阿法骨化醇對SD大鼠骨合成的影響

劉曉青，田曉艷，R.B.Setterberg，Webster S.S.Jee

自1922年美國著名的生物化學家Elmer Mc-Collum發(fā)現(xiàn)vitamin D(Vit D)以來，Vit D及其類似物已用于多種骨代謝性的疾病如佝僂病(rickets)、骨軟化癥(osteomalacia)、腎性骨營養(yǎng)不良等;Vit D缺乏也是導致老年人骨質(zhì)疏松癥的重要危險因素。Vit D及其類似物對與骨形成密切相關的成骨細胞的分化和發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用，可保護成骨細胞，減緩衰老。成骨細胞體外實驗［1－2］證實，阿法骨化醇(alfacalcidol，ALF)抑制骨髓基質(zhì)細胞向脂肪細胞分化，向成骨細胞轉(zhuǎn)化，增加成骨細胞的數(shù)量，刺激成骨細胞;ALF通過增加骨生長因子、骨形態(tài)蛋白和骨基質(zhì)蛋白的合成，增加Vit D受體(VDR)數(shù)目。

Vit D的活性代謝物主要有阿法骨化醇［1α-(OH)D3］和骨化三醇［1，25(OH)2D3］，活性 Vit D結(jié)合VDR。研究報道［3－4］活性Vit D類似物增加骨量，阿法骨化醇對OVX大鼠和老年♂大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨有骨合成作用，刺激骨外膜骨形成，超偶聯(lián)促進骨內(nèi)膜面骨形成，預防Fischer-344 OVX大鼠的骨丟失和老年♂ SD大鼠松質(zhì)骨丟失。Weber等［5］觀察到 1α-hydroxyvitamin D2和 1α-hydroxyvitamin D3促進去卵巢大鼠皮質(zhì)骨骨合成，在較高的中毒濃度，可能誘導皮質(zhì)骨內(nèi)骨重建。這些研究都建立在骨丟失的模型上，本實驗采用骨組織形態(tài)計量學技術，探討不同劑量ALF對♀SD大鼠脛骨松骨和皮質(zhì)骨的影響，并比較其作用的部位差異性。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 試劑 藥物:阿法骨化醇來自 Calbiochem公司(La Jolla，CA，USA)，配制貯存液:將其溶解在體積分數(shù)為100%的乙醇中，質(zhì)量濃度為100 mg·L－1，避光，4℃冰箱貯存。注射液:每周用棉子油稀釋阿法骨化醇貯存液，其終濃度為0.005、0.025、0.05、0.1 mg·L－14個劑量;標記物和其它試劑購自美國Sigma公司。

1.1.2 實驗儀器 低速度鋸(Buehler，Illinois，USA);骨切片機(LEICA RM 2165 Rotary Microtome，Germany);骨磨片機(Trimmer，Buffalo Dental MFG Co.USA);圖像分析系統(tǒng)(OsteoMeasure，USA);顯微鏡(Olympus，Japan);照相機(Sony dxc-970MD camera，Japan);數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計軟件(StatView 5.0.1，USA)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗 8.5月齡正常未交配♀ Sprague-Dawley大鼠 74 只(Portage，MI，USA)，平均體質(zhì)量(320±12.4)g。每籠6～7只，飼養(yǎng)籠規(guī)格為(58×36×28)cm3，保證動物有足夠的活動空間。使用標準飼料(Harlan Teklad，USA)含有0.95%鈣，0.67%磷，4.5 IU·g－1Vit D3)。所有動物自由攝食、攝水，在(22±2)℃，通風良好，濕度(55±10)%的條件下適應性飼養(yǎng)2周。根據(jù)上述實驗目的按體質(zhì)量將大鼠隨機分為6組:基礎組、棉籽油空白對照組、阿法骨化醇 0.005、0.025、0.05、0.1 μg·kg－1·d－14 個劑量組。

Tab 1 Effects of ALF on cancellous bone static parameters of the proximal tibial metaphyses(PTM)in rats( ± s，n=6 or 7)

Tab 1 Effects of ALF on cancellous bone static parameters of the proximal tibial metaphyses(PTM)in rats( ± s，n=6 or 7)

