大腸桿菌分泌表達(dá)重組水蛭素Ⅲ的新方法研究

黃翠翠，呂靜，吳梧桐，譚樹華，王鑫

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 210009)

水蛭素(hirudin)是從醫(yī)用水蛭唾液腺中分離得到的一類抗凝血多肽物質(zhì)，它是由65～66個氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)(多肽)。水蛭素對凝血酶有極強(qiáng)的抑制作用，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凝血酶天然特異抑制劑［1］。

大腸桿菌是應(yīng)用最早的原核表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)方式主要有3種形式:非融合表達(dá)、融合表達(dá)以及分泌表達(dá)。已有的分泌表達(dá)載體，如PIN-Ⅲ-ompA，所采用的是大腸桿菌外膜蛋白(ompA)信號肽序列，其后是用來插入外源基因的多克隆位點(diǎn)，當(dāng)外源基因插入后，信號肽基因與目的基因間往往存在一段多余的連接序列，這樣，為了得到N-端正確的目的產(chǎn)物，必須采用定點(diǎn)誘變技術(shù)，以去除信號肽基因與目的基因間的多余序列，操作十分繁瑣。為了解決這一問題，譚樹華等［2］創(chuàng)建了一種新型分泌表達(dá)載體pTASH，該表達(dá)載體含有tac啟動子、L-門冬酰胺酶信號肽簡并基因(L-asp)以及pUC18高拷貝復(fù)制原點(diǎn)，其中的L-asp 3'端與水蛭素編碼基因5'端直接拼連組建成重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒載體可分泌表達(dá)基因重組水蛭素及其突變體［3］。國外已成功構(gòu)建雙表達(dá)盒提高降鈣素的表達(dá)［4］，國內(nèi)也有文獻(xiàn)報道已成功構(gòu)建雙表達(dá)盒人骨唾液酸蛋白畢赤酵母工程細(xì)胞［5］。本研究在pTASH基礎(chǔ)上構(gòu)建了一種包含兩個串聯(lián)的水蛭素基因表達(dá)盒單元的分泌表達(dá)載體p(TASH)2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后搖瓶培養(yǎng)，上清液抗凝血酶活性可達(dá) 3 500 ATU·ml－1。

1 材料與方法

1． 1 質(zhì)粒

模板質(zhì)粒pTASH由本室構(gòu)建［2］。

1． 2 工具酶及主要生化試劑

限制酶、pMD-19T SimpleVector載體及DL2，000TMDNA Marker購自TaKaRa(大連寶生物工程有限公司)，pfu酶、Taq酶及UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒等購自上海生工生物有限公司，纖維蛋白原凍干粉購自上海萊士血液制品有限公司，凝血酶凍干粉購自南京南大制藥有限公司，其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1． 3 儀器

Effendorf PCR儀(德國 Eppendorf)，EPS 300電泳儀(上海天能科技有限公司)，UV2000紫外分析儀(上海天能科技有限公司)。

1． 4 方法

1．4．1 表達(dá)載體pTASH中表達(dá)盒基因的擴(kuò)增

依據(jù)模板質(zhì)粒pTASH基因序列設(shè)計合成引物。正向引物 pkk223-3TAC-f:5'GGATCCAAGCTGTGG TATGGCTGTGCAGGTCGTAAATC-3'(下劃線指示BamHⅠ酶切位點(diǎn));反向引物pkk223-3rrnBT2-r:5'GGATCCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAG-3'(下劃線指示BamHⅠ酶切位點(diǎn))。以質(zhì)粒pTASH為模板，在Pfu DNA聚合酶的作用下進(jìn)行PCR反應(yīng)。50 μl PCR反應(yīng)體系為:正向引物及反向引物各20 pmol，Pfu DNA 聚合酶5 U，10 × 反應(yīng)緩沖液5 μl，dNTP(10 mmol·L－1)1 μl，MgCl2(25 mmol·L－1)3 μl，質(zhì)粒 DNA 0.3 μg，用無菌水補(bǔ)足到 50 μl。反應(yīng)條件如下:95℃變性5 min，進(jìn)入循環(huán)反應(yīng)(95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，反應(yīng)30個循環(huán))，最后在72℃延伸10 min。用乙醇沉淀PCR產(chǎn)物，待乙醇揮發(fā)后，用Taq DNA聚合酶在PCR產(chǎn)物兩端加A尾。

加完A尾的PCR產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，并以DL2，000TMDNA Marker作為對照，檢測基因片段大小正確后回收目的片段。目的片段與T載體在T4 DNA連接酶的作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌。采用菌落PCR法篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序反應(yīng)由Invitrogen公司完成。經(jīng)測序驗(yàn)證序列正確的質(zhì)粒，命名為pMD-19T-TASH(圖1)。

