PCNA和CD44v6在皮膚鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌中表達(dá)的研究

[摘要]目的:探討增殖細(xì)胞核抗原PCNA、細(xì)胞粘附因子CD44v6在皮膚鱗狀細(xì)胞癌(Squamous cell carcinoma，SCC)和基底細(xì)胞癌(Basal cell carcinoma，BCC)中表達(dá)的意義及相關(guān)性。方法:采用免疫組織化學(xué)法對82例石蠟包埋組織標(biāo)本進行檢測和統(tǒng)計分析。結(jié)果:①PCNA在皮膚SCC中陽性率(90.5%)顯著高于皮膚BCC組(52%)和正常皮膚組(13.3%)，CD44v6在正常皮膚中的陽性率(100%)顯著高于皮膚SCC組(66.7%)和皮膚BCC組(20%);②PCNA的高表達(dá)率與皮膚SCC的分化程度呈負(fù)相關(guān)，CD44v6的高表達(dá)率與皮膚SCC的分化程度呈正相關(guān);③PCNA和CD44v6在皮膚SCC和BCC中表達(dá)無明顯相關(guān)。結(jié)論:CD44v6和PCNA與皮膚BCC和SCC的發(fā)生、分化密切相關(guān)，可作為研究和判斷皮膚SCC和BCC生物學(xué)行為和預(yù)后獨立的重要指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]鱗狀細(xì)胞癌;基底細(xì)胞癌;PCNA;CD44v6;免疫組織化學(xué)

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)10-1487-03

Study of the expressions of CD44v6 and PCNA in cutaneous squamous cell carcinoma and cutaneous basal cell Carcinoma

WANG Qi，WANG Run-he，HU Qiang，JIN Jun-hua

(1.Department of Plastic Surgery， 2.Department of Dermatology， the Center Hospital of Xiangfan，Xiangfan，441021，Hubei，China)

Abstract: ObjectiveTo investigate the effects and relationship of the expressions of PCNA and CD44v6 in cutaneous squamous cell carcinoma and Cutoneous Basal cell carcinoma. MethodsThe expressions of CD44v6 and PCNA were evaluatecl by immunohistochemical assay in 42 cutanneous sqamous cell carcinoma，25 Cutaneous Basal cell carcinoma and 15 normal skin.Results① The positive expression rate of PCNA In CSCC (90.5%) was significantly higher than in CBCC (52%) and normal skin (13.3%) and differentiation (P<0.05).The positive expression rate of CD44v6 in norma skin(100%) was significantly higher than in CSCC(66.7%)and CBCC(20%) and differentiation (P<0.05). ② The high expression of PCNA in CSCC was negatively related to tumor differentiation (P<0.01). The high expression of CD44v6 in CSCC was positively related to tumor differentiation (P<0.01). ③The positive expressions of PCNA and CD44v6 in cutanneous sqamous cell carcinoma and cutaneous Basal cell carcinoma were not correlated (P>0.05).ConclusionThe over expression of PCNA and the down expression of CD44v6 in CSCC and CBCC played an important role in occurrence 、invasion and metastasis of tumor. The expressions of CD44v6 and PCNA in CSCC and CBCC were not correlated，They can be used as the independent biological morkers for the occurrence and development of CSCC and CBCC.

Key words: basal cell carcinoma;squamons cell carcinoma; PCNA; CD44v6; Immunohistochemical

CD44是一類分布廣泛的跨膜糖蛋白，參與機體各種生理功能，其外顯子按表達(dá)和拼接方式的不同分為CD44s和CD44v[1]，其中CD44v6與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切。增殖細(xì)胞核抗原PCNA是一種36KD的酸性核蛋白，為DNA聚合酶δ的輔因子，對DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)起重要作用，PCNA的合成和表達(dá)與細(xì)胞增殖狀態(tài)密切相關(guān)[2-3]。皮膚SCC和BCC均是皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞來源的腫瘤。其中SCC是皮膚惡性腫瘤中最常見的一種，占40%以上。CD44v6或PCNA在皮膚腫瘤中的報道極少，CD44v6和PCNA在皮膚BCC和SCC中對比研究，國內(nèi)外尚未見報道。本文運用免疫組化法檢測PCNA和CD44v6的表達(dá)情況，研究其與皮膚腫瘤的病理類型、分化程度的關(guān)系及兩種蛋白表達(dá)的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本采取和臨床資料:82例病理研究標(biāo)本取自同濟醫(yī)學(xué)大學(xué)附屬襄樊市中心醫(yī)院病理科2001年至2008年病理存檔的石蠟標(biāo)本。均經(jīng)組織病理學(xué)明確診斷。男45例，女37例，年齡32～65歲，平均46歲。其中皮膚鱗狀細(xì)胞癌患者42例(高分化鱗癌15例，中分化鱗癌13例，低分化鱗癌14例)，皮膚基底細(xì)胞癌25例，正常皮膚15例(取自我科整形手術(shù)中切取的正常皮膚)。

