現(xiàn)代全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用

【作 者】高楓

北京積水潭醫(yī)院器械科，北京，100035

1 血細(xì)胞分析儀的發(fā)展歷史

血細(xì)胞分析儀的發(fā)展已有50年的歷史了。國(guó)內(nèi)醫(yī)院應(yīng)用血細(xì)胞分析儀對(duì)血常規(guī)進(jìn)行檢測(cè)也基本上普及了。提供更加方便適用、更多功能和參數(shù)、更加準(zhǔn)確、更快速度的血細(xì)胞分析儀，已經(jīng)是各設(shè)備生產(chǎn)商的目標(biāo)。

電子血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀自50年代Coulter發(fā)明阻抗式計(jì)數(shù)儀后，邁出了白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）自動(dòng)計(jì)數(shù)應(yīng)用于臨床的第一步。1976年，Coulter-D及其4A/7A分離式與流動(dòng)式血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的出現(xiàn)，使WBC、RBC和血小板（PLT）計(jì)數(shù)全自動(dòng)化。同時(shí)，各種單一技術(shù)型的血細(xì)胞分類(lèi)儀不斷涌現(xiàn)，如檢測(cè)細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)的Hemalog D和 Hemalog D-90，基于細(xì)胞圖象識(shí)別的Hemetrak等。1984年，出現(xiàn)了Technicon H、Sysmex NE-8000和Coulter-S4型血液分析儀器，使CBC及DC開(kāi)始全自動(dòng)化。80年代后期，Technicon H、Sysmex NE-8000和Coulter-VCS實(shí)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)。流式細(xì)胞儀（Flow Cytometry）的制成，使血細(xì)胞自動(dòng)分析儀的參數(shù)更趨完善、準(zhǔn)確和特異性，而且功能和作用不斷增加，為血液研究提供了更多途徑。

2 現(xiàn)代血液分析儀的發(fā)展特點(diǎn)

(1)血液分析儀的多參數(shù)化

近年來(lái)，許多血細(xì)胞分析儀都在不斷增加新的參數(shù)，以滿(mǎn)足臨床在診療和鑒別診斷方面的需求。最初的血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀僅僅能夠計(jì)數(shù)紅細(xì)胞和白細(xì)胞，后來(lái)又有了血紅蛋白（HGB）、血小板(PLT)、紅細(xì)胞壓積（HCT）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）等幾個(gè)參數(shù)。在發(fā)展成為血細(xì)胞分析儀后，又增加了許多分析和計(jì)算參數(shù)，如白細(xì)胞三分群、白細(xì)胞五分群、血紅蛋白濃度分布寬度、異常淋巴細(xì)胞提示和幼稚細(xì)胞提示等。有些儀器甚至可以提供40-50種測(cè)量或計(jì)算參數(shù)。

(2)血液分析儀的多功能合成擴(kuò)展

血細(xì)胞分析儀已經(jīng)不僅僅局限在進(jìn)行常規(guī)血細(xì)胞的分析，近年來(lái)它增加了許多擴(kuò)展的功能。例如將網(wǎng)織紅細(xì)胞（RET）的計(jì)數(shù)和分析功能加入其中，增加了幼稚細(xì)胞分析和有核紅細(xì)胞分析的功能，甚至對(duì)血液細(xì)胞中的某些寄生蟲(chóng)進(jìn)行提示等。更有一些儀器把流式細(xì)胞分析儀的某些功能合并到血細(xì)胞分析儀上，這樣在進(jìn)行常規(guī)血細(xì)胞分析時(shí)就可以得到某些淋巴細(xì)胞亞群的分析結(jié)果。

(3)血細(xì)胞檢測(cè)方法的改進(jìn)和發(fā)展

為了做到更加準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)和分析、更多的測(cè)定和分析參數(shù)，血細(xì)胞測(cè)定和分析的方法已經(jīng)不局限于某一種單一的方法，如傳統(tǒng)的電阻抗法或后來(lái)應(yīng)用的激光散射法，還加了多項(xiàng)技術(shù)的相互聯(lián)合應(yīng)用。這我們將在下面作重點(diǎn)介紹。

