含有3*Flag親和標簽可用于輔助目標蛋白的純化和檢測。本研究構(gòu)建了PAK4的真核表達載體，并且重組質(zhì)粒中帶有3*Flag標簽，為Western blotting檢測基因表達提供了保證。本實驗通過亞克隆的方法成功構(gòu)建了3*hFlag PAK4融合蛋白重組質(zhì)粒，并驗證了表達和定位，為從細胞和分子水平研究PAK家族的生物學(xué)功能奠定了良好的基礎(chǔ)。

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