SSRP1基因的克隆及其參與DNA損傷應(yīng)答的初步研究

江潔，洪澤輝

(1．南京市市級(jí)機(jī)關(guān)醫(yī)院內(nèi)科，江蘇南京 210018;2．東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)系，江蘇南京 210009)

Structure-specific recognition protein 1(SSRP1)是一個(gè)組蛋白的伴侶分子，在細(xì)胞內(nèi)和Spt16相互作用形成一個(gè)異源二聚體FAcilitates Chromatin Transcription(FACT)［1-2］。最近研究發(fā)現(xiàn)，SSRP1 參與 Cisplatin誘導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答［3］，但具體機(jī)制還不清楚。在本研究中，我們應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察到SSRP1快速聚集到激光誘導(dǎo)的DNA損傷部位，顯示了SSRP1在DNA損傷應(yīng)答中的動(dòng)態(tài)變化情況，我們的結(jié)果證實(shí)SSRP1參與DNA損傷應(yīng)答。

1 材料和方法

1． 1 材料

HeLa細(xì)胞，宿主菌E．Coli DH5α，綠色熒光載體EGFP-C1(本實(shí)驗(yàn)室保管)。

1． 2 方法

1．2．1 SSRP1 cDNA擴(kuò)增 按RNA提取試劑盒(南京生興生物技術(shù)有限公司)操作程序從HeLa細(xì)胞中提取總RNA，隨后以1 μg RNA為模板，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)操作程序?qū)RNA逆轉(zhuǎn)錄為總cDNA。根據(jù)NCBI上SSRP1的基因序列，分別設(shè)計(jì)上下游引物，并在5'端加上相應(yīng)酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。SSRP1上游引物:5'-AAACTCGAGATGGC AGAGACACTGGAGTTCAACGACGTC-3';下游引物:5'-TTTGCGGCCGCTCTCATCGGATCCTGACGCTGAGTC CTC-3'，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系:cDNA模板3 μl，上下游引物分別為2 μl(終濃度0．8 pmol·μl－1)，dNTP 2 μl，5 × PCR buffer 5 μl，HS primerstar polymerase 0．25 μl(大連寶生物工程有限公司)，補(bǔ)加滅菌蒸餾水至25 μl。擴(kuò)增條件為:預(yù)變性98℃ 30 s;變性98℃ 10 s，退火65℃15 s，延伸72℃ 2 min，35循環(huán);最后延伸72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1．2．2 EGFP-C1-SSRP1表達(dá)載體的構(gòu)建 將在瓊脂糖凝膠上的PCR產(chǎn)物進(jìn)行割膠純化，純化后PCR產(chǎn)物用XhoⅠ和NotⅠ(大連寶生物工程有限公司)進(jìn)行雙酶切，酶切后后的PCR產(chǎn)物再進(jìn)一步瓊脂糖凝膠電泳、割膠和純化。純化后產(chǎn)物與已作相同酶切的EGFP-C1載體連接，隨后涂平板、挑克隆、擴(kuò)增，最后提質(zhì)粒，用XhoⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。鑒定后的質(zhì)粒進(jìn)行全基因測序，測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1．2．3 激光刺激誘導(dǎo)DNA損傷 將HeLa細(xì)胞種植在3．5 cm的玻璃底培養(yǎng)皿中，24 h后轉(zhuǎn)染EGFP-SSRP1，同時(shí)在培養(yǎng)基中添加(或不添加)終濃度為10 mmol·L－1的BrdU。24 h后用激光共聚焦顯微鏡觀察(FV1000，Olympus)培養(yǎng)皿中細(xì)胞，用405 nm激光照射細(xì)胞核指定區(qū)域，隨后用488 nm激光觀察綠色熒光變化并拍照。

2 結(jié) 果

2． 1 SSRP1基因cDNA的克隆結(jié)果

已知的SSRP1只有1個(gè)轉(zhuǎn)錄變異子，其cDNA長度為2 130 bp(包括終止密碼子)。以HeLa細(xì)胞的cDNA為模板，用SSRP1的5'和3'引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳在大約2 100 bp的位置上出現(xiàn)目的條帶(圖1)。

圖1 SSRP1基因克隆結(jié)果Fig 1 PCR amplification of SSRP1

2． 2 EGFR-SSRP1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

SSRP1的PCR產(chǎn)物用XhoⅠ和NotⅠ雙酶切后，克隆到相應(yīng)雙酶切的EGFP-C1載體。從大腸桿菌中提出的重組質(zhì)粒用XhoⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，插入的DNA片段與SSRP1的長度相一致(圖2)。隨后，重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank上的序列對(duì)比分析，證實(shí)完全一致，表明SSRP1基因的克隆和載體構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒EGFP-C1-SSRP1的酶切鑒定Fig 2 Identification of EGFP-C1-SSRP1 by enzyme digestion

