生物型人工皮膚及復合bFGF對兔創(chuàng)面愈合的影響

[摘要]目的:探討生物型人工皮膚復合堿性成纖維生長因子對兔創(chuàng)面愈合的影響。 方法:以動物膜組織為基材，經(jīng)環(huán)氧交聯(lián)固定及表面透明質酸修飾制備生物型人工皮膚，復合堿性成纖維生長因子形成生物活性人工皮膚。光鏡觀察生物型人工皮膚的結構，進行物理及生物性能測定水蒸汽透過量、液體吸收量、力學性能及細胞毒性。最后將兩種人工皮膚植入兔全層皮膚創(chuàng)傷模型，觀察術后4周內(nèi)創(chuàng)面愈合情況，進行病理組織學檢查評估創(chuàng)面的修復質量。結果:光鏡下生物型人工皮膚為無細胞的膠原結構。貼附性好，無免疫排斥反應，有一定韌性，水蒸汽透過量:372±45g/(m2×24h)，液體吸收量:269±38%，無細胞毒性。復合少量堿性成纖維生長因子后，明顯促進創(chuàng)面愈合，減少瘢痕形成。結論:生物型人工皮膚復合少量堿性成纖維生長因子使創(chuàng)面快速愈合，可作為燒傷科、整形外科進行皮膚重建的良好替代物。

[關鍵詞]環(huán)氧交聯(lián)固定;生物型人工皮膚;bFGF;創(chuàng)面愈合

[中圖分類號]R332 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)10-1493-04

Effect of biological artificial skin combine basic fibroblast growth factor on rabbit's wound healing

HUANG Jian-yan，ZHONG Xing-xia，ZHAO Neng-yu，XU Bin，Xu Guo-feng

(Tube Membrane Centre，Grandhope Biotech Co.，Ltd.National Engineering Laboratory for Regenerative Medical Implantable Devices，Guangzhou 510663，Guangdong，China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of biological artificial skin combine basic fibroblast growth factor on rabbit's wound healing. Methods The biological skin was prepared by porcine membrane with epoxy cross-linking fixation and surface hyaluronan treatment，and then combined with basic fibroblast growth factor to develop into bioactive artificial skin. Histological observation was conducted，and physical and biological assessments were carried out to detect the moisture vapor transmission rate，liquid absorbability mechanical test and cytotoxicity. The effect of both artificial skins was evaluated by the rabbit's full-thick wound model. The rates of wound healing and pathologic change were observed within 4 weeks postoperation.Results Histological observation showed that biological artificial skin consisted primarily of collagen without cell fragments. It tightly covered on the wounds with good histocompatibility，372±45g/(m2×24h) moisture vapor transmission rate， 269±38% liquid absorbability. When combined with basic fibroblast growth factor，it can significantly accelerate the healing of rabbit wound with fewer scars.ConclusionThe biological artificial skin combine basic fibroblast growth factor can significantly accelerate wound healing，and it would be a promising substitute for the skin reconstruction in department of burn and plastic surgery.

Key words: epoxy cross-linking fixation; biological artificial skin; bFGF; wound healing

早期削痂，及時封閉創(chuàng)面是提高大面積深度燒傷患者成活率最關鍵、最有效的措施之一[1]。但是，迄今為止，尚無一種理想的皮膚替代物。瘢痕增生、攣縮、痛癢、無汗、功能障礙等仍然是大面積深度燒傷削痂創(chuàng)面覆蓋物殘留的主要問題，始終困擾著患者和臨床醫(yī)生。因此，建立一種理想的皮膚替代物，無論是對急性燒傷病人，還是傷后要求皮膚修復重建的病人都有重大作用。

以天然生物材料制造人工皮膚是皮膚替代物研究的發(fā)展趨勢[2]。我們以健康豬的膜材，經(jīng)公司專利技術、環(huán)氧固定及病毒滅活等系列的生化處理(專利US6106555，中國專利998144433)制備成生物型人工皮膚，再復合不同質量的堿性成纖維生長因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)，以期望獲得一種理想的皮膚替代物。植入兔全層創(chuàng)傷模型，通過觀察創(chuàng)面愈合情況及病理形態(tài)學觀察，了解其對皮膚缺損的創(chuàng)面愈合的影響。