(4)血球分析儀檢測(cè)速度的提高

許多儀器由于增加了自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，測(cè)定速度加快，一般可以達(dá)到每小時(shí)80-100個(gè)樣本。在不包含網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測(cè)的情況下，Coulter CEN-S System 2型每小時(shí)可測(cè)定105個(gè)標(biāo)本；Bayer ADVIA 120每小時(shí)測(cè)定120個(gè)標(biāo)本。這些儀器都可以在自動(dòng)成批進(jìn)樣的同時(shí)，隨即插入急診檢驗(yàn)的標(biāo)本。

(5)應(yīng)用的方便性

對(duì)于操作者來(lái)說(shuō)，儀器最大的優(yōu)越性還應(yīng)該體現(xiàn)在操作的方便性和靈活性上。例如，儀器可以使用靜脈血或末梢血；可以采用全自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，也可使用單獨(dú)閉蓋或開(kāi)蓋取樣系統(tǒng)；對(duì)項(xiàng)目可做適當(dāng)?shù)慕M合，如可以選擇CBC方式：CBC+DIFF 、RET方式；條碼應(yīng)用給標(biāo)本編號(hào)提供了方便，儀器通過(guò)自動(dòng)掃描條碼鑒別標(biāo)本的來(lái)源，為檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的電子化提供了極大方便，也減少了編號(hào)帶來(lái)的差錯(cuò)。

3 血細(xì)胞分析儀檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用

血細(xì)胞分析儀不同的檢測(cè)原理，主要是為了滿(mǎn)足白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)的需要。最早使用的電阻抗原理，只能檢測(cè)出血細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞的3分類(lèi)結(jié)果。而今天高檔的血球分析儀，已將多項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合用于對(duì)血細(xì)胞的檢測(cè)，通過(guò)綜合分析檢測(cè)數(shù)據(jù)，得出更為準(zhǔn)確的血細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞五項(xiàng)分類(lèi)結(jié)果，同時(shí)可提供較多的提示信息，便于操作人員有重點(diǎn)、有目的地對(duì)有問(wèn)題的標(biāo)本進(jìn)行顯微鏡復(fù)檢?，F(xiàn)將有代表性的主要幾種普遍使用的血細(xì)胞檢測(cè)方法介紹如下。

3.1 白細(xì)胞分類(lèi)檢測(cè)技術(shù)

3.1.1 VSC（體積、電導(dǎo)、光散射）檢測(cè)原理

VSC技術(shù)可使血細(xì)胞未經(jīng)任何處理,在與體內(nèi)形態(tài)完全相同的自然狀態(tài)下得出檢測(cè)結(jié)果。首先，標(biāo)本內(nèi)加入只作用于紅細(xì)胞的溶血?jiǎng)┦辜t細(xì)胞溶解；然后，加入抗溶血?jiǎng)┢鹬泻颓叭苎獎(jiǎng)┑淖饔茫拱准?xì)胞表面、胞質(zhì)及細(xì)胞大小等特征仍然保持與體內(nèi)相同的狀態(tài)；最后，使溶血后制體內(nèi)剩余的白細(xì)胞單個(gè)通過(guò)檢測(cè)器，接受VSC三種技術(shù)的同時(shí)檢測(cè)。為什么要采用鞘流技術(shù)，主要是因?yàn)槟艽蠓岣弑O(jiān)測(cè)精度，能夠從物理上最大限度的減少細(xì)胞的重合現(xiàn)象。當(dāng)檢測(cè)孔感應(yīng)區(qū)內(nèi)同時(shí)存在2個(gè)以上細(xì)胞同時(shí)經(jīng)過(guò)檢測(cè)孔時(shí)，細(xì)胞1和細(xì)胞2的信號(hào)作為一個(gè)大脈沖信號(hào)被檢出，其結(jié)果為這兩個(gè)細(xì)胞被視為一個(gè)細(xì)胞，產(chǎn)生漏計(jì)想象。細(xì)胞濃度越高，漏計(jì)數(shù)也越多，所以開(kāi)發(fā)出了鞘流法。鞘流技術(shù)可用于兩種細(xì)胞計(jì)數(shù)原理：一種為電阻抗原理，鞘流通過(guò)小孔的敏感區(qū)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；另一種為激光計(jì)數(shù)原理，細(xì)胞液流室較長(zhǎng)，與激光束垂直相交，激光光束對(duì)流經(jīng)的每個(gè)細(xì)胞照射后產(chǎn)生散射進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

