Cyclin D1和p16在肥大乳房腺體組織中的表達及意義

[摘要]目的:探討CyclinD1以及p16蛋白在肥大乳房乳腺組織中的表達及意義。方法:采用免疫組化SP法，檢測35例肥大乳房及16例正常體積乳房乳腺組織中cyclinD1及p16蛋白的表達情況及相互聯(lián)系。結(jié)果:35例肥大乳房腺體組織中CyclinD1蛋白陽性表達率51.4%(18/35)，16例正常體積乳房標(biāo)本腺體組織中無一例CyclinD1呈陽性表達(0/16)，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。肥大乳房組腺體組織中 p16蛋白陰性表達率為77.2%(27/35)，正常體積乳房腺體組織中陰性率為31.3%(5/16)，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在CyclinD1陽性表達的18例樣本中，p16陰性表達者17例，陽性表達者1例，CyclinD1陰性表達的17例樣本中，p16陰性表達者10例，陽性表達者7例。Pearson相關(guān)性分析顯示，CyclinD1與p16的表達呈負相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論:①CyclinD1在肥大乳房腺體中呈高表達，p16呈低表達，提示其可能參與了肥大乳房的發(fā)生和發(fā)展;②CyclinD1和p16在肥大乳房組織中的表達呈負相關(guān)，提示二者存在著一定的調(diào)控關(guān)系。

[關(guān)鍵詞]細胞周期素D1;p16;肥大乳房

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)10-1481-04

The expression and significance of Cyclin D1 and p16 in the tissue of mammary hypertrophy

LI Qiong，SUN Jia-ming，YANG Yan-qing，GUO Ke，YANG Jie

(Department of Plastic Surgery，Union Hospital，Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，Hubei，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of the Cyclin D1 and p16 in the tissue ofmastoplasia.MethodsThe alteration of cyclin D1 and p16 in 35 cases within the tissue of mastoplasia and 16 cases within the normal breast were detected using highly sensitive SP immunohistochemistry method.ResultsThe rate of the positive expression of CyclinD1 in mammary hypertrophy group was 51.4% (18/35)， no positive expression of CyclinD1 in the normal mammary group was detected. There was obvious significant between the two groups in a statistics basis (P<0.05). While in mammary hypertrophy group the rate of the negative expression of p16 was 77.2% (27/35). There was also obvious significant between the two groups in a statistics basis (P<0.05). In mammary hypertrophy group， within the 18 cases of positive expression of CyclinD1， the negative expression of p16 is 17cases， while within the 17 cases of negative expression of CyclinD1， the negative expression of p16 is 10 cases. There exists negative correlation between CyclinD1 and p16 in mammary hypertrophy group.Conclusions①There were over expression of CyclinD1 and decreased expression of p16 within mammary gland in mammary hypertrophy which may be involved in the occurrence of mammary hypertrophy. ②Increased expression of CyclinD1 may be in certain relation with the decreased expression of p16 in the development of mammary hypertrophy.

Key words:cyclin D1; p16; mammary hypermastia

乳房肥大是一種常見的乳腺良性疾病，據(jù)臨床觀察，發(fā)病年齡多在12～40歲，其中以12～25歲為發(fā)病高峰期。乳房肥大(尤其是青少年乳房肥大或巨乳)會給患者的身心帶來很大的影響，但是其發(fā)病機制并沒有得到明確解釋。CyclinD1及P16是細胞周期中重要的調(diào)節(jié)因子，諸多國內(nèi)外的學(xué)者發(fā)現(xiàn)乳腺癌以及某些乳腺的良性疾病中存在著CyclinD1及P16的異常表達[1]，并用相關(guān)實驗證明了二者是許多疾病的重要參與者[2]。但至今未見CyclinD1及P16在肥大乳房研究中的相關(guān)報道。本研究通過對肥大乳房乳腺組織中CyclinD1及P16蛋白表達的研究，來探討二者與肥大乳房發(fā)病機制之間的關(guān)系。

1材料和方法

1.1 標(biāo)本納入標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 肥大乳房組選擇單側(cè)乳房總體積在600CC以上者作為研究對象。乳房體積的測量方法為(圖1):取站立位，測量乳房底部周長(PP)以及乳房下皺襞中點F在乳房前表面的投影點P至乳房下皺襞的直線距離(FP)。采用乳房體積計算公式(Sigurdson等[3]):