1材料和方法

1.1 材料:健康豬的內(nèi)臟膜材由廣州市良種豬場提供。實驗動物為5只雄性新西蘭大白兔，體重2～3kg，由廣州市穗北實驗動物中心提供。bFGF凍干粉(活性單位1×106IU/mg)由于暨南大學生物醫(yī)藥中心贈送。

1.2 生物型人工皮膚與生物活性人工皮膚的制備:新鮮的健康豬腹膜，刮凈修飾，用1‰新潔爾滅溶液4℃浸泡過夜。70%乙醇浸泡1 h，30%乙醇浸泡過夜。用純水反復漂洗去除乙醇，再浸泡于4℃純水至少1h使膜組織中細胞膨脹，然后超聲處理以脫細胞。再用0.1M的聚環(huán)氧丙烷加入NaOH使pH8.5～10.5，室溫下交聯(lián)膜組織1周，每2～3天換液一次，使組織充分交聯(lián)。PBS液充分漂洗以去除殘留的聚環(huán)氧丙烷。將膜組織剪裁成2.5cm×2.5cm大小，表面涂布1%透明質酸鈉，包裝后以Co60照射消毒即制得生物型人工皮膚。

如表面涂布1%透明質酸，再加入不同質量的bFGF，包裝后以Co60照射消毒即制得生物活性人工皮膚。

1.3形態(tài)學觀察:取制備的生物型人工皮膚，常規(guī)石蠟包埋后，4μm厚切片，進行HE染色，光鏡下觀察。

1.4 水蒸汽透過量試驗:按GB/T 12704-91規(guī)定的方法進行。采用透濕杯法，試驗箱溫度控制精度為±0.5℃，相對濕度控制精度為±2%，循環(huán)氣流速度為0.3～0.5m/s。

1.5 液體吸收量:按YY/T 0472.1-2004中附錄C規(guī)定的方法時行。試驗條件:溫度21℃±2℃，濕度60%±15%。

1.6 力學性能測定:將樣品置于RGM-3010型微控電子式拉力試驗機做拉伸試驗，牽引速度為15mm/min，定應力2MPa，溫度25℃，濕度65%。

1.7 細胞毒性實驗

1.7.1 浸提液的制備:浸提液介質為生理鹽水，按樣品質量與浸提液體積比0.2g/ml，在37℃無菌條件下浸提72h，作為材料浸提液。

1.7.2 細胞培養(yǎng)及分組:采用96孔培養(yǎng)板，各組加入5×103/ml L929小鼠成纖維細胞懸液200μl，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育。待細胞貼壁后，分別按照以下分組定期更換培養(yǎng)液(100μl/次):①陰性對照組(n=8)，10% FBS+DMEM細胞培養(yǎng)液;②實驗1組(n=8)，50%材料浸提液;③實驗2組(n=8)，100%材料浸提液;④陽性對照組(n=8)，含0.64%苯酚的10% FBS+DMEM細胞培養(yǎng)液。

1.7.3 MTT法檢測細胞活性:分別于培養(yǎng)24h、48h和72h，按照20μl/孔、加入5mg/ml MTT，37℃、5% CO2下培養(yǎng)4 h;吸出培養(yǎng)液，再加入DMSO 150μl/孔，室溫下振蕩于結晶物溶解，BIO-RAD Mode680酶標儀波長570nm測定OD值，計算細胞增殖率(RGR)=實驗組OD值/陰性對照組OD值×100%。細胞毒性判斷標準:0級為≥100%，1級為75%～99%，2級為50%～74%，3級為25～49%，4級為1～24%，5級為0。

1.8 動物實驗

1.8.1實驗分組:①A組:自然愈合組;②B組:生物型人工皮膚組;③C組:生物活性人工皮膚(含20μg bFGF);④D組:生物活性人工皮膚(含100μg bFGF)。