1.1.2主要試劑:即用型鼠抗人PCNA單克隆抗體購于北京中山生物技術(shù)公司、即用型鼠抗人CD44v6免疫組化單克隆抗體購于武漢博士德生物工程公司、SP免疫組化染色試劑盒均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購于北京中山生物技術(shù)公司。

1.1.3主要儀器:①-80℃超低溫冰箱;②CX51日本Olympus光學(xué)照相顯微鏡;③德國Leica組織切片機;④YWY781B醫(yī)用微波爐。

1.2方法

1.2.1固定和石蠟包埋:所有標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛常規(guī)固定，石蠟包埋。制成4μm厚連續(xù)切片，分別做HE染色和免疫組化染色。

1.2.2免疫組化染色方法:①石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(PH7.4)沖洗三次，每次3min;②取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液置于微波盒中，用大火煮開，再將組織片浸沒在修復(fù)液中，加蓋，中火煮15min，取出微波盒，冷卻至室溫后，取出組織片;③每張切片加50μl過氧化酶阻斷溶液 (試劑A)，以陰斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10min;④PBS(PH7.4)沖洗(3×3ˊ);⑤瀝干PBS液，每張切片加50μl的非免疫性動物血清(試劑B)，室溫孵育10min;⑥甩去血清，分別加PCNA(濃度1:100)和CD44v6 (濃度1:300)工作液50μl，4℃冰箱中過夜;⑦第二天將過夜切片用PBS沖洗3×5ˊ;⑧瀝干PBS液，每張切片加50μl生物素標(biāo)記的第二抗體(試劑C)，室溫孵育20min;⑨PBS沖洗3次，每次3min;⑩瀝干 PBS液，每張切片加50μl鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)，室溫下孵育20min;PBS沖洗3次，每次3min;⑾瀝干PBS液，每張切片加100μl的新鮮配置的酶底物顯色液(DAB)進行顯色5min;⑿自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，用中性樹膠進行封片;⒀用PBS代替一抗作空白對照。

1.3 免疫組化結(jié)果判定:CD44v6蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞膜上有棕黃色顆粒樣物質(zhì)沉著。PCNA蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒樣物質(zhì)沉著。結(jié)果判定采用半定量積分法，免疫組化染色記分標(biāo)準(zhǔn)如表1，以染色強度與陽性細(xì)胞的百分比的和做為每例標(biāo)本積分。0～1分為陰性(-)，2分為弱陽性(+)，3～5分為陽性(++)，大于5分為強陽性(+++)[4]。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS10.0軟件分析系統(tǒng)，采用χ2檢驗和精確概率法及計數(shù)資料的相關(guān)性分析，以P﹤0.05時認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PCNA、CD44v6在正常皮膚、皮膚SCC和皮膚BCC中的表達(dá):PCNA陽性定位于癌細(xì)胞胞核中，少量見于胞核。在正常皮膚中，PCNA表達(dá)于表皮基底細(xì)胞，偶見毛囊根部、皮脂腺周圍少數(shù)細(xì)胞呈陽性表達(dá)。高分化SCC中主要位于癌巢周圍，向中央逐漸減弱或呈陰性，低分化SCC中表現(xiàn)為彌散分布。從正常皮膚到BCC，直到SCC，PCNA表達(dá)逐漸增強，各組間陽性表達(dá)率比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)。CD44v6的陽性表達(dá)定位于癌細(xì)胞胞膜上。在正常皮膚標(biāo)本中，CD44V6表達(dá)于基底細(xì)胞層及棘細(xì)胞層。高分化SCC中陽性染色主要位于癌巢周邊部，低分化病例中散在分布。從正常皮膚到SCC，直到BCC，CD44v6表達(dá)逐漸下降，各組間陽性表達(dá)率比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)，見表2～3。

2.2 PCNA和CD44v6與皮膚SCC的分化程度關(guān)系:PCNA在皮膚SCC高、中、低分化組中高表達(dá)率分別為33.3%，69.2%，93.3%，MMP9的高表達(dá)與皮膚SCC分化程度呈負(fù)相關(guān)(χ2=10.881，P﹤0.01)。

CD44v6在皮膚SCC高、中、低分化組中高表達(dá)率分別為60.0%，23.1%，7.1%，CD44v6的高表達(dá)與皮膚SCC分化程度呈正相關(guān)(χ2=13.940，P﹤0.01)，見表4。

