女貞子多糖對(duì)淋巴瘤細(xì)胞膜抗原性的影響

李 璘，邱蓉麗，樂 巍，韓 瑩，施櫻櫻，李寰舟

女貞子(Ligustrum lucidum Ait)是木樨科植物女貞的干燥成熟果實(shí)，性味甘、微苦、涼，歸肝、腎經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)等功能。研究表明女貞子多糖(LLP)可以提高機(jī)體免疫功能，是女貞子的有效成分之一［1－2］。臨床上女貞子常與其它中藥配伍，用于治療腫瘤及改善化療后的白細(xì)胞減少等癥狀［3－4］，我們研究表明［5－6］女貞子多糖(Ligustrum lucidum Ait polysaccharide，LLP)可以抑制 S180和H22兩種實(shí)體瘤生長(zhǎng)，提高正常機(jī)體和荷瘤小鼠的免疫功能。為了進(jìn)一步研究篩選女貞子多糖提高免疫力的有效部位，本文重點(diǎn)研究女貞子多糖及其分級(jí)組分對(duì)淋巴瘤細(xì)胞表面唾液酸含量和其對(duì)腫瘤細(xì)胞免疫原性的影響，探討女貞子多糖體內(nèi)抗腫瘤的作用機(jī)制及其有效部位，為臨床用于腫瘤患者治療提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑 Hepes(北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心，H3375)，PMSF(南京大治生物技術(shù)有限公司，DZ0754)，Pepstatin A(南京大治生物技術(shù)有限公司，J583)，EDTA(Amresco，0105 －100);Giemsa染液(南京建成生物工程研究所，批號(hào):20061016)，唾液酸試劑盒(南京建成生物技術(shù)研究所，批號(hào):2006 1014)，福氏完全佐劑(Sigma，批號(hào):016K8900)，福氏不完全佐劑(Sigma，批號(hào):086K8905)，牛血清白蛋白(Amresco，批號(hào):0619S02)

1.2 儀器 超聲細(xì)胞破碎儀(AD Instruments)，核酸蛋白分析儀(Beckman)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma Scientific)，倒置顯微鏡工作站(Leica)，臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Beckman)，酶標(biāo)儀(Molecular Devices)。

1.3 動(dòng)物及細(xì)胞株 Balb/c鼠:南京大學(xué)模式動(dòng)物研究中心提供，合格證號(hào) SCXK(蘇)2002－002;Yac-1細(xì)胞株:南京中醫(yī)藥大學(xué)中研院藥理二室提供。

1.4 藥物 女貞子總多糖(A)及女貞子多糖10%(B)、30%(C)、50%(D)、70%(E)乙醇分級(jí)沉淀產(chǎn)物(女貞子總糖水溶解后依次加乙醇至終濃度為10%、30%、50%及70%的沉淀物)，PBS配成300 mg/10 ml液，1 000 ×g，15 min 離心，取上清液，滅菌，保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 淋巴瘤細(xì)胞膜的提取 取淋巴瘤細(xì)胞Yac-1，RPMI1640培養(yǎng)后分組，分別加入 A、B、C、D、E 藥物30 μl于細(xì)胞液中，使其終濃度為 300 mg·L－1，對(duì)照組加入等體積的PBS(NaCl 9.35 g·L－1，KCl 0.2 g·L－1，Na2HPO4·12H2O 2.85 g·L－1，KH2PO40.27 g·L－1)。培養(yǎng)60 h后，離心，PBS洗2次，加Cytosolic lysis buffer液(Hepes 10 mmol·L－1，NaCl 10 mmol·L－1，KCl 1 mmol·L－1，NaHCO35 mmol·L－1，CaCl21 mmol·L－1，MgCl20.5 mmol·L－1)，每瓶1 ml，孵育5 min［7］。細(xì)胞刮子將細(xì)胞輕輕刮離到Cytosolic lysis buffer中，加蛋白酶抑制劑1 mmol·L－1PMSF(1.74 g PMS·L－1異丙醇)，5 min 后加 1 μg·L－1Pepstatin A 及5 mmol·L－1EDTA。置于冰水中，超聲細(xì)胞破碎儀裂解細(xì)胞(25 W，10 s開，20 s停，計(jì)30次)。涂片行Giemsa染色(80%以上的細(xì)胞裂解)，4℃離心1 000×g，10 min。取上清液4℃離心4 000×g，15 min，棄沉淀后，上清液4℃離心15 000 ×g，90 min，取沉淀，加0.1 ml蒸餾水吹散［8］。