1.8.2手術過程:兔背部皮膚備皮，全麻成功后，常規(guī)消毒鋪幣，在兔背部皮膚創(chuàng)造4個直徑2cm×2cm大小全層皮膚傷口，A、B、C、D組各占一個傷口。其中B、C、D組用絲線將人工皮膚間斷縫合在傷口周皮膚上(見圖1)。以油紗覆蓋傷口，包扎固定，術畢。

1.8.3術后觀察:術后第3天、1周、2周、3周、4周定期觀察傷口情況，仔細測量傷口大小。術后1周拆線，術后4周將兔處死，取傷口及愈合組織作病理組織學檢查。

1.9 統(tǒng)計學分析:傷口收縮率各組間進行t檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 生物型人工皮膚的外觀及形態(tài)學觀察:生物型人工皮膚外表潔凈、柔軟，淡黃色，表面平整，有“毛面”和“光面”。HE染色光鏡下見膜片由排列有序的膠原纖維組成，無細胞成分存在(圖2)。

2.2 水蒸汽透過量試驗:按標準規(guī)定應不低于300g/(m2×24h)，測試結果為372±45g/(m2×24h)，均符合標準要求。

2.3 液體吸收量:按標準規(guī)定應不低于200%，測試結果為269±38%，均符合標準要求。

2.4 力學性能測定:最大負荷12.82±2.77N(N=8)，抗拉強度1.94±0.42MPa(N=8)。表示材料有一定的韌性。

2.5 細胞毒性實驗:在細胞培養(yǎng)24h、48h、72h的不同時期用倒置顯微鏡觀察，除陽性對照組細胞數(shù)量明顯減少、細胞固縮甚至崩解外，兩實驗組與陰性對照組相似，細胞數(shù)量明顯增加，生長良好。所測OD值見表1，據(jù)此計算RGR。實驗組RGR在24h、48h、72h均大于90%，而陽性對照組的最大RGR在培養(yǎng)48h時出現(xiàn)，為53%。根據(jù)規(guī)定，異種材料細胞毒性分級在0～1級，無細胞毒性，可用作生物材料。

2.6 動物實驗

2.6.1大體觀:術后各組創(chuàng)面逐漸愈合，整個觀察過程無傷口感染，無動物死亡現(xiàn)象。術后1周，各組皮膚傷口干潔，A組傷口油紗緊貼，B、C、D組傷口人工皮膚緊貼(圖3);術后2周，各組創(chuàng)面縮小，A組傷口油紗脫落，B、C、D組傷口人工皮膚仍緊貼;術后3周，各組皮膚傷口明顯縮小，表皮再生，表面有大小不等的血痂，B、C、D組傷口人工皮膚已脫落;術后4周，各組皮膚傷口愈合，各別的還有痂未完全脫落(圖4)。

傷口原始大小為4cm2，測量各組皮膚傷口收縮率如圖5所示，術后3天及1周時，含bFGF的C和D組，傷口收縮較快。術后3周，B、C、D組傷口收縮明顯變小，與A組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.6.2組織學分析:術后4周，各組皮膚組織中央為瘢痕組織，表面的上皮完全再生，呈鱗狀增厚，周邊組織呈完全再生，表皮及附屬結構完整。其中以A組的瘢痕區(qū)域最大，C組的瘢痕區(qū)域最小。D組的皮膚組織血管周圍水腫，有炎性細胞浸潤，瘢痕老化。

3討論

近年各種皮膚替代物在臨床上得到廣泛的應用，在提高大面積深度燒傷治愈率及后遺畸形矯正等方面做出了突出貢獻[3-5]。目前而言，異體皮是一種最理想的皮膚替代物，但卻存在幾方面不容忽視的缺點:首先是來源受限，其次是具有傳播肝炎病毒、HIV的可能，再次是存在排斥問題。另一種臨床上應用較為廣泛的異種(豬)脫細胞真皮基質同樣也存在植入后兩周排斥的問題，并且豬皮質地較硬，在創(chuàng)面的貼附性欠佳[6-7]。

