硫化氫通過(guò)抑制p38 MAPK保護(hù)PC12細(xì)胞對(duì)抗化學(xué)性缺氧損傷

蘭愛(ài)平，梅衛(wèi)義，孟金蘭，胡 芬，楊春濤，楊戰(zhàn)利，陳培熹，馮鑒強(qiáng)

長(zhǎng)期以來(lái)，硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)被認(rèn)為是一種有毒的氣體。然而，隨著對(duì)H2S研究的深入，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)的一些組織細(xì)胞能生成H2S。它是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后，被發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)第3種氣體信號(hào)分子［1］。近年，不少的研究證實(shí)，H2S具有心肌保護(hù)作用［2-3］，也具有神經(jīng)保護(hù)作用，例如能保護(hù)大鼠大腦皮層神經(jīng)元對(duì)抗氧化應(yīng)激引起的損傷［4］，對(duì)抗 β-淀粉多肽誘導(dǎo) PC12 細(xì)胞損傷［5］。最近，本研究小組證實(shí)［6］，H2S能保護(hù)具有神經(jīng)元形態(tài)與功能特征的PC12細(xì)胞對(duì)抗氯化鈷(cobalt chloride，CoCl2)引起的損傷。

CoCl2是一種化學(xué)性低氧模擬劑，在多種培養(yǎng)細(xì)胞能模擬低氧/缺血狀況，包括增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成［6-7］，降低線(xiàn)粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)［8］等，并引起 PC12 細(xì)胞凋亡［7-9］。Zou 等［9］報(bào)道，CoCl2能增加絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族中的成員之一p38MAPK表達(dá)，p38MAPK的特異性抑制劑SB302580能抑制CoCl2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，提示p38MAPK介導(dǎo)CoCl2引起的PC12細(xì)胞損傷。但是，H2S是否通過(guò)調(diào)制p38MAPK表達(dá)對(duì)抗CoCl2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，迄今未見(jiàn)報(bào)道。本文旨在探討:(1)H2S能否抑制CoCl2對(duì)p38MAPK表達(dá)的上調(diào)作用?(2)p38MAPK抑制劑能否產(chǎn)生類(lèi)似于H2S的神經(jīng)保護(hù)作用，特別是能否抑制CoCl2引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料 NaHS、CoCl2、Hochest 33258、DCFHDA、Rh123購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo Lab，DMEM-F12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，抗p38，p-p38和Western blot檢測(cè)試劑盒SB302580(p38抑制劑)購(gòu)自Cell Signaling Technoligy Inc(CST)。

這屆學(xué)術(shù)邀請(qǐng)展版塊的油畫(huà)藝術(shù)家更有其各自的創(chuàng)作風(fēng)格。他們是中國(guó)國(guó)家畫(huà)院油畫(huà)院副院長(zhǎng)郭北平；中國(guó)美術(shù)學(xué)院繪畫(huà)藝術(shù)學(xué)院院長(zhǎng)楊參軍；北京畫(huà)院油畫(huà)創(chuàng)作室主任白羽平；中國(guó)寫(xiě)實(shí)畫(huà)派領(lǐng)軍人物之一、湖北省文聯(lián)副主席冷軍；中國(guó)藝術(shù)研究院中國(guó)油畫(huà)院副院長(zhǎng)朱春林。這5位藝術(shù)家可謂當(dāng)今油畫(huà)藝術(shù)領(lǐng)域的實(shí)力派代表，他們以自己具有經(jīng)典價(jià)值的藝術(shù)作品與學(xué)術(shù)追求，體現(xiàn)出他們對(duì)中國(guó)油畫(huà)藝術(shù)在新時(shí)代如何發(fā)展若干現(xiàn)實(shí)課題的獨(dú)特思考，提供了多方位研究油畫(huà)在當(dāng)代語(yǔ)境下發(fā)展現(xiàn)狀與未來(lái)趨勢(shì)問(wèn)題的經(jīng)典個(gè)案。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和預(yù)處理方法 PC12細(xì)胞由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，置于含20%新生牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。NaHS預(yù)處理按如下程序?qū)嵤?400 μmol·L-1NaHS作用PC12細(xì)胞30 min，撤去，用 PBS洗兩次，接著給予600 μmol·L-1CoCl2作用24 h。p38抑制劑 SB302580(20 μmol·L-1)在損傷前60 min加入培養(yǎng)液。