2.2 抗體的制備 取上述各組沉淀(細(xì)胞膜)懸液，與福氏完全佐劑(1∶1)充分混勻(呈現(xiàn)乳白色油狀液體)。取Balb/c小鼠，分別于背部皮下注射0.2 ml/只，兩側(cè)腋下淋巴結(jié)處0.1 ml多處皮下注射相應(yīng)細(xì)胞懸液，每只注射0.6 ml。對(duì)照組給予等體積生理鹽水與福氏完全佐劑(1∶1)的混勻液［9］。分別于14、21、25 d，細(xì)胞膜提取液與福氏不完全佐劑(1∶1)混勻，如前法進(jìn)行加強(qiáng)免疫。末次免疫7 d后小鼠眼眶取血，1 500×g，10 min，離心血清。

2.3 血清中抗體滴度測(cè)定(間接ELISA法)包被液(NaCl 8.0g·L－1，KCl 0.2 g·L－1，Na2HPO412H2O 3.6 g·L－1，KH2PO40.24 g·L－1，pH 7.4)稀釋抗原(1 ∶20)，酶標(biāo)板加100 μl抗原溶液，37℃水浴1 h。去離子水沖洗酶標(biāo)板，加入2%BSA，37℃水浴1 h，進(jìn)行封閉。去離子水清洗3次，去除孔中殘余的液體。用PBS按1∶200、1∶400、1∶800、1 ∶1 600、1 ∶3 200及1 ∶6 400比例稀釋血清，每孔100 μl，同時(shí)用免疫前血清作陰性對(duì)照。去離子水清洗，加入羊抗鼠血清(1∶105)，每孔100 μl，37℃水浴1 h。去離子水清洗，去除孔中殘余液體，加入 PNPP 底物液 100 μl，37℃水浴 40 min，405 nm測(cè)定。

2.4 細(xì)胞膜表面唾液酸含量的測(cè)定 將藥物處理過的細(xì)胞膜及對(duì)照組細(xì)胞膜分別用0.1 ml蒸餾水吹散，制成細(xì)胞膜懸液，按試劑盒進(jìn)行唾液酸含量的測(cè)定?；靹蛞?00℃水浴15 min，3 500 r·min－1，離心10 min，上清液于560 nm測(cè)定［10］，并按下列計(jì)算公式:

唾液酸含量(mmol·g－1Pro)=(測(cè)定管OD值－空白管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值－空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度

3 結(jié)果

3.1 女貞子多糖對(duì)血清抗體滴度的影響 女貞子多糖及其分級(jí)沉淀部位具有提高小鼠血清中抗體滴度的能力，以女貞子總多糖(A)及50%醇沉多糖(D)作用較強(qiáng)，10%醇沉部位(B)的作用較弱。提示女貞子多糖及其分級(jí)沉淀部位與淋巴細(xì)胞瘤作用后，可能影響細(xì)胞表面的蛋白多糖結(jié)構(gòu)，暴露抗原部位，提高腫瘤細(xì)胞免疫原性，激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)。結(jié)果見Tab 1。