圖1 pMD-19T-pTASH質(zhì)粒圖譜Fig 1 Plasmid pMD-19T-pTASH

1．4．2 雙表達(dá)盒重組水蛭素質(zhì)粒的構(gòu)建

1．4．2．1 雙表達(dá)盒菌種的構(gòu)建 用堿裂解法提取質(zhì)粒pMD-19T-TASH，BamHⅠ酶切，以 DL2，000TMDNA Marker作為對照，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，并回收酶切片段，得到大小約1.1 kb的表達(dá)盒片段。抽提模板質(zhì)粒pTASH，用BamHⅠ酶切，以得到具有與表達(dá)盒片段相同的黏性末端的線性化pTASH。為防止線性化的pTASH在連接反應(yīng)中發(fā)生自身環(huán)化，需要使用去磷酸酶CIAP將其5'磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基。線性化的pTASH 在40 μl反應(yīng)體系(10× 反應(yīng)緩沖液 4 μl，CIAP 2 μl)中于37℃反應(yīng)4 h，65℃ 30 min滅活處理終止反應(yīng)，然后用乙醇沉淀得到較純的去磷酸化的線性pTASH。將表達(dá)盒片段與去磷酸化的線性pTASH在T4 DNA連接酶的作用下于16℃連接過夜，連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細(xì)胞。

1．4．2．2 菌種的篩選 篩選雙表達(dá)盒質(zhì)粒采用BamHⅠ酶切方法。此外，新插入的表達(dá)盒片段可以正向和反向兩種方式插入原始質(zhì)粒pTASH中(圖2、3)。為了檢測新插入表達(dá)盒的插入方向，選用EcoRⅠ酶切進(jìn)行驗(yàn)證。

1．4．3 重組水蛭素Ⅲ的高效分泌表達(dá)

挑選菌種篩選為陽性的重組水蛭素Ⅲ雙表達(dá)盒克隆p(TASH)2，接入30 ml LBA液體培養(yǎng)基中進(jìn)行種液培養(yǎng)，37 ℃、220 r·min－1振蕩培養(yǎng)14 h。然后以2%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基(胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，谷氨酸鈉 4%，麥芽粉 1.0%，Amp 100 μg·ml－1，KH2PO40.374%，Na2HPO4·12H2O 1.75%，pH 7.0)中，37 ℃、220 r·min－1振蕩培養(yǎng) 24 h，測定發(fā)酵液上清中的抗凝血酶活力。

圖2 正向插入質(zhì)粒圖譜Fig 2 Insertion of expression cassette in forward orientation

圖3 反向插入質(zhì)粒圖譜Fig 3 Insertion of expression cassette in reverse orientation

水蛭素生物活性測定參照Markwardt的凝血酶滴定方法［6］進(jìn)行:于酶標(biāo)板小孔中加200 μl 0.5%牛血纖維蛋白原(50 mmol·L－1，pH7.4 的 Tris-cl配制)，再加入10～100 μl水蛭素溶液，充分混勻。用微量進(jìn)樣器吸取標(biāo)準(zhǔn)的凝血酶溶液(生理鹽水配制成100 IU·ml－1)進(jìn)行滴定，每次滴定量為 5 μl(0.5 IU)，時間間隔為1 min，若在1 min內(nèi)纖維蛋白原發(fā)生凝固，說明已達(dá)到終點(diǎn)。由于水蛭素與凝血酶是1∶1結(jié)合，故每消耗一個凝血酶單位(IU)相當(dāng)于一個抗凝血酶單位(ATU)。因此，可由凝血酶的消耗量換算出水蛭素的單位數(shù)。

2 結(jié) 果

2． 1 表達(dá)盒基因的擴(kuò)增

2．1.1 菌落PCR篩選

以陽性轉(zhuǎn)化子為模板，在25 μl反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng):95℃ 5 min，進(jìn)入循環(huán)反應(yīng)(95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，反應(yīng)30個循環(huán))，72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖4)，可見大小約1.1 kb的片段，與目的基因大小相同。

圖4 菌落PCR篩選陽性克隆Fig 4 Screening of positive clones by PCR

2．1.2 目的片段測序

從菌落PCR反應(yīng)為陽性的克隆中挑選一個測序，測序反應(yīng)由Invitrogen公司完成。雙向測序驗(yàn)證顯示序列正確(圖5、6)。

2． 2 雙表達(dá)盒菌種的構(gòu)建

2．2.1 BamHⅠ酶切篩選含有雙表達(dá)盒的陽性克隆

由于在新插入的表達(dá)盒兩端均為BamHⅠ酶切位點(diǎn)，因此酶切后有1.1 kb大小片段的克隆即為雙表達(dá)盒陽性克隆(圖7)。由圖7可見，所篩選的7、17、18以及20號菌均為含有雙表達(dá)盒的陽性克隆。

2．2.2 EcoRⅠ酶切檢驗(yàn)插入方向

用EcoRⅠ酶切法驗(yàn)證新插入的表達(dá)盒片段的插入方向。若為正向插入，可切出大小為1 162 bp的片段，若為反向插入，則可切出大小為462 bp的片段。在BamHⅠ酶切驗(yàn)證為陽性的4個克隆中，7、17、18號菌都為正向插入，而20號菌則為反向插入(圖8)。

圖5 正向測序圖譜Fig 5 DNA sequencing analsis on p(TASH)2(forward)

圖6 反向測序圖譜Fig 6 DNA sequencing analsis on p(TASH)2(reverse)