北醫(yī)三院對(duì)節(jié)能的重視由來(lái)已久。醫(yī)院黨委書(shū)記金昌曉向記者介紹道，醫(yī)院在能源管理工作上，逐步完善全面的能源管理組織框架與管理制度，配套節(jié)能資金的投入，推動(dòng)能源管理的平臺(tái)化發(fā)展，實(shí)現(xiàn)節(jié)能項(xiàng)目從立項(xiàng)到總結(jié)形成閉環(huán)管控，取得了明顯的節(jié)能成效。

1.5 Western blot法檢測(cè)p38蛋白的表達(dá) PC12細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，各實(shí)驗(yàn)組給予不同的處理因素后，用預(yù)冷的PBS洗兩次，加入細(xì)胞裂解液，4℃靜置 30 min，12 000 r·min-1離心 10 min，取上清，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDSPAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1.5 h，隨后加入 p38、p-p38(1 ∶1 000，4℃ 過(guò)夜，用TBST洗3次，10 min/次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光到X線(xiàn)片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

2.3 H2S和p38MAPK抑制劑對(duì)抗CoCl2的致凋亡作用 Fig 3的Hochest 33258核染色法檢測(cè)結(jié)果顯示，600 μmol·L-1CoCl2處理 PC12 細(xì)胞48 h 后，使凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增多。在 600 μmol·L-1CoCl2處理PC12細(xì)胞前，分別應(yīng)用400 μmol·L-1NaHS預(yù)處理細(xì)胞30 min或20 μmol·L-1SB302580預(yù)處理60 min均能明顯的抑制CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，使凋亡細(xì)胞數(shù)目減少。400 μmol·L-1NaHS 30 min或20 μmol·L-1SB302580本身不引起細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果提示，H2S可通過(guò)抑制p38MAPK通路來(lái)對(duì)抗CoCl2的致細(xì)胞凋亡作用。

1.3 細(xì)胞存活率的檢測(cè) PC12細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以 1 ×107·L-1接種于 96 孔板，100 μl/孔。在37℃，5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜后，按實(shí)驗(yàn)要求給予不同處理，每孔設(shè)8個(gè)平行孔，處理完后，每孔加入10 μl的 CCK-8，37℃繼續(xù)孵育 4 h，用酶標(biāo)儀(450 nm)記錄各孔的吸光度(OD)。取4孔OD值的平均數(shù)，按公式計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率/%=處理組OD/對(duì)照組OD×100%，重復(fù)3次

本組20例患者，男8例，女13例，年齡55～65歲，平均59歲，有慢性關(guān)節(jié)疼痛或腫脹6個(gè)月以上，均經(jīng)X線(xiàn)片或MRI檢查提示有膝關(guān)節(jié)退行性變、關(guān)節(jié)軟骨破壞的表現(xiàn)。排除糖尿病、血液系統(tǒng)疾病、免疫疾病等影響骨質(zhì)的基礎(chǔ)疾病。

1.6 細(xì)胞內(nèi)ROS含量的檢測(cè) DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，細(xì)胞內(nèi)的ROS可將無(wú)熒光的DCFH氧化成發(fā)出綠色熒光的DCFH，綠色熒光的強(qiáng)弱可以間接反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。將細(xì)胞接種于35 mm的培養(yǎng)皿中，各實(shí)驗(yàn)組給予不同的處理因素后，倒掉培養(yǎng)液，用無(wú)血清的低糖培養(yǎng)液洗兩次，隨后用10 μmol·L-1DCFH-DA染液于37℃孵育60 min。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取不重復(fù)的區(qū)域攝片，用Image J 1.41軟件的COLOR Hitogram模塊計(jì)算出5個(gè)視野綠色熒光強(qiáng)度的平均值，再對(duì)各組的樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