① Volume（體積）檢測(cè)技術(shù) 使用電阻抗原理，對(duì)細(xì)胞的體積進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)體積大小來(lái)區(qū)分不同的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入小孔管時(shí)，產(chǎn)生的脈沖峰的大小依細(xì)胞體積而定，脈沖的數(shù)量決定于細(xì)胞的數(shù)量。但是小淋巴細(xì)胞與成熟的嗜酸性粒細(xì)胞大小相似，未成熟的淋巴細(xì)胞和成熟的嗜中性粒細(xì)胞體積相似，因此，僅用體積檢測(cè)法還不能準(zhǔn)確地進(jìn)行白細(xì)胞分類(lèi)。

② Conductivity（電導(dǎo)）檢測(cè)技術(shù) 根據(jù)細(xì)胞壁能產(chǎn)生高頻電流的性能，使用高頻電磁探針測(cè)量細(xì)胞核與胞漿的比例、細(xì)胞內(nèi)顆粒的大小和密度，來(lái)區(qū)分不同類(lèi)型的細(xì)胞。因此，可用電導(dǎo)性來(lái)區(qū)分體積相同而性質(zhì)完全不同的兩個(gè)細(xì)胞群，如小淋巴細(xì)胞與嗜堿細(xì)胞（體積相似）。當(dāng)高頻電流通過(guò)這兩種細(xì)胞時(shí)，由于兩者的核漿比例不同而表現(xiàn)出不同的信號(hào)，據(jù)此而將兩種細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。

③Scatter檢測(cè)技術(shù) 不同的細(xì)胞被激光照射后對(duì)激光的散射量是不同的。光散射對(duì)細(xì)胞顆粒的構(gòu)型和質(zhì)量有較強(qiáng)的鑒別能力，細(xì)胞粗顆粒的光散射比細(xì)顆粒的光散射更強(qiáng)。入射到細(xì)胞上的激光首先在細(xì)胞表面產(chǎn)生散射，由此獲得有關(guān)細(xì)胞大小的信息，而入射到細(xì)胞內(nèi)部的顆粒和核上產(chǎn)生散射，由此獲得有關(guān)細(xì)胞內(nèi)部的信息。通常，散射角度越低，所含有關(guān)細(xì)胞大小的信息越多，散射角度越高，所含細(xì)胞內(nèi)部的信息越多。所以，如果從一個(gè)細(xì)胞能夠同時(shí)檢測(cè)出低角度散射光和高角度散射光，則可從兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)得到散點(diǎn)圖。根據(jù)光散射的量可將嗜酸嗜堿及中性粒細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。

根據(jù)以上三種檢測(cè)技術(shù)所得的數(shù)據(jù)，經(jīng)儀器內(nèi)部的計(jì)算機(jī)處理后得出細(xì)胞分布的散點(diǎn)圖，可從圖中觀察細(xì)胞的群落。

3.1.2 阻抗與射頻技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)原理

使用該原理的儀器（如SE-900）是通過(guò)幾個(gè)檢測(cè)通道對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)計(jì)數(shù)的。

（1）嗜酸檢測(cè)通道 通過(guò)分血器樣本進(jìn)入嗜酸通道，血液與特異性嗜酸溶血?jiǎng)┗旌?，由于其特殊的PH,使得除嗜酸以外的細(xì)胞溶解或皺縮，只有嗜酸性粒細(xì)胞保持原狀。此類(lèi)細(xì)胞可使用直流電阻抗原理進(jìn)行檢測(cè)。

（2）嗜堿檢測(cè)通道 計(jì)數(shù)原理與嗜酸通道原理一樣。由于堿性的溶血?jiǎng)┲兄荒鼙Ａ粞褐械氖葔A性粒細(xì)胞，因此根據(jù)脈沖的多少即可求得嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)。上述兩種方法除需使用專(zhuān)一的溶血?jiǎng)┩?，還需特定的作用溫度和時(shí)間。