*P＜0.05 vs baseline;#P＜0.05 vs vehicle

Group Dose/μg %B.Ar/% Tb.Wi/μm Tb.N/#·mm －1 Tb.Sp/μm Baseline 25.19 ±2.77 57.30 ±4.72 4.41 ±0.52 171.86 ±23.70 Vehicle 22.26 ±4.96 50.47 ±7.11 4.40 ±0.68 180.90 ±34.86 ALF 0.005 24.99 ±3.02 54.93 ±5.34 4.58 ±0.68 167.44 ±28.99 0.025 25.18 ±5.69 53.53 ±6.86 4.66 ±0.59 164.15 ±33.38e 0.05 26.93 ±5.02 53.39 ±6.21 5.05 ±0.75 148.45 ±30.27 0.1 35.50 ±4.20*# 68.85 ±12.29*# 5.16 ±0.62*# 126.56 ±17.50*#

Tab 2Effects of ALF on cancellous bone dynamic parameters of the proximal tibial metaphyses(PTM)in rats±s，n=6 or 7)

Tab 2Effects of ALF on cancellous bone dynamic parameters of the proximal tibial metaphyses(PTM)in rats±s，n=6 or 7)

*P＜0.05 vs baseline;#P＜0.05 vs vehicle

Group Dose/μg %L.Pm/% MAR/μm·d－1 BFR/BS/μm3·μm －2·d －1 BFR/BV/%·yr－1%E.Pm/%%L.Pm/%E.P Baseline 11.52 ±2.24 0.89 ±0.10 10.24 ±1.98 108.92 ±20.73 1.07 ±0.31 11.38 ±3.54 Vehicle 16.07 ±3.89* 0.90 ±0.25 14.73 ±6.58 188.29 ±110.19* 1.55 ±0.75 11.67 ±3.46 ALF 0.005 15.43 ±6.84 0.92 ±0.12 13.97 ±6.26 152.53 ±57.75 1.21 ±0.94# 14.74 ±5.07 0.025 10.33 ±2.33# 0.81 ±0.20 8.56 ±3.75# 95.60 ±33.02# 0.75 ±0.19# 14.93 ±6.64 0.05 7.46 ±3.24# 0.72 ±0.29 5.46 ±3.52*# 63.13 ±40.67# 0.47 ±0.17*# 17.33 ±9.80 0.1 7.03 ±2.51# 0.95 ±0.08 6.70 ±2.50# 54.99 ±19.69# 0.43 ±0.21*# 19.30 ±10.98*#

Tab 3Effects of ALF on cortical bone static parameters of the tibial shaft(TX)in rats(±s，n=6 or 7)

Tab 3Effects of ALF on cortical bone static parameters of the tibial shaft(TX)in rats(±s，n=6 or 7)

*P＜0.05 vs baseline;#P＜0.05 vs vehicle

Group Dose/μg T.Ar/mm2 Ct.Ar/mm2 %Ct.Ar/% Ct.Wi/μm %Ma.Ar/%Baseline 4.88 ±0.51 4.02 ±0.45 82.25 ±1.14 698.52 ±44.46 17.75 ±1.14 Vehicle 4.87 ±0.34 4.04 ±0.25 82.90 ±1.34 727.95 ±46.41 17.10 ±1.34 ALF 0.005 5.24 ±0.35 4.37 ±0.31 83.37 ±1.23 734.70 ±26.71 16.63 ±1.23 0.025 5.27 ±0.30 4.43 ±0.20 84.07 ±1.79 755.33 ±22.59* 15.93 ±1.79 0.05 5.12 ±0.41 4.25 ±0.42 82.96 ±2.71 722.77 ±50.76 17.04 ±2.71 0.1 5.43 ±0.54*# 4.56 ±0.46*# 83.90 ±1.83 769.56 ±66.49*16.10 ±1.83

Tab 4Effects of ALF on cortical bone dynamic parameters of the tibial shaft(TX)in rats(±s，n=6 or 7)

Tab 4Effects of ALF on cortical bone dynamic parameters of the tibial shaft(TX)in rats(±s，n=6 or 7)