理想的皮膚替代物應具有下有特性:耐用;無抗原性;貼附性好，適合于不規(guī)則傷口表面;彈性好;保水性好;防止細菌入侵;促進愈合[8-9]。

本實驗中，我們采用高反應活性環(huán)氧化物交聯(lián)處理動物的膜組織，反應條件溫和，聚環(huán)氧丙烷可以蛋白質分子形成穩(wěn)定的交聯(lián)鍵，大大提高材料的穩(wěn)定性，并且由于水溶性好使其容易從樣品中清除，無殘留毒性。而傳統(tǒng)的戊二醛固定動物組織技術會遺留細胞毒性的問題[10]，相比之下，環(huán)氧固定技術明顯優(yōu)越。

透明質酸本身是人體皮膚的構成之一，是人體內(nèi)分布最廣的一種酸性黏多糖，存在于結締組織的基質中，具有良好的保濕作用，也是皮膚無瘢痕愈合的成分之一。文獻表明其在中性環(huán)境下帶負電荷[11]，應用該特性，將其復合帶正電荷的bFGF，可以保護bFGF的生物活性。

本實驗結果表明，生物型人工皮膚的HE染色光鏡下為紅染膠原組織，無細胞成分，證明材料脫細胞完全。水蒸汽透過量、液體吸收量均達標準要求，力學測試結果也表明材料有一定的韌性，并且無細胞毒性，證明該技術處理的異種材料達到臨床使用的要求。在兔全層皮膚創(chuàng)傷模型中，生物型人工皮膚在兔的創(chuàng)面不產(chǎn)生免疫排斥或炎癥反應，可以有效地保護創(chuàng)面，與創(chuàng)面緊密粘合，促進上皮細胞的生長，縮短創(chuàng)面愈合時間，減少瘢痕形成，待創(chuàng)面愈合后人工皮膚干結自然脫落。加入bFGF，在傷口愈合的早期，可以使傷口較快的收縮及上皮化。但大量的bFGF，產(chǎn)生炎癥趨化作用，使血管周圍的炎癥反應增加，瘢痕老化。本實驗中，含少量bFGF的生物活性人工皮膚(含20μg bFGF)，可以使創(chuàng)面快速愈合，再生的皮膚瘢痕組織少。

由以上實驗結果我們可得出，生物型人工皮膚在臨床應用中在以下幾方面將獲得良好的效果:①應用其良好的透汽性和保水性，早期用生物型人工皮膚覆蓋創(chuàng)面，減少機體水分丟失，醫(yī)生可專注于救生命;②質地柔軟，一側“毛面”使其具有良好的貼附性，可使人工皮膚在胸部(因呼吸運動)、關節(jié)(彎曲、不規(guī)則、活動)等不易固定的部位仍能與創(chuàng)面貼附緊密，應用范圍廣;③無免疫排斥性，可以減少由排斥反應所造成的二次創(chuàng)傷;④復合少量的bFGF的生物活性人工皮膚，應用于皮膚慢性潰瘍、深度燒傷或者各種原因造成的皮膚缺損時，縮短創(chuàng)面愈合時間，減少瘢痕形成，待創(chuàng)面愈合后人工皮膚干結自然脫落，不產(chǎn)生“占位”現(xiàn)象。以上均顯示了該型人工皮膚明顯優(yōu)越于現(xiàn)在臨床上廣泛應用的異種或異體皮脫細胞基質。

綜上所述，采用高反應活性環(huán)氧化物交聯(lián)處理動物的膜組織，透明質酸進行表面修飾，形成一種組成和結構與人的皮膚相似的新型人工皮膚。本研制的生物活性人工皮膚柔軟性好，耐用，一次覆蓋能達到完全愈合。展示了其良好的應用前景，可作為燒傷科、整形外科進行皮膚重建的良好替代物。

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[收稿日期]2010-06-16 [修回日期]2010-09-08

編輯/張惠娟