（3）DIFF（分類(lèi)）檢測(cè)通道 該通道同時(shí)使用直流電阻阻抗原理和射頻檢測(cè)原理聯(lián)合對(duì)WBC進(jìn)行檢測(cè)。DC（直流電阻抗）技術(shù)可測(cè)定細(xì)胞的大小，但無(wú)法穿透細(xì)胞漿；射頻檢測(cè)技術(shù)可透入細(xì)胞內(nèi)，對(duì)細(xì)胞核的大小和顆粒的多少進(jìn)行測(cè)定。溶血?jiǎng)⒓t細(xì)胞破壞，但對(duì)白細(xì)胞作用較輕；溶血?jiǎng)┐┩讣?xì)胞膜，僅使少量的胞漿溢出，對(duì)核皺縮作用也較輕微，細(xì)胞形態(tài)改變不大。在小孔的內(nèi)外電極上存有直流和高頻兩個(gè)發(fā)射器，由于直流電不能透過(guò)細(xì)胞漿，僅能測(cè)量細(xì)胞的大小，而射頻可透入細(xì)胞內(nèi)，測(cè)量核的大小及顆粒的多少。因此，細(xì)胞進(jìn)入小孔時(shí)產(chǎn)生兩個(gè)不同的脈沖信號(hào)，脈沖的高低分別代表細(xì)胞的大小和核及顆粒的密度，以DC 信號(hào)為橫坐標(biāo)，RF為縱坐標(biāo)，就可根據(jù)兩個(gè)信號(hào)作為一個(gè)細(xì)胞定位于二維的細(xì)胞散點(diǎn)圖上。由于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及粒細(xì)胞的細(xì)胞大小、細(xì)胞漿含量、漿內(nèi)顆粒的大小與密度、細(xì)胞核的形態(tài)與密度不同，DC與RF的脈沖信號(hào)有較大的差異，定位在各自散射的區(qū)域，通過(guò)掃描技術(shù)得出各類(lèi)細(xì)胞的比例。

（4）幼稚細(xì)胞檢測(cè)通道 由于幼稚細(xì)胞胞膜上的脂質(zhì)較成熟細(xì)胞少，在細(xì)胞懸液中加入硫化氨基酸后，結(jié)合在幼稚細(xì)胞膜上的氨基酸較成熟細(xì)胞多，且對(duì)溶血?jiǎng)┯械挚棺饔谩Ｔ诩尤肴苎獎(jiǎng)┖?，成熟?xì)胞被溶解，如果細(xì)胞懸液中有幼稚細(xì)胞時(shí)，其形態(tài)不被破壞，可通過(guò)DC/RF原理進(jìn)行檢測(cè)。

3.1.3 MAPSS(多角度偏振光散射白細(xì)胞分類(lèi))檢測(cè)原理

儀器（如ABBOTT型CD-3500型）應(yīng)用鞘流原理，用鞘流液按適當(dāng)比例稀釋?zhuān)准?xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)近似自然狀態(tài)。由于嗜堿性粒細(xì)胞顆粒具有吸濕特性，結(jié)構(gòu)有輕微改變。紅細(xì)胞內(nèi)部的滲透壓高于鞘液的滲透壓，血紅蛋白從細(xì)胞內(nèi)游離出來(lái)，鞘液內(nèi)的水分進(jìn)入紅細(xì)胞中，而細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)仍然完整。由于此時(shí)紅細(xì)胞折光指數(shù)與鞘液相同，紅細(xì)胞不干擾白細(xì)胞的檢測(cè)，白細(xì)胞呈單行排列通過(guò)激光檢測(cè)區(qū)，在各個(gè)方向都有其散射光。MAPSS原理從四個(gè)角度檢測(cè)散射光的強(qiáng)度， ① 0o，前角光散射，用于檢測(cè)細(xì)胞的大??；② 10o，狹角光散射，用于對(duì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度；③90o，垂直光散射，用于對(duì)細(xì)胞的核分葉情況進(jìn)行檢測(cè)；④90oD，消偏振光散射，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)的顆?？蓪⒋怪苯嵌鹊钠窆庀竦奶匦?，通過(guò)檢測(cè)90oD與90o散射光的強(qiáng)度，將嗜酸從中性粒和其他細(xì)胞中分離出來(lái)。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)將數(shù)據(jù)進(jìn)行儲(chǔ)存和分析，將WBC分成5群。