圖7 BamHⅠ驗(yàn)證雙表達(dá)盒陽性克隆Fig 7 Screening of clones with dual expression cassettes by BamHⅠ

圖8 EcoRⅠ檢驗(yàn)表達(dá)盒插入方向Fig 8 Insert trend detection of expression cassette by EcoRⅠ

2． 3 重組水蛭素Ⅲ的高效分泌表達(dá)

挑選雙表達(dá)盒菌種p(TASH)2連續(xù)進(jìn)行3批培養(yǎng)，同時以單表達(dá)盒菌種pTASH為對照，在同樣條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別檢測重組水蛭素Ⅲ的表達(dá)水平。用Markwardt的凝血酶滴定方法測得活性數(shù)據(jù)如表1、2所示。

表13 組雙表達(dá)盒菌種p(TASH)2活性測定Tab 1 Anti-thrombin activity of p(TASH)2

表2 3組單表達(dá)盒菌種pTASH活性測定Tab 2 Anti-thrombin activity of pTASH

將單表達(dá)盒菌種pTASH及雙表達(dá)盒菌種p(TASH)2表達(dá)重組水蛭素的活性數(shù)據(jù)用Graph pad prism軟件作圖分析比較(圖9)，結(jié)果顯示雙表達(dá)盒菌種分泌表達(dá)重組水蛭素的抗凝血酶活性平均水平可達(dá)3500 ATU·ml－1，而單表達(dá)盒菌種表達(dá)重組水蛭素的抗凝血酶活性平均為2 000 ATU·ml－1?？梢婋p表達(dá)盒菌種p(TASH)2的表達(dá)水平整體高于單表達(dá)盒菌種pTASH。

圖9 雙表達(dá)盒克隆p(TASH)2與單表達(dá)盒克隆pTASH分泌表達(dá)重組水蛭素Ⅲ水平比較Fig 9 Comparison of the anti-thrombin activity of rHirudinⅢsecreted by p(TASH)2and pTASH

經(jīng)分析，雙表達(dá)盒菌種p(TASH)2表達(dá)活性3組數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，組間P值為0.000 6，數(shù)據(jù)有意義，活性均值為 3 578 ATU·ml－1(表3)。

表3 雙表達(dá)盒菌種p(TASH)2活性數(shù)據(jù)分析Tab 3 Analysis of activity data of p(TASH)2

3 討 論

本研究在原大腸桿菌高效分泌表達(dá)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，通過高保真PCR技術(shù)復(fù)制水蛭素基因表達(dá)盒單元，再將該表達(dá)盒單元與原質(zhì)粒相連，形成具有兩個串聯(lián)表達(dá)盒單元的雙表達(dá)盒質(zhì)粒。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，其搖瓶培養(yǎng)的上清液抗凝血酶活性可達(dá)3 500 ATU·ml－1，為單表達(dá)盒菌種的 1.75 倍。

崔莉等［7］采用正交實(shí)驗(yàn)法確定了水蛭素Ⅲ工程菌的較佳培養(yǎng)基組分(蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，谷氨酸鈉4%，麥芽汁10%)，由于麥芽汁存放時間較短且批間差異較大，本次實(shí)驗(yàn)使用麥芽粉代替，確定了較合適的發(fā)酵培養(yǎng)基組分為蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，谷氨酸鈉4%，麥芽粉1%，并在培養(yǎng)基中添加了磷酸鹽成分，以減少在大腸桿菌生長過程中pH值的變化對細(xì)菌的生長以及重組蛋白表達(dá)的不利影響。

搖瓶水平的培養(yǎng)已證實(shí)雙表達(dá)盒p(TASH)2的分泌表達(dá)活性高于單表達(dá)盒pTASH，其生物反應(yīng)器水平的表達(dá)量還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］鄭琳，郭長虹，馬軍，等．重組水蛭素研究進(jìn)展［J］．中醫(yī)藥學(xué)報，2007，35(8):59-60．

［2］譚樹華，吳梧桐，劉景晶．新型大腸桿菌融合表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)水蛭素Ⅲ基因研究［J］．中國生化藥物雜志，1999，20(1):10-12．

［3］TAN S H，WU W T，LIU J J，et al．Efficient expression and secretion of recombinant hirudin Ⅲ in E．coli using the L-asparaginase Ⅱ signal sequence［J］．Protein Expr Purif，2002，25(3):430-436．

［4］RAY M V L，MEENAN C P，CONSALVO A P，et al．Production of salmon calcitonin by direct expression of a glycine-extended precursor in Escherichia coli［J］．Protein Expr Purif，2002，26(2):249-259．

［5］王征，王捷，楊靜，等．雙表達(dá)盒人骨唾液酸蛋白畢赤酵母工程細(xì)胞構(gòu)建［J］．中國生化藥物雜志，2005，26(5):264-269．

［6］MARKWARDT F．Hirudin as an inhibitor of thrombin［J］．Methods in Enzymology，1970，19:9241．

［7］崔莉，譚樹華，吳梧桐．重組水蛭素Ⅲ的工程菌的培養(yǎng)及高密度發(fā)酵［J］．藥物生物技術(shù)，2004，11(1):22-24．