*P＜0.05 vs baseline;#P＜0.05 vs vehicle

Group Dose/μg %Ps-L.Pm/%Ps-MAR/μm·d－1 Ps-BFR/BS/μm3·μm －2·d －1%Ec-L.Pm/%Ec-MAR/μm·d－1 Ec-BFR/BS/μm3·μm－2·d －1%Er.Pm/%Baseline 18.23 ±11.08 0.84 ±0.12 14.73 ±7.22 4.04 ±3.68 0.1 ±0.00 0.40 ±0.37 0.82 ±0.17 Vehicle 13.61 ±0.26 0.79 ±0.08 10.76 ±1.36 14.45 ±6.90 0.18 ±0.19* 2.01 ±1.19 1.09 ±0.20 ALF 0.005 23.73 ±5.17 0.74 ±0.21 18.30 ± 9.08 14.08 ±8.27 0.38 ±0.48* 7.73 ±11.99 0.78 ±0.16 0.025 25.98 ±16.43 0.91 ±0.33 29.79 ±25.55 9.83 ±7.08 0.32 ±0.39 3.75 ±5.86 0.78 ±0.14 0.05 35.19 ±16.37 0.94 ±0.24 34.50 ±22.27 9.93 ±4.92 0.10 ±0.00 0.99 ±0.49 0.74 ±0.40 0.1 47.93 ±16.38*#1.12 ±0.13*#54.84 ±25.62*#5.57 ±6.78 0.36 ±0.45#4.17 ±9.18 0.35 ±0.08

基礎組在實驗開始時尸檢取材。棉籽油空白對照組給與棉籽油，阿法骨化醇不同劑量組分別每天按灌胃給藥，灌胃量為 5 ml·kg－1·d－1，每周稱體質(zhì)量1次，并按體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量，共給藥12周。每天檢查所有大鼠的一般健康情況。

1.2.2 熒光標記 在實驗開始d 1，所有大鼠皮下注射 Xyenol Orange 90 mg·kg－1·d－1;所有動物在處死前d 14、d 13皮下注射鈣黃綠素(Calcein)10 mg·kg－1·d－1，處死前 d 4、d 3 皮下注射鈣黃綠素。

1.2.3 骨標本取材和骨組織形態(tài)計量學測量 實驗結(jié)束后，阿佛丁(avertin)腹腔注射麻醉動物，劑量為0.5 g·kg－1體質(zhì)量。右心室抽血處死，取左、右側(cè)脛骨。右側(cè)脛骨上端和中段用慢速鋸做額狀面剖開，固定于體積分數(shù)為70%的乙醇，做骨組織形態(tài)計量學分析;收集血液、離心后進行血清生化分析。

開腔后的脛骨近端PTM(proximal tibial metaphysis)和中段TX(tibial shaft)，Villanueva染液染色，固定和脫水，脫脂，浸透，包埋，磨片，超聲清洗，脫水，中性樹脂封固，用以進行骨組織形態(tài)計量學測量。

采用PTM骨厚片，測量脛骨近段干骺端生長板下1～4 mm范圍內(nèi)次級松質(zhì)骨中的骨組織形態(tài)計量學動態(tài)參數(shù)和靜態(tài)參數(shù)。測量前首先避開生長板下緣1 mm寬的初級松質(zhì)骨范圍，然后以此向下推移3 mm測量。測量方法、參數(shù)表達、參數(shù)計算等按文獻報道［6－7］。松質(zhì)骨骨組織形態(tài)計量學靜態(tài)參數(shù):描述骨量的多少和骨小梁的形態(tài)結(jié)構，用于評價藥物防治效果。動態(tài)參數(shù)包括骨形成參數(shù)、骨轉(zhuǎn)換參數(shù)和骨吸收參數(shù)，通過動態(tài)參數(shù)，可了解骨表面礦化量和速率，解釋靜態(tài)參數(shù)變化的原因。

2 結(jié)果

2.1 阿法骨化醇對大鼠脛骨近端松質(zhì)骨的骨組織形態(tài)計量學的影響 從Tab 1可見，松質(zhì)骨骨量阿法骨化醇劑量依賴性增加，可增加骨的連接性并改進骨小梁的微觀結(jié)構。0.1 μg·kg－1·d－1阿法骨化醇治療組與棉籽油空白對照組比較，骨小梁面積百分數(shù)(%B.Ar)增加59%，骨小梁數(shù)目(Tb.N)增加了17%，骨小梁的寬度 (Tb.Wi)升高了38%;骨小梁的分離度(Tb.Sp)下降30%。從Tab 2的動態(tài)參數(shù)可見，骨轉(zhuǎn)換降低，骨吸收抑制，骨吸收大于骨形成，導致骨的正平衡。在0.025、0.05和0.1 μg·kg－1劑量治療組中①反映骨形成的指標明顯下降:%L.Pm分別下降36%，53%，49%;每單位骨組織骨形成率(BFR/TV)分別下降36%、57%、37%;每單位骨小梁表面周長骨形成率(BFR/BS)分別下降42%、62%、47%。而骨轉(zhuǎn)換指標，每單位骨面積骨形成率(BFR/BV)也分別下降49%、65%、64%。②反映骨吸收的指標:骨吸收周長百分數(shù)%E.Pm下降 52%、70%、72%。在 0.1 μg·kg－1·d－1治療組中，估計的骨平衡指標(%L.Pm/%E.Pm)明顯增加到94%，暗示在最高劑量治療情況下，大鼠骨小梁處于正性平衡狀態(tài)。