乳房體積(CC)= 35.5×PP+37.7×FP-1305

1.1.2 術(shù)后應(yīng)重新行病理診斷以確診為單純性乳房肥大(圖2)。

1.1.3 有下列情況之一者被排除在研究范圍之外[4]:①乳腺痛;②乳房觸痛或硬結(jié);③月經(jīng)周期不規(guī)律;④2個月內(nèi)有服用雌激素類藥物史;⑤乳頭溢液;⑥穿刺針吸或切除組織標(biāo)本中有囊腫、積液或積乳;⑦有乳癌家族史;⑧一側(cè)乳癌病史;⑨組織病理學(xué)檢查有非典型增生。

1.1.4 正常對照組患者應(yīng)行病理診斷確診為正常腺體組織，排除其他病變，回避月經(jīng)期。術(shù)前必須征得患者同意。

1.2 標(biāo)本來源及分組:所有病例均來自2007年9月～2009年3月間，武漢市協(xié)和醫(yī)院收治的要求行乳房縮小整形術(shù)的患者。以及同期收治的乳房體積在正常范圍(250～350ml)的行其他乳房手術(shù)患者。

1.2.1 肥大乳房組:共35例，年齡13～37歲，平均年齡22.3歲，乳房體積平均值為(852.33±144.20)ml。根據(jù)年齡段分為三組:13～20歲，21～30歲，31～37歲。

1.2.2 正常發(fā)育乳房組:共16例，年齡15～41歲，平均年齡24歲，乳房平均體積為(261.32±16.51)ml。

兩對照組的年齡無統(tǒng)計學(xué)差異。

1.3 實驗方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1免疫組織化學(xué)染色:采用SP法，主要步驟為:二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水， 高壓組織抗原修復(fù)，正常山羊血清37℃封閉，滴加羊兔一抗(KIT-0305，羊抗鼠/兔，邁新生物)4℃冰箱孵育過夜，次日分別滴加二抗(Rabbit Anti-Cyclin D1(RMA-0541，福州邁新)，P16(Mab20070710，遠泰生物)，DAB顯色10～15min，蘇木素復(fù)染胞核，脫水透明并用中性樹膠封片。

1.3.2CD1染色的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]:cyclinD1蛋白表達定位于胞核，胞核呈黃色或棕黃色顆粒著色為陽性細胞，染色結(jié)果在高倍鏡下，每例樣本中隨機選擇十個視野，每個視野中細胞數(shù)不少于500個細胞，利用光密度分析儀來檢測陽性細胞的百分率。若細胞的陽性率>10%為陽性表達(+)，>50%為強陽性表達(++)。

1.3.3P16染色的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]:p16蛋白在胞質(zhì)中的反應(yīng)性可以被忽略，唯有在胞質(zhì)背景中的細胞核染色才認為是p16蛋白的表達的證據(jù)，染色結(jié)果在高倍鏡下，每例樣本中隨機選擇十個視野，每個視野中細胞數(shù)不少于500個細胞，利用光密度分析儀來檢測陽性細胞的百分率。若細胞的陽性率>10%為陽性表達(+)，<10%為陰性表達。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，利用χ2檢驗方法，當(dāng)P<0.05時認為差異具有顯著性。

2結(jié)果

2.1 CyclinD1蛋白免疫組化染色定位于乳腺導(dǎo)管上皮細胞的細胞核內(nèi)，呈黃色或棕色的顆粒(圖3)。高倍鏡下，隨即選取10個視野，每個視野中細胞數(shù)不少于500個，利用IPP光密度分析儀，分析陽性細胞數(shù)目，然后計算陽性細胞的百分比，陽性細胞率>10%則說明該樣本陽性表達，>50%為強陽性表達，<10%則為陰性表達(圖4)。p16蛋白在胞質(zhì)中的反應(yīng)性可以被忽略，唯有在胞質(zhì)背景中的細胞核染色才認為是p16蛋白的表達的證據(jù)。染色結(jié)果在高倍鏡下，每例樣本中隨機選擇十個視野，每個視野中計數(shù)不少于500個細胞，來計算陽性細胞的百分率。若細胞的陽性率>10%為陽性表達(+)(圖5)，<10%為陰性表達(圖6)。