3.1.4 光散射與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)聯(lián)合法

使用該原理的儀器（如Bayer120）采用激光散射和過(guò)氧化物酶染色技術(shù)對(duì)WBC進(jìn)行5分類(lèi)。

（1）過(guò)氧化物酶檢測(cè)通道 嗜酸性粒細(xì)胞有很強(qiáng)的過(guò)氧化氫酶活性，中性粒細(xì)胞有較強(qiáng)過(guò)氧化氫酶，單核細(xì)胞次之，而淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞無(wú)此酶。如果將血液經(jīng)過(guò)過(guò)氧化物酶染色，胞漿內(nèi)即可出現(xiàn)不同的酶化學(xué)反應(yīng)。經(jīng)過(guò)含有清洗劑和甲醛的高滲液中的孵育，清洗劑使細(xì)胞破壞，甲醛使WBC內(nèi)的酶被固定。然后，加入染液（H2O2和4-氯-萘酚）并加熱，使得細(xì)胞內(nèi)含有的過(guò)氧化物酶分解并現(xiàn)色沉積定位與酶的反應(yīng)部位。當(dāng)細(xì)胞通過(guò)檢測(cè)區(qū)時(shí)，根據(jù)酶反應(yīng)強(qiáng)度（陰性、弱陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性）和細(xì)胞體積的差異，以及細(xì)胞被激光照射后光散射強(qiáng)度的差異，對(duì)不同類(lèi)型的WBC進(jìn)行區(qū)分。以吸光率的強(qiáng)度（酶反應(yīng)強(qiáng)度）為橫軸，光散射強(qiáng)度（細(xì)胞體積）為縱軸，將每個(gè)被檢測(cè)細(xì)胞的分布情況表示于散點(diǎn)圖上。

（2）嗜堿性粒細(xì)胞/分葉核檢測(cè)通道 該通道用于嗜堿細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞核分葉程度的分析。分析過(guò)中RBC/Platelet檢測(cè)使用共同的通道，但在不同的時(shí)段檢測(cè)。檢測(cè)前，酸性表面活性劑作用于血細(xì)胞，將RBC溶解，除嗜堿細(xì)胞外，其他類(lèi)型的WBC也被破壞，致使胞漿溢出，僅剩裸核。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入檢測(cè)通道時(shí)，根據(jù)激光照射細(xì)胞產(chǎn)生的前向角和散射角的變化以及不同的裸核結(jié)構(gòu)可將嗜堿細(xì)胞從WBC中區(qū)分出來(lái)。

3.1.5 熒光染色流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法只需要很少的樣品就可對(duì)這些細(xì)胞和粒子進(jìn)行檢測(cè)。一個(gè)血液樣品經(jīng)過(guò)吸液和定量、稀釋至指定的稀釋比，并進(jìn)行染色，然后將該樣品送入流動(dòng)池中。檢測(cè)中使用的鞘流裝置改進(jìn)了細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)行。同時(shí)，由于血細(xì)胞顆粒成行通過(guò)該流動(dòng)池中心，故而防止產(chǎn)生異常血液脈沖并可減小流動(dòng)池的污染。一個(gè)半導(dǎo)體激光束通過(guò)該流動(dòng)池照射到血細(xì)胞上，前向散射光由光電二極管接受，側(cè)面的散射光和側(cè)面的熒光則由光電倍增管（PMT）接收。光信號(hào)被轉(zhuǎn)化為電脈沖，從而可以得到有關(guān)血液細(xì)胞的信息。如圖1所示。

圖1 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)Fig.1 Counting of streaming cells

（1）前向散射光和側(cè)向散射光 當(dāng)光通路中存在諸如粒子之類(lèi)的障礙物時(shí)，該光束就在每個(gè)障礙物的不同方向上產(chǎn)生散射光。通過(guò)檢測(cè)散射光，可以得到有關(guān)細(xì)胞體積大小和材質(zhì)的信息。與此相似，當(dāng)一束激光照射到血細(xì)胞顆粒上時(shí)就產(chǎn)生光散射，其強(qiáng)度取決于顆粒直徑和觀察角度這樣的因素。對(duì)前向散射光進(jìn)行檢測(cè)，提供有關(guān)血液細(xì)胞體積大小的信息；同時(shí)對(duì)側(cè)向散射光進(jìn)行檢測(cè)，提供有關(guān)細(xì)胞內(nèi)部（如細(xì)胞核的體積大小）的信息如圖2所示。

圖2 前向和側(cè)向散射光，提供細(xì)胞大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的信息Feg.2 Forward and side scattered light,which can provide information about cell size and internal structure