商品驗(yàn)收。該環(huán)節(jié)控制對(duì)策主要有三項(xiàng)：其一，針對(duì)魚(yú)肉這一類(lèi)型的食品，需要檢查商品檢疫合格證、運(yùn)載工具消毒證明以及來(lái)自非疫區(qū)證明三項(xiàng)證明。其二，低溫庫(kù)存商品，保存溫度處于-18℃以下，需要保證其外表為凍結(jié)狀態(tài)，嚴(yán)格控制中心溫度，使其在-8℃以下。常溫以及回溫化凍食品，首先需要對(duì)其進(jìn)行凍結(jié)處理，然后才可以進(jìn)行入庫(kù)處理。其三，對(duì)于經(jīng)過(guò)鹽水浸泡的食品、具備化學(xué)腐蝕功能的商品以及液體商品等，應(yīng)該進(jìn)行嚴(yán)密包裝。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有結(jié)果以±s表示，組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗(yàn)，用LSD進(jìn)行均數(shù)之間的比較。

1.7 細(xì)胞內(nèi)MMP的檢測(cè) Rh123是一種能夠被線(xiàn)粒體吸收的熒光染料，線(xiàn)粒體對(duì)其攝取能力取決于其跨膜電位。根據(jù)熒光強(qiáng)度可以間接反映MMP的高低，將細(xì)胞接種于35 mm的培養(yǎng)皿中，各實(shí)驗(yàn)組給予不同的處理因素后，倒掉培養(yǎng)液，用不含血清的低糖培養(yǎng)液洗兩次，隨后在含100 mg·L-1Rh123的無(wú)血清的培養(yǎng)基中37℃孵育45 min，在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取不重復(fù)的區(qū)域攝片，，細(xì)胞核周?chē)木G色亮點(diǎn)即為攝取了Rh123的線(xiàn)粒體。用Image J 1.41軟件的COLOR Hitogram模塊計(jì)算出5個(gè)視野綠色熒光強(qiáng)度的平均值，再對(duì)各組的樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.2 H2S和p38MAPK抑制劑對(duì)抗CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性 Fig 2結(jié)果顯示，600 μmol·L-1CoCl2處理PC12細(xì)胞24 h后，使細(xì)胞存活率降低至(39.9±2.2)%(P＜0.01)，提示CoCl2能產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。在600 μmol·L-1CoCl2處理 PC12細(xì)胞前，分別應(yīng)用400 μmol·L-1NaHS預(yù)處理細(xì)胞30 min或20 μmol·L-1SB302580(p38MAPK 抑制劑)預(yù)處理60 min均能明顯的抑制CoCl2的細(xì)胞毒性，使細(xì)胞存活率分別升高至(61.3±2.1)%和(74.3±1.7)%，與CoCl2處理組比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

Fig 1 NaHS(400 μmol·L －1)preconditioning inhibited CoCl2induced activation of p38MAPK in PC12 cells#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs CoCl2

2.1 H2S阻斷CoCl2對(duì)p38MAPK表達(dá)的上調(diào)作用 本文的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在200～800 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)，CoCl2呈濃度依賴(lài)性的抑制PC12細(xì)胞存活率，其中600 μmol·L-1CoCl2使 PC12細(xì)胞存活率降至(39.9±2.2)%(P＜0.01)，故本文使用600 μmol·L-1作為CoCl2的損傷濃度，另一方面在12～48 h范圍內(nèi)600 μmol·L-1CoCl2呈時(shí)間依賴(lài)性的抑制PCl2細(xì)胞的存活率，故本文確定24 h作為CoCl2損傷PC12細(xì)胞的時(shí)間。Fig 1結(jié)果顯示，應(yīng)用 600 μmol·L-1CoCl2作用 PC12細(xì)胞 120 min，可使磷酸化(P)p38MAPK表達(dá)明顯升高，是對(duì)照組的(2.8±0.27)倍(P＜0.05)。在CoCl2處理PC12細(xì)胞前應(yīng)用400 μmol·L-1NaHS預(yù)處理細(xì)胞30 min，可明顯的抑制CoCl2對(duì)p-p38MAPK表達(dá)的促進(jìn)作用。