2.2 在肥大乳房組， CyclinD1陽性表達(+/++)者18例(51.4%)，陰性表達者17例(48.6%)，在對照組16例正常乳房腺體組織中，無一例CyclinD1陽性表達，，利用χ2檢驗分析實驗數(shù)據(jù)，比較兩組間CyclinD1蛋白的表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(αP<0.05，χ2=11.572)(表1)。在肥大乳房組，p16陰性表達者27例(77.2%)，p16陽性表達者8例(32.8%)，正常體積乳房組，p16陰性表達者11例(68.8%)，陽性表達者5例，利用χ2檢驗分析實驗數(shù)據(jù)，比較兩組間p16蛋白的表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(αP<0.05，χ2=87.51)(表2)。即說明CyclinD1的高表達與p16的低表達可能參與了乳房肥大的發(fā)生和發(fā)展。

2.3 在18例CyclinD1陽性表達中，p16陰性表達者17例，陽性表達者1例，在17例CyclinD1陰性表達中，p16陰性表達者10例，陽性表達者8例(表3)，利用Pearson相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)在肥大乳房組中CyclinD1和p16的表達呈負相關(guān)(r=-0.32，P<0.05)。

2.4 為了分析年齡因素是否與兩種蛋白的異常表達有關(guān)系，將樣本分為三個不同的年齡組:13～20歲，21～30歲，31～37歲，利用R×C表χ2檢驗分別分析兩指標(biāo)在各年齡組間表達的差異，結(jié)果顯示不同年齡組CyclinD1及p16蛋白的表達無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(表4、5)，即說明，年齡不是影響兩種蛋白異常表達的相關(guān)因素。

3討論

CyclinD(CD)是一組控制真核細胞周期發(fā)展的重要細胞周期調(diào)節(jié)蛋白，分子量36KD，有三種不同的亞型:CyclinD1，CyclinD2和CyclinD3，其中Cyclin D1(CD1)是其中一個重要亞型。CyclinD1與G1/S期調(diào)控相關(guān)，其主要的作用機理為:細胞在雌激素、生長因子等生長信號的刺激下，G1期Cyclin D1表達增加，然后與相應(yīng)的細胞周期蛋白依賴性激酶4和6(CDK4、CDK6)結(jié)合，形成CD/CDK復(fù)合體。CDKs本身沒有活性，它的激活依賴于與調(diào)節(jié)亞基Cyclins的結(jié)合，激活后，可使下游的效應(yīng)蛋白(如視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白pRb蛋白)被磷酸化，磷酸化的Rb蛋白調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子2(E2F)的表達，進而促進下游許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼CDK1和CyclinE、A的基因，最終通過一系列的反應(yīng)促使細胞越過限制點加速增殖。Cyclin D1的過表達會加快細胞周期的進行，加速細胞的分裂，從而導(dǎo)致組織或器官的增生和肥大，甚至?xí)辜毎驉盒赞D(zhuǎn)化。因此，CyclinD1基因被認為可與多種癌基因協(xié)同促進細胞轉(zhuǎn)化，是一種弱致癌基因。在多種腫瘤中有CyclinD1基因擴增或表達增強，如:乳腺癌[7]、食道癌[8]、喉癌[9]、胃腺癌[10]等，其臨床意義與腫瘤的類型有關(guān)。在相關(guān)乳腺疾病的研究中顯示CyclinD1可用于良、惡性乳腺疾病的鑒別，并且CyclinD1與雌激素受體ER有明顯的相關(guān)性[11-12]。CyclinD1表達增高的患者由于ER表達也增高，因而對三苯氧胺治療的敏感性提高，總有效率大于71%，而不表達CyclinD1或ER的患者對三苯氧胺治療的總有效率不足10%。其在臨床上可以有助于判斷雌激素敏感性的治療。許多研究提示在消化系統(tǒng)腫瘤中的CyclinD1過度表達是預(yù)后不良的重要征象[13]。