圖3 熒光染色流式細(xì)胞Fig.3 Fluorescence staining cells

（2）側(cè)向熒光 熒光信號(hào)是由熒光染料受激發(fā)后發(fā)出的。以特異性的熒光染料對(duì)細(xì)胞的特定成分染色后，定量測(cè)量細(xì)胞所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，就可以確定細(xì)胞中的特定成分的含量。經(jīng)染色后的細(xì)胞在激光束的照射下，熒光染料吸收能量能級(jí)躍遷，再短暫的延遲后返回基態(tài)并發(fā)出熒光。由于熒光波長(zhǎng)比散射光長(zhǎng)，因此，可以利用特定波長(zhǎng)的雙色性反射鏡盒帶通濾光片將同一方向上的測(cè)向散射光與熒光區(qū)分開(kāi)。隨著染色集團(tuán)濃度的增加，熒光強(qiáng)度也增加，通過(guò)測(cè)量熒光強(qiáng)度，可以得到有關(guān)血細(xì)胞染色的信息，如圖4所示。熒光向所有方向輻射，不同廠(chǎng)家不同型號(hào)的儀器選擇不同方向熒光進(jìn)行檢測(cè)，如圖3所示。

圖4 熒光和側(cè)向散射光提供細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和核酸多少的信息Fig.4 Fluorescence and side scattered light to provide the internal structure of cells and the number of nucleic acids

例如，在4 DIFF通道檢測(cè)時(shí)，特殊溶血素將紅細(xì)胞及血小板破壞，并在WBCs膜上打出小孔，染料進(jìn)入破損的WBCs并與核酸結(jié)合（RNA/DNA）。正常情況下，白細(xì)胞除嗜堿性粒細(xì)胞外，分為中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。當(dāng)出現(xiàn)異常細(xì)胞時(shí)，由于各類(lèi)細(xì)胞的核型不同，胞漿內(nèi)DNA/RNA的含量不同，因此在分類(lèi)散點(diǎn)圖所占的位置就不同，如圖5所示。其他參數(shù)，如BASO、RET和IMI等在其相應(yīng)的檢測(cè)通道中進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)不同的試劑作用選用不同的檢測(cè)參數(shù)，最終確定其檢測(cè)值。

圖5 DIFF散點(diǎn)圖Fig.5 DIFF Scatter gram

3.2 RBC/PLT的測(cè)定

3.2.1 鞘流DC檢測(cè)方法

對(duì)RBC/PLT檢測(cè)大部分采用鞘流DC檢測(cè)的方法。所謂DC就是經(jīng)典的小孔電阻阻抗法，又名庫(kù)爾特原理。血細(xì)胞是相對(duì)于電解質(zhì)溶液的不良導(dǎo)體，當(dāng)其懸浮于溶液中通過(guò)檢測(cè)微孔時(shí)，改變了微孔內(nèi)外兩側(cè)電極之間原來(lái)恒定的低頻電流，其瞬間引起微孔電壓的變化而形成電壓脈沖。脈沖的數(shù)量代表了通過(guò)微孔的細(xì)胞數(shù)量，脈沖的振幅高低表示細(xì)胞的體積。鞘流法是指在檢測(cè)器內(nèi)，樣品噴嘴定位在孔的前面且與中心對(duì)齊，將稀釋后的樣品由噴嘴推入錐形室后，由前鞘流內(nèi)的試劑包裹通過(guò)小孔的中心。通過(guò)小孔以后，經(jīng)過(guò)稀釋的樣品由后鞘流中的試劑包裹送入捕集管中。這樣，可以防止該區(qū)域的血細(xì)胞回流，并防止產(chǎn)生假性血小板脈沖。鞘流方法改善了血液計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。同時(shí)由于血細(xì)胞通過(guò)在一條直線(xiàn)上的小孔，所以也可以防止產(chǎn)生異常血細(xì)胞脈沖，如圖6所示。