Fig 2 Effects of H2S and p38 MAPR inhibitor on inhibition of cell viability of PC12 cells by CoCl2CoCl2group:PC12 cells were treated by 600 μmol·L-1CoCl2for 24 h;NaHS+CoCl2group:PC12 cells were pretreated by 400 μmol·L-1NaHS for 30min，followed by exposure of cells to 600 μmol·L-1 CoCl2for 24h;SB302580+CoCl2group:PC12 cells were pretreated by 20 μmol·L-1SB302580(p38 MAPK inhibitor)for 60min，followed by exposure of cells to 600 μmol·L-1CoCl2for 24 h.*P ＜ 0.05 vs CoCl2;#P＜0.05 vs control

1.4 Hochest 33258核染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量 將PC12細(xì)胞(1×107·L-1)接種于35 mm的小號(hào)培養(yǎng)皿中，各實(shí)驗(yàn)組按要求給予不同的處理因素后，加入新鮮配置的4%多聚甲醛(pH=7.4)于4℃固定細(xì)胞10 min，用 PBS洗兩次，加入5 mg·L-1Hochest 33258染色液染色10 min，用PBS洗兩次，加入適量的PBS后用熒光顯微鏡觀察，攝片。正常細(xì)胞核出現(xiàn)彌散均勻的低密度熒光;細(xì)胞核呈固縮形態(tài)或顆粒狀熒光，計(jì)為凋亡細(xì)胞。

方法1：肥皂水鑒別法。分別用兩支潔凈的試管取等量水樣，再向兩支試管中分別滴加等量肥皂水，振蕩。泡沫多、浮渣少的水樣為軟水；反之，泡沫少、浮渣多的水樣為硬水。

Fig 3 Influences of H2S and p38 MAPK inhibitor on CoCl2-induced apoptosis in PC12 cellsA-a:Control group;A-b:NaHS(400 μmol·L-1)alone had also no effect on apoptosis of PC12 cells;A-c:The inhibitor of p38 SB302580(20 μmol·L-1)itself had no effect on apoptosis of PC12 cells;A-d:CoCl2 group:exposure of cells to 600 μmol·L-1CoCl2for 48 h，significantly increased the quantities of apoptotic cells;A-e:NaHS+CoCl2group:The increased quantities of apoptotic cells induced by CoCl2were markedly decreased by NaHS pretreatment;A-f:SB302580+CoCl2group:The increased quantities of apoptotic cells induced by CoCl2were markedly decreased by SB302580(20 μmol·L-1)pretreatment.B:showing the statistical results from A.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs CoCl2

2.4 H2S和 p38MAPK抑制劑對(duì)抗 CoCl2對(duì)MMP的損傷作用 Fig 4結(jié)果顯示，600 μmol·L-1CoCl2處理PC12細(xì)胞24 h后，使細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度(MFI，為 MMP大小的指標(biāo))從55.2±2.7(對(duì)照組)降到31.5±2.2(P＜0.01)，提示CoCl2能損傷線(xiàn)粒體，使 MMP降低。然而，在600 μmol·L-1CoCl2處理PC12細(xì)胞前，分別應(yīng)用400 μmol·L-1NaHS預(yù)處理細(xì)胞30 min或20 μmol·L-1SB302580預(yù)處理60 min均能阻斷CoCl2降低MMP的作用，MFI分別升高至41.5±2.1(P＜0.05)和46.2±2.3(P ＜0.01)。

Fig 4 Effects of H2S and p38 MAPK inhibitor on the loss of MMP induced by CoCl2in PC12 cells(n=3)MMP of PC12 cells was detected by using the fluorescent dye Rh123.##P＜0.01 vs control;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CoCl2