2． 3 激光誘導(dǎo)SSRP1蛋白聚集到的DNA損傷位點(diǎn)

將HeLa細(xì)胞種植在3．5 cm的玻璃底培養(yǎng)皿中，24 h后轉(zhuǎn)染EGFP-SSRP1，同時(shí)在培養(yǎng)基中添加(或不添加)終濃度為10 mmol·L－1的 BrdU。再過24 h，將培養(yǎng)皿在激光共聚焦顯微鏡下觀察。如圖3所示，EGFP-SSRP1在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，呈均勻分布，但核仁內(nèi)不表達(dá)EGFP-SSRP1。大量研究表明，激光照射可以造成DNA損傷。本實(shí)驗(yàn)用405 nm激光在細(xì)胞核指定區(qū)域照射，發(fā)現(xiàn)EGFP-SSRP1融合蛋白很快聚集到激光照射的位置。在細(xì)胞培養(yǎng)基添加(或不添加)BrdU的情況下，EGFP-SSRP1都有聚集現(xiàn)象，但很明顯，添加BrdU的細(xì)胞中，EGFP-SSRP1的聚集更強(qiáng)、更明顯。這也表明，SSRP1的聚集是針對(duì)于DNA的。細(xì)胞發(fā)生DNA損傷后，SSRP1快速聚集，激光照射后10 s時(shí)已有明顯的SSRP1聚集，在30 min時(shí)還存在較強(qiáng)的聚集現(xiàn)象。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SSRP1快速參與DNA損傷應(yīng)答和修復(fù)，并且是一個(gè)長時(shí)辰的效應(yīng)因子。

3 討 論

基因組穩(wěn)定性對(duì)于維持生物體正常的生命活動(dòng)有著極為關(guān)鍵的作用，但在生命活動(dòng)過程中不可避免地會(huì)受到體內(nèi)和體外多種因素的影響［4-5］。維持基因組穩(wěn)定性主要通過細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷應(yīng)答和修復(fù)系統(tǒng)來完成［4］。DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)本身出現(xiàn)基因突變或缺損，將導(dǎo)致DNA損傷不能被修復(fù)或正確修復(fù)，引起基因組不穩(wěn)定，從而產(chǎn)生各種遺傳性疾病，并且和腫瘤、衰老以及神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)［6-9］。DNA損傷應(yīng)答和修復(fù)是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，包括DNA損傷識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)、DNA修復(fù)，同時(shí)還涉及到細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等。最近幾年，關(guān)于DNA損傷應(yīng)答和修復(fù)的研究取得了很多進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)和鑒定了XLF，RNF和RAP80等多個(gè)DNA損傷應(yīng)答和修復(fù)相關(guān)基因［10-12］。盡管如此，DNA損傷應(yīng)答和修復(fù)分子機(jī)制仍存在許多未知的地方，有待于進(jìn)一步研究。

圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察SSRP1的聚集情況Fig 3 Recruitment of SSRP1 to DNA damage site induced by laser

在真核細(xì)胞中，DNA和組蛋白結(jié)合在一起，形成染色質(zhì)/染色體結(jié)構(gòu)。因此，DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和修復(fù)等都不可避免和染色質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)(染色質(zhì)重塑)密切相關(guān)［13-14］。在染色質(zhì)中存在多種組蛋白的伴侶分子，對(duì)于維持染色質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)起著重要的作用。SSRP1是Bunker于1995年克隆鑒定出來的一個(gè)含有HMG-box的蛋白［15］。隨后研究發(fā)現(xiàn)SSRP1和Spt16形成一個(gè)異源二聚體(即FACT)，是核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄必須的組蛋白伴侶分子之一［1-2］。細(xì)胞核基因在轉(zhuǎn)錄的時(shí)候，F(xiàn)ACT和轉(zhuǎn)錄區(qū)域的一個(gè)H2A、H2B異源二聚體相互作用，使H2A、H2B異源二聚體從核小體上脫落，協(xié)助RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄進(jìn)展［16］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ACT還和DNA復(fù)制、DNA損傷應(yīng)答及修復(fù)密切相關(guān)［3，17］，但具體的分子機(jī)制和功能并不清楚。在本實(shí)驗(yàn)中，我們成功地構(gòu)建了EGFP-SSRP1表達(dá)載體，利用激光局部照射技術(shù)造成DNA損傷［18-20］，發(fā)現(xiàn)SSRP1快速聚集到激光照射位點(diǎn)，直觀地提供了SSRP1對(duì)DNA損傷的動(dòng)態(tài)應(yīng)答情況。我們的研究結(jié)果證實(shí)SSRP1是DNA損傷應(yīng)答的早期效應(yīng)分子，但在DNA損傷應(yīng)答中的具體功能，還有待于進(jìn)一步研究。

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