2.3CD44v6與PCNA在皮膚SCC和BCC中表達(dá)的相關(guān)性

在42例皮膚SCC中，CD44v6蛋白表達(dá)陽性組28例中，PCNA陽性表達(dá)為24例，陽性表達(dá)率為85.71%， CD44v6蛋白表達(dá)陰性組14例中，PCNA陽性表達(dá)有14例，陽性表達(dá)率為100%。Spearman相關(guān)性分析顯示兩者表達(dá)無相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r=-0.1342，P=0.122﹥0.05)。

在25例皮膚BCC中，CD44v6蛋白表達(dá)陽性組5例中，PCNA陽性表達(dá)有3例，陽性表達(dá)率為60%， CD44v6蛋白表達(dá)陰性組20例中，PCNA陽性表達(dá)有9例，陽性表達(dá)率為45%。Spearman相關(guān)性分析顯示兩者表達(dá)無相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r=0.1200，P=0.198﹥0.05)。

3討論

增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是真核生物復(fù)制復(fù)合體的核心成分， 具有特殊的環(huán)狀三級結(jié)構(gòu)。作為真核細(xì)胞DNA聚合酶δ的推動因子，與不同復(fù)制相關(guān)蛋白結(jié)合， 協(xié)調(diào)DNA復(fù)制過

程。同時PCNA還作為功能轉(zhuǎn)換因子，通過不同調(diào)控方式與多種細(xì)胞因子作用， 參與了DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控及凋亡等許多重要的細(xì)胞事件。另外，作為細(xì)胞增殖的指標(biāo)，PCNA與腫瘤等細(xì)胞增殖性疾病的發(fā)生和發(fā)展存在相關(guān)性。PCNA的合成和表達(dá)是反映細(xì)胞增殖的主要生物學(xué)指標(biāo)，本研究表明，SCC組織中PCNA表達(dá)量顯著高于BCC組織和正常皮膚中PCNA表達(dá)量(P﹤0.01)，隨著SCC分化程度的降低，PCNA表達(dá)量明顯增高(P﹤0.01)，腫瘤的增殖活性被認(rèn)為是惡性腫瘤的預(yù)后特征[5]，提示PCNA高表達(dá)與皮膚SCC及BCC發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

CD44v6是淋巴細(xì)胞的導(dǎo)向受體，在淋巴細(xì)胞的活化、細(xì)胞與細(xì)胞間粘附、細(xì)胞與基質(zhì)間相互作用及細(xì)胞的運動中發(fā)揮多種功能。近年來，廣泛的CD44v6研究表明，在消化道癌、肺癌、宮頸癌中CD44v6表達(dá)增強，且鱗癌表達(dá)高于腺癌，而在皮膚腫瘤、口腔腫瘤[8]中表達(dá)下調(diào)(與本文相符)。表明CD44v6表達(dá)與腫瘤類型及組織來源有關(guān)。本文研究顯示CD44v6在皮膚鱗癌和基癌中表達(dá)明顯低于正常皮膚中表達(dá)，在皮膚鱗癌中CD44v6高表達(dá)與細(xì)胞分化程度正相關(guān)，提示CD44v6可能在維持角質(zhì)形成細(xì)胞正常形態(tài)及增殖分化過程中起作用，并通過與其他淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原相互作用發(fā)揮局部抗腫瘤免疫作用，癌變過程中細(xì)胞獲得了表達(dá)CD44v6蛋白的阻斷信號導(dǎo)致低表達(dá)。這也可能與異常增生時細(xì)胞粘附力下降有關(guān)。CD44v6可以作為一個研究皮膚SCC和BCC發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)標(biāo)志，并且在一定程度上可以作為皮膚SCC分化程度及病理分級的參考指標(biāo)。皮膚BCC的癌細(xì)胞基本不表達(dá)CD44v6，這與Simon[9]1996年對基癌CD44v6表達(dá)下調(diào)的研究結(jié)果相吻合。雖然正?；准?xì)胞高表達(dá)CD44v6，但在發(fā)展成癌細(xì)胞后，CD44v6結(jié)構(gòu)改變或功能失活，從而不能與相應(yīng)抗CD44v6抗體結(jié)合而表現(xiàn)為CD44v6免疫組化陰性。

本研究表明，雖然CD44v6和PCNA均與皮膚SCC、BCC的發(fā)生、發(fā)展及組織分化密切相關(guān)，但它們之間沒有相關(guān)性，因此在皮膚SCC和BCC的診斷、治療、預(yù)后及生物學(xué)行為研究上，可作為獨立的判斷指標(biāo)。

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[收稿日期]2010-06-28 [修回日期]2010-09-13

編輯/張惠娟