除以上結(jié)果，我們還發(fā)現(xiàn)一個特殊情況，阿法骨化醇治療各劑量組明顯增加骨芽指標。在0.025、0.05和0.1 μg·kg－1劑量的治療組，脛骨近端 PTM骨小梁表面可見到非典型的特殊骨形成——骨芽(Fig 1)。

Fig 1 Trabecular“bone buds”of PTM(right picture)Atypical bone formation pattern“bone buds”(small，local and focal newly formed bone attached on bone suface，some are red，some are gree)was observed on trabecular sufaces of the PTM treated with 0.1 μg·kg－1·d －1ALF(B);bone connectivity of trabcular at 0.1 μg·kg－1·d－1ALF group that have bone buds(B)is much better than Aging control group(A)

總之，0.1 μg·kg－1阿法骨化醇治療組骨小梁結(jié)構改善;刺激骨形成，骨芽增多，而增加PTM松質(zhì)骨骨量。

2.2 脛骨中段皮質(zhì)骨的骨組織形態(tài)計量學分析阿法骨化醇0.1 μg·kg－1劑量組的骨組織總面積(T.Ar)明顯增加11%，皮質(zhì)骨面積(Ct.Ar)上升13%，而且骨外膜面熒光周長百分數(shù) (%Ps-L.Pm)明顯增加287%，骨表面骨形成率(Ps-BFR/BS)上升729%;但在骨內(nèi)膜面熒光周長百分數(shù)(%En-L.Pm)明顯下降61%和骨內(nèi)膜面吸收周長(%En-E.Pm)下降40%。在骨內(nèi)膜面，雙熒光有很大的個體差異，0.05 μg·kg－1劑量的 7 個大鼠，沒有雙熒光，在 0.1μg·kg－1·d－1劑量，只有兩個大鼠有雙熒光。當沒有雙熒光時，礦化沉積率 (MAR)定為0.1 μm·d－1［5］，因此在骨內(nèi)膜面的動態(tài)參數(shù)有很大的標準差 (Tab 3、4)。

3 討論

關于阿法骨化醇對♀大鼠脛骨近段骺端松質(zhì)骨(PTM)和脛骨中段皮質(zhì)骨(TX)的研究結(jié)果包括:① 0.1 μg·kg－1·d－1治療組，血鈣增加 5% ，而血磷水平在3個較高劑量增加幅度為25% ～41%;②0.1 μg·kg－1阿法骨化醇劑量依賴性增加脛骨近段骺端骨量;③ 骨組織形態(tài)計量學結(jié)果，0.1 μg·kg－1劑量的阿法骨化醇顯示有明顯的促骨合成反應，刺激骨芽的骨形成，抑制骨吸收超過抑制骨形成，骨的合成和分解呈動態(tài)正平衡，從而增加脛骨近段骺端松質(zhì)骨骨量，改善骨小梁的結(jié)構;④0.1 μg·kg－1阿法骨化醇治療組刺激脛骨中段皮質(zhì)骨骨外膜骨形成，增加骨礦化沉積率，皮質(zhì)骨面積絕對值增加，但皮質(zhì)骨面積相對百分數(shù)未改變。

0.1 μg·kg－1·d－1阿法骨化醇僅引起血鈣增加5%，其劑量比臨床劑量高5～7倍(對50～70 kg的病人，其臨床用量為 0.02 ～0.014 μg·d－1)。另外，當劑量為 0.005 μg·kg－1·d－1，血磷升高19%，當劑量為 0.1 μg·kg－1，血磷升高 41%。這個劑量是病人用藥劑量的3倍，所以，臨床上我們應該監(jiān)控血磷水平。