p16是細胞核中一種重要細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CDK inhibitor，CKI)對細胞周期起負調(diào)控作用。它可以特異性抑制CD1/CDK 4復(fù)合物或CD1/CDK6復(fù)合物的活性，使其下游的視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(pRB)不被磷酸化，并且，還可以競爭性的與轉(zhuǎn)錄因子2(E2F)及其它蛋白質(zhì)結(jié)合，限制靶基因的表達，其次，p16蛋白還可以通過抑制CyclinD1蛋白向細胞核外輸出，從而保證了CyclinD1在G1期的核定位[14]，通過上述機制，p16蛋白最終阻止細胞周期進入S期，控制細胞增殖。因此，p16(ink4)基因也被稱作多腫瘤抑癌基因，其高頻率的純合缺失和突變在許多腫瘤組織中都存在[15-17]，因此，一些學(xué)者推測p16是繼p53之后腫瘤基礎(chǔ)及臨床研究中的又一個熱點。p16的基因突變的形式主要有基因缺失、點突變、和染色體易位、5'CpG甲基化等幾種。有專家[18]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織中，p16蛋白表達的失活與p16基因被甲基化有關(guān)。

CyclinD1與 p16二者的動態(tài)平衡是細胞保持正常增殖的一個重要保證， CyclinD1的高表達，p16的缺失或失活都將直接導(dǎo)致細胞發(fā)生癌變。研究表明， Cyclin Dl的過量表達和p16的缺失，在多種腫瘤細胞中是同時發(fā)生的。王強修等[19]在胃癌組織中發(fā)現(xiàn)Cyclin Dl高表達和p16蛋白低表達多同時存在。國外有學(xué)者[20]將抗 Cyclin D1抗體和 p16蛋白共同注射至正常的成纖維細胞，比單獨注射上述兩種蛋白造成的生長抑制更明顯。提示這兩種異常相聯(lián)合，使腫瘤細胞獲得更大的生長優(yōu)勢。其次在瘢痕，血管瘤等病變中也存在著二者的異常改變。

目前，國內(nèi)外大多數(shù)研究側(cè)重于研究CyclinD1及p16在乳腺腫瘤組織中的表達及臨床意義，但對其在乳房肥大中的作用及機制報道甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，在肥大乳房腺體組織中，同樣存在著CyclinD1蛋白的高表達以及p16蛋白的低表達，這種異常表達與年齡分組無相關(guān)性，但是，CyclinD1的高表達與p16的低表達之間存在著相關(guān)性，說明這兩種異常改變同時是乳房肥大的發(fā)病因素，且二者存在著某種影響關(guān)系。這一結(jié)果與Tekeuchid等[21]的研究結(jié)果相同。

根據(jù)本課題組已有的研究結(jié)果，在乳房肥大乳腺組織中，雌激素受體[4]、芳香化酶[22]、表皮細胞生長因子[23]、雌激素受體相關(guān)受體[24]等均有表達的異常，但它們之間是否存在聯(lián)系還有待進一步探究。CyclinD1和p16是細胞增殖周期中重要的分子，二者是許多信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，乳房肥大的發(fā)病機制中存在那種信號通路的異常?在遺傳學(xué)方向，肥大乳房的患者是否存在基因的變異，這些基因變異與臨床表現(xiàn)之間有何聯(lián)系?據(jù)已有的研究結(jié)果，在乳腺癌和肥大乳房中均存在CyclinD1的異常表達，但至今還沒有相關(guān)研究明確顯示二者之間有何區(qū)別。這些問題都有待于進一步的探索。

綜上所述，在肥大乳房腺體導(dǎo)管上皮中，CyclinD1蛋白呈高表達，p16蛋白呈低表達，二者的異常變化具有負相關(guān)性，共同參與了肥大乳房的發(fā)生和發(fā)展。本研究在分子水平對乳房肥大的發(fā)病機制進行研究，研究結(jié)果對今后對乳房肥大的新治療方法的研究具有重要的指導(dǎo)意義。但本研究僅僅在蛋白水平測試了CyclinD1和p16的異常，并沒有在基因水平對其進行驗證，需要相關(guān)研究進一步證實。

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[收稿日期]2010-03-26[修回日期]2010-09-10

編輯/張惠娟