Fig 5 Effects of H2S and p38 MAPK inhibitor on CoCl2-induced intracellular ROS generation in PC12 cells(n=3)ROS of PC12 cells was detected by using the fluorescent dye DCFHDA.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs CoCl2

2.5 H2S和p38MAPK抑制劑抑制CoCl2引起的ROS過(guò)度生成 Fig 5結(jié)果顯示，600 μmol·L-1CoCl2處理PC12細(xì)胞6 h后，使細(xì)胞內(nèi)ROS水平比正常對(duì)照組高1.8倍(MFI為56.1±1.4)(P＜0.05)。在600 μmol·L-1CoCl2處理PC12 細(xì)胞前，分別應(yīng)用400 μmol·L-1NaHS預(yù)處理細(xì)胞30 min或 20 μmol·L-1SB302580 預(yù)處理 60 min，均能抑制CoCl2促進(jìn) ROS生成作用，分別使 MFI降低至43.5±2.2(P＜0.05)和39.3±1.4(P＜0.05)。400 μmol·L-1NaHS 或 20 μmol·L-1SB302580 本身對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平無(wú)明顯影響。

3 討論

本文再次證實(shí)化學(xué)性低氧模擬劑CoCl2能誘導(dǎo)類(lèi)似于缺氧/缺血性損傷，使PC12細(xì)胞存活率降低，凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，MMP丟失及ROS生成增多，這與前文［6-9］的報(bào)道一致，另一方面，本文觀察到CoCl2能促進(jìn)p38MAPK表達(dá)，p38MAPK抑制劑SB302580不僅能減弱CoCl2的細(xì)胞毒性，而且能抑制它的致凋亡作用，提示p38MAPK可能介導(dǎo)CoCl2引起的細(xì)胞毒性及致凋亡作用。在 PC12細(xì)胞，p38MAPK被認(rèn)為是多種傷害性刺激引起細(xì)胞凋亡的信號(hào)分子之一［10］。p38MAPK也與低氧引起的成骨細(xì)胞的凋亡成正相關(guān)關(guān)系［11］。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)p38MAPK抑制劑能改善線(xiàn)粒體的功能，使CoCl2引起的MMP丟失減少，并抑制胞內(nèi)ROS過(guò)度生成，提示CoCl2損傷PC12細(xì)胞的機(jī)制之一是通過(guò)上調(diào)p38MAPK進(jìn)而促進(jìn)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，使ROS生成增多，MMP丟失。Zou等［9］也觀察到 p38MAPK可通過(guò)激活caspase-3介導(dǎo)CoCl2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡。由此可以看出，CoCl2誘導(dǎo)類(lèi)似缺氧缺血反應(yīng)的機(jī)制是比較復(fù)雜的。

重要的是，本研究證實(shí)H2S在保護(hù)PC12細(xì)胞對(duì)抗化學(xué)性缺氧損傷的同時(shí)，能明顯的抑制CoCl2對(duì)p38MAPK表達(dá)的上調(diào)作用，提示通過(guò)抑制p38MAPK表達(dá)是H2S的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制之一。在人的粒細(xì)胞，H2S可通過(guò)抑制p38MAPK和caspase-3來(lái)提高細(xì)胞存活率［12］。在小膠質(zhì)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，H2S可通過(guò)抑制p38MAPK表達(dá)來(lái)對(duì)抗脂多糖引起的炎癥反應(yīng)［13］。這些研究均支持本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，本文在PC12細(xì)胞，首次證實(shí)H2S通過(guò)抑制p38MAPK信號(hào)通路來(lái)對(duì)抗化學(xué)性缺氧引起的神經(jīng)損傷作用，使細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡數(shù)量降低，MMP丟失及ROS生成均減少，這為深入闡明H2S的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)資料，為防治缺血缺氧性神經(jīng)損傷提供了新的治療靶點(diǎn)。

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