圖6 鞘流法Feg.6 Sheath flow

體積不同的紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板，其產(chǎn)生的脈沖幅度也不同，排列順序以白細(xì)胞最大，紅細(xì)胞次之，血小板最小。在計(jì)數(shù)紅白細(xì)胞時(shí)，可利用一個(gè)幅度鑒別電路將血小板篩選出去。這個(gè)鑒別電路叫閾值選擇電路。紅細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)由于正常人體外周血紅細(xì)胞的數(shù)目為白細(xì)胞的1000倍左右，所以選擇相應(yīng)的閾值時(shí)，白細(xì)胞產(chǎn)生的脈沖可以完全忽略，紅白細(xì)胞總數(shù)可視為紅細(xì)胞數(shù)。選擇相應(yīng)的血小板閾值電壓,去掉血小板的干擾信號(hào),并計(jì)數(shù)紅白血細(xì)胞和血小板的總數(shù)。最后，從總數(shù)中減去紅白細(xì)胞數(shù),即為血小板數(shù)。

3.2.2 流式細(xì)胞檢測(cè)法

有些儀器采用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)測(cè)定紅細(xì)胞及血小板，如 BAYER120系統(tǒng)。將血樣通過(guò)分血閥引入RBC/PLT反應(yīng)池中，加入試劑將紅細(xì)胞不規(guī)則的形狀變?yōu)楣潭ǖ那蛐危瑥亩?xì)胞形態(tài)對(duì)體積測(cè)定的影響。當(dāng)通過(guò)流動(dòng)室時(shí)，激光照射在每一個(gè)細(xì)胞上產(chǎn)生的低角度（2o-3o）與高角度（5o-15o）的散射光分別得到紅細(xì)胞的體積與血紅蛋白的濃度信息。檢測(cè)到的低角度散射光被放大30倍得到血小板的體積信號(hào)；檢測(cè)到的高角度散射光被放大12倍，得到血小板的折射信號(hào)，通過(guò)這些信號(hào)血小板被確定。其中得到的血紅蛋白值,可以與儀器所采用的經(jīng)典血紅蛋白測(cè)定值進(jìn)行對(duì)比參考,對(duì)特殊病例樣本的血紅蛋白值的檢測(cè)提供了更多的研究參數(shù)。

3.3 HGB的測(cè)定

用于自動(dòng)測(cè)量血紅蛋白的主要化學(xué)方法，為氰化高鐵血紅蛋白方法和氧化血紅蛋白方法。

氰化高鐵血紅蛋白測(cè)定方法，是1966年由國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（ICSH）作為一種國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法而提出的。由于該方法使用了氰化物，作為試劑它們是有毒的，所以必須對(duì)廢液進(jìn)行處理，從而從環(huán)保的角度來(lái)講，該方法存在缺陷。

氧化血紅蛋白測(cè)定方法的血紅蛋白轉(zhuǎn)化速度很快，因?yàn)檠t蛋白很容易轉(zhuǎn)化為氧化血紅蛋白。同時(shí)由于該方法不使用諸如氰化物這樣的毒性物質(zhì)，所以該方法比較環(huán)保。但有研究稱(chēng)，該方法卻不能將高鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)化為氧化血紅蛋白。對(duì)于正常人體血液這并沒(méi)有問(wèn)題，但是對(duì)于含有大量高鐵血紅蛋白的樣品如控制血液樣品，就會(huì)導(dǎo)致測(cè)量值低于真實(shí)值，所以同樣存在缺陷。

在儀器中實(shí)現(xiàn)對(duì)血紅蛋的測(cè)定通常采用的是比色法測(cè)定。它是利用溶血?jiǎng)⑾♂尩难褐械募t細(xì)胞破壞，血紅蛋白便溶解出來(lái)，在加入轉(zhuǎn)化試劑進(jìn)而轉(zhuǎn)化為顏色穩(wěn)定的氰化血紅蛋白。血紅蛋白的含量越高，它的顏色就越深，透光性就越差（或吸光性越強(qiáng)）。用光電器件檢測(cè)透射光強(qiáng)度，并與已定標(biāo)的血紅蛋白值相比較，即可得出血紅蛋白含量。常用的光路系統(tǒng)為了防止光散射和外來(lái)光干擾，均采用雙波長(zhǎng)法（通常為540 nm及690 nm）測(cè)量。當(dāng)然也有采用激光法測(cè)定血紅蛋白的，如紅細(xì)胞測(cè)定部分所提到的，利用激光照射在紅細(xì)胞上時(shí)所得到的不同角度散射光，從而得到紅細(xì)胞內(nèi)部血紅蛋白濃度的信息，得到血紅蛋白值。但用此方法得到的血紅蛋白值也多用于對(duì)傳統(tǒng)比色法的血紅蛋白值進(jìn)行比較參考，而很少作為最終的報(bào)告結(jié)果。