3.2 女貞子多糖對(duì)淋巴瘤細(xì)胞膜表面唾液酸含量的影響 唾液酸常位于細(xì)胞表面，為細(xì)胞與外界環(huán)境信息交流的通道之一，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生重要影響。研究結(jié)果表明:女貞子總多糖(A)及50%醇沉多糖(D)在300 mg·L－1的濃度下作用60 h，可以降低淋巴瘤細(xì)胞Yac-1細(xì)胞膜表面唾液酸的含量，與PBS比較差異有顯著性(P＜0.05)，結(jié)果見Tab 2。

Tab 1 Effects of LLP on serum antibodies in mice immunized by lymphoma membrane

Tab 2 Effects of LLP on sialic acid in lymphoma membrane(±s，n=3)

Tab 2 Effects of LLP on sialic acid in lymphoma membrane(±s，n=3)

*P＜0.05 vs control

Group Dose/mg·L －1 SA/mmol·L －1 PBS － 0.2850 ±0.0950 A 300 0.1360 ±0.0333*B 300 0.1676 ±0.0378 C 300 0.1651 ±0.1832 D 300 0.1580 ±0.0263*E 300 0.1979 ±0.1634

4 討論

唾液酸是以吡喃形式存在的酸性氨基糖，為多種天然神經(jīng)氨酸衍生物中的一種。其氨基被乙酞基、羥乙?；蛄u基被乙酸基、乳?；⒘蛩峄蛄姿峄セ?，呈現(xiàn)多樣性。唾液酸與細(xì)胞表面蛋白結(jié)合，形成一系列的糖綴合物。糖綴合物由蛋白質(zhì)及糖兩部分組成，糖位于生物細(xì)胞的表面，為病毒、細(xì)菌及植物和細(xì)菌毒素的特異性受體，并作為自身免疫和異體免疫反應(yīng)的抗原。在大多數(shù)情況下，涉及的糖系列有高度特異性，糖綴合物即參與抗體形成，同時(shí)對(duì)細(xì)胞外層具有保護(hù)作用。腫瘤的轉(zhuǎn)化和惡性進(jìn)程伴隨細(xì)胞表面唾液酸量、連接方式和類型的顯著變化［11－14］。許多腫瘤特異性抗體都是針對(duì)糖抗原表位，同時(shí)腫瘤細(xì)胞表面的糖層也為其免疫逃避起到保護(hù)作用［15］。唾液酸是細(xì)胞膜表面負(fù)電荷的主要來源，參與細(xì)胞表面多種生理功能，影響細(xì)胞膜表面電荷磁性、抗原決定簇的暴露、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程、膜表面受體功能等。近年許多學(xué)者報(bào)道惡性腫瘤患者、心血管疾病患者、某些炎癥患者的SA升高，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)唾液酸持續(xù)升高來診斷腫瘤的研究已逐漸確定，認(rèn)為它可以作為早期腫瘤的篩選指標(biāo)［7］。我們已有的研究結(jié)果表明［6，16］，女貞子多糖可以提高荷瘤小鼠免疫力，影響腫瘤細(xì)胞黏附能力，具有抗腫瘤作用。

為進(jìn)一步篩選其有效部位及研究作用機(jī)制，本文采用女貞子多糖及其不同分子量多糖作用于淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞后，提取細(xì)胞膜的膜性成分，測(cè)定唾液酸含量;同時(shí)用細(xì)胞膜提取物免疫小鼠，測(cè)定小鼠血清抗體的變化。研究結(jié)果表明，女貞子總多糖(A)及50%醇沉多糖(D)提高小鼠血清的抗體滴度，促進(jìn)小鼠抗體產(chǎn)生，提高免疫力;同時(shí)也降低淋巴瘤細(xì)胞膜表面唾液酸酶的含量，提示女貞子多糖及其分級(jí)沉淀部位抗腫瘤作用可能是通過降低腫瘤細(xì)胞膜表面唾液酸的含量，使腫瘤細(xì)胞膜表面蛋白抗原充分暴露，提高腫瘤細(xì)胞的抗原性，使機(jī)體免疫系統(tǒng)更易識(shí)別腫瘤細(xì)胞，從而得到抗腫瘤作用。

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