本研究得到了不同劑量的阿法骨化醇對未處理的♀大鼠PTM松質(zhì)骨的骨形態(tài)計量學的詳細結(jié)果，以前研究報道了阿法骨化醇對去卵巢大鼠和老年的♂大鼠的PTM松質(zhì)骨的影響，其均為高骨轉(zhuǎn)換骨質(zhì)減少模型［3－5］。而對去卵巢大鼠模型的研究僅報道了阿法骨化醇對去卵巢大鼠PTM的骨形態(tài)計量學靜態(tài)參數(shù)的影響［5］。我們的研究發(fā)現(xiàn) 0.1 μg·kg－1劑量的阿法骨化醇抑制骨吸收，抑制BMU骨重建，維持或增加骨形成，從而增加骨量，改善骨結(jié)構，其具有抗骨重建和促骨合成作用。其抗骨重建作用保留骨，充填骨吸收空洞，增加骨礦化［3－5，8］;其促骨合成作用體現(xiàn)在刺激骨小梁的微建造，促進骨芽的形成，導致骨動態(tài)正平衡，進一步增加骨量，改進骨微結(jié)構［8－9］。我們的發(fā)現(xiàn)與阿法骨化醇治療的OVX的大鼠腰椎的變化一致［3］。以上骨重建—抗骨代謝與骨建造—促骨合成作用呼應著名的骨計量學創(chuàng)始人、骨科專家 Frost“機械穩(wěn)態(tài)假設”理論［10－11］，阿法骨化醇降低產(chǎn)生最低效應的骨建造和骨重建的應變域值的調(diào)定點，刺激骨微建造，增加骨量;抑制BMU(basical multicellular units)骨重建的骨丟失［12］。

我們看到了一個特別的非典型的骨形成現(xiàn)象:新形成的、小的、集中的、花蕾狀的新骨出現(xiàn)在骨小梁的表面，新骨表面有單熒光或雙熒光覆蓋。在偏振光的顯微鏡下，骨芽膠原纖維走向不同于它們附著的骨小梁纖維走向，據(jù)有以上所有特點的新骨定義為骨芽。骨芽的出現(xiàn)暗示了阿法骨化醇激活或促進成骨細胞活性。德國著名的骨科教授Erben等［9］曾報道骨芽的產(chǎn)生和它的形成微解機制發(fā)生在高劑量(0.1、0.2 μg·kg－1)骨化三醇的 OVX’d ♀大鼠;Li等［13］報道產(chǎn)生在 0.1 和 0.2 μg·kg－1的阿法骨化醇治療的老年♂大鼠腰椎和脛骨中段。然而，當前研究首先報道阿法骨化醇誘導♀大鼠的骨芽形成在PTM的松質(zhì)骨骨表面。我們認為骨芽的形成可能機制在于:松質(zhì)骨的微建造或混合微建造/骨重建誘導所致［9，13］。然而，在大鼠的脛骨中段皮質(zhì)骨骨內(nèi)膜面我們沒有發(fā)現(xiàn)骨芽形成位點，Li等研究發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)在老年♂大鼠，可能是劑量的差異性。

阿法骨化醇對皮質(zhì)骨的影響，在未處理♀大鼠、OVX大鼠以及老年♂大鼠脛骨皮質(zhì)骨的骨形態(tài)計量學靜態(tài)參數(shù)沒有定量的差異性［3－5，13］。所有研究均報道阿法骨化醇刺激骨外膜骨礦化沉積率和微弱的骨內(nèi)膜的正性平衡。12周的治療期限不足夠產(chǎn)生有顯著意義的皮質(zhì)骨的靜態(tài)參數(shù)的變化。

總而言之，0.1 μg·kg－1阿法骨化醇治療 12周，具有抗骨代謝和促骨合成作用，增加♀大鼠松質(zhì)骨的骨量，改進骨微結(jié)構。其促骨合成作用表現(xiàn)在:刺激皮質(zhì)骨骨外膜的骨形成;促進松質(zhì)骨骨芽骨形成。其抗骨代謝作用表現(xiàn)在抑制骨小梁骨表面和皮質(zhì)骨骨內(nèi)膜面的骨吸收，抑制骨吸收大于骨形成，產(chǎn)生正性的內(nèi)膜骨平衡狀態(tài)。目前的研究結(jié)果顯示［14－15］阿法骨化醇對♀大鼠有劑量依賴性增加松質(zhì)骨骨量，改進骨小梁的結(jié)構，增加骨強度，具有骨合成和抗骨吸收作用，增加肌力作用，可以作為青年人和絕經(jīng)后婦女預防骨質(zhì)疏松癥的用藥。

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