3.4 網(wǎng)織細(xì)胞及幼稚細(xì)胞等特殊細(xì)胞的檢測(cè)：

3.4.1 網(wǎng)織細(xì)胞的檢測(cè)

現(xiàn)在大部分儀器都采用熒光染色流式細(xì)胞檢測(cè)方法對(duì)網(wǎng)織細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，如SYSMEX-2100及BAYER120等儀器。通常此檢測(cè)占用儀器的一個(gè)檢測(cè)通道，加入特殊試劑，使紅細(xì)胞、白細(xì)胞的體積膨脹，同時(shí)使細(xì)胞膜輕微受損，便以染液進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)染液進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，其中的熒光染料對(duì)細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA進(jìn)行染色。成熟紅細(xì)胞與網(wǎng)織紅細(xì)胞胞漿內(nèi)的RNA含量不同而被區(qū)分，網(wǎng)織紅細(xì)胞與白細(xì)胞因胞漿內(nèi)的DNA和RNA含量不同而被區(qū)分。另外，由于血小板也有一定的熒光強(qiáng)度，因此也可以與小紅細(xì)胞及紅細(xì)胞碎片區(qū)分，得到光學(xué)法測(cè)定的血小板值。

3.4.2 NRBC的檢測(cè)

對(duì)于有核紅細(xì)胞的檢測(cè)，也是采用熒光染色流式細(xì)胞檢測(cè)。試劑將成熟的紅細(xì)胞破碎，有核紅細(xì)胞的核裸露，同時(shí)在白細(xì)胞上打孔，染液進(jìn)入白細(xì)胞內(nèi)對(duì)核酸（核膜）進(jìn)行染色。由于嗜堿性的有核紅細(xì)胞相比其他的紅細(xì)胞有較高的熒光強(qiáng)度，而白細(xì)胞的熒光強(qiáng)度大于有核紅細(xì)胞，根據(jù)體積及熒光強(qiáng)度的大小將有核紅細(xì)胞區(qū)分出來(lái)。試劑反應(yīng)過(guò)程及作用如圖7所示。

圖7 NRBC試劑作用示意圖Fig.7 NRBC Reagents diagram

3.4.3 IMI細(xì)胞的檢測(cè)

SYSMEX-2100是采用RF/DC檢測(cè)法，在其單獨(dú)通道中利用成熟粒細(xì)胞胞膜表面含較多量的脂質(zhì)及少量的蛋白質(zhì)而幼稚粒細(xì)胞膜表面則相反的原理進(jìn)行檢測(cè)的。檢測(cè)時(shí)，加入相應(yīng)試劑破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致成熟粒細(xì)胞膜破壞而幼稚粒細(xì)胞膜部分受損，從而使燃料進(jìn)入與細(xì)胞內(nèi)容物相結(jié)合，不同的幼稚粒細(xì)胞對(duì)試劑的作用有所不同。用直流電阻抗法測(cè)定細(xì)胞的大小，而射頻則透入細(xì)胞內(nèi)測(cè)量細(xì)胞核的大小及核與胞漿的密度，因而在以射頻信號(hào)為縱軸，直流信號(hào)為橫軸IMI散點(diǎn)圖上，不同細(xì)胞體積和核的密度及大小的細(xì)胞占據(jù)的位置不同。通過(guò)直流電阻的變化測(cè)定血細(xì)胞的大小，而由射頻電阻的變化檢測(cè)血細(xì)胞內(nèi)的密度（細(xì)胞核的大小與其它信息），從而得到各種相關(guān)檢測(cè)數(shù)據(jù)，將幼稚粒細(xì)胞進(jìn)行辨別。

4 結(jié)束語(yǔ)

以上我們?cè)敿?xì)地介紹了現(xiàn)今血球分析儀中主要應(yīng)用的檢測(cè)方法。隨著現(xiàn)代科技日新月異的變化，越來(lái)越多的新技術(shù)在不斷的應(yīng)用于血細(xì)胞的檢測(cè)中。期盼不斷地完善和提高檢測(cè)精度和速度，使血細(xì)胞檢測(cè)能夠?yàn)榕R床提供更多的參考指標(biāo)，區(qū)分出更多的細(xì)胞類(lèi)型，為臨床診斷提供更有力的支持和幫助。

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