2-DG增強乳腺癌細(xì)胞對阿霉素化療敏感性的作用

程 秀，劉 浩，方 琳，蘇 方，宋樂樂，馬琳艷，蔣國君，張旭東，蔣志文

乳腺癌是一種嚴(yán)重危害女性身心健康的惡性腫瘤，發(fā)病率在全球范圍內(nèi)位居女性惡性腫瘤的首位，并以每年2%的速度遞增。全球每年新增病例120萬，死亡病例50萬，據(jù)估計到2010年全球每年新增病例將達(dá)150萬人［1］。以手術(shù)為主，配合化療、放療、內(nèi)分泌療法、免疫療法及中醫(yī)藥療法的綜合治療措施，是目前治療乳腺癌高效低毒的優(yōu)化方案［1-2］。但是腫瘤對大多數(shù)化療藥耐藥，對化療藥引起的細(xì)胞凋亡不敏感，因此，研究其耐藥機制、克服化療耐藥，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點是腫瘤研究的熱點之一［3-4］。本研究觀察了糖基化抑制劑2-DG對乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并聯(lián)合臨床常用治療乳腺癌的藥物阿霉素，檢測2-DG增強ADM誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用，并對其初步機制進行探討，以期為乳腺癌的臨床治療提供新的思路和方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 細(xì)胞系Sk-Br-3(購于美國ATCC公司)，由蚌埠醫(yī)學(xué)院生化藥理研究室凍存培養(yǎng)。

1.1.2 試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Hepes、新生牛血清:Gibco公司。2-DG:Sigma公司;阿霉素:浙江海正藥業(yè)股份有限公司;Caspase-3檢測試劑盒:碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌腫瘤細(xì)胞采用DMEM高糖培養(yǎng)液，10%(V/V)FBS，100 U·ml-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素，37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)。

1.2.2 MTT 將細(xì)胞按每孔200 μl(含1×104個細(xì)胞)種于96孔板，每5孔為一組，每種藥取5個質(zhì)量濃度，各組藥物終濃度如下，ADM:0.625、1.25、2.5、5、10 mg·L-1。另設(shè)陰性對照組(不加藥物)和空白對照組(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)基)。終止培養(yǎng)前4 h，每孔加MTT 20μl(5 g·L-1)，加藥后24～72 h(藥物作用終點時間)終止培養(yǎng)，棄去上清液，加入二甲亞砜200 μl每孔，微量振蕩器搖震5 min，全自動定量繪圖酶標(biāo)儀測定每孔的595 nm波長吸光度A值，各藥重復(fù)試驗3組。

1.2.3 溴化丙啶(propidium iodide，PI)染色檢測細(xì)胞凋亡 將對數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1×105個細(xì)胞，培養(yǎng)16～24 h后按實驗設(shè)計加入藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48h收集各孔培養(yǎng)液至對應(yīng)流式管中，用預(yù)冷的PBS 500 μl清洗培養(yǎng)孔，收集清洗液至對應(yīng)培養(yǎng)液中，1 200 r·min-1，離心10 min，棄上清;培養(yǎng)板中加入PI緩沖液(5 mg PI，0.1 g 檸檬酸鈉、100 μl TritonX-100、100 ml dH2O)750 μl/孔，37℃ 孵育 10 min，吹打收集細(xì)胞至對應(yīng)流式管中，輕輕搖動混勻。4℃避光保存，過夜，上流式細(xì)胞儀檢測。利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細(xì)胞比例，代表凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 Caspase-3活性檢測 按照說明書進行檢測，反應(yīng)溫度為 37℃。取樣本 100 μl，Ac-DEVDAMC(Caspase-3四肽熒光底物)10 μl加到HEPES緩沖液中，在37℃下作用1 h，應(yīng)用熒光分光光度計在波長405 nm處測吸光度，以不加底物的樣本作空白，結(jié)果以吸光度值表示。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達(dá) 收集穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞用細(xì)胞裂解液(總體積200 ml:100 mmol·L-1Tris-HCl pH 7.4 20 ml、1 mol·L-1NaCl 28 ml、100 mmol·L-1CaCl21 ml、100 mmol·L-1MgCl221 ml、15 mmol·L-1NaN340 ml、Triton X-100 2ml，用前加入蛋白酶抑制劑 12 μmol·L-1Leupeptin、1 mmol·L-1PMSF各2 ml·L-1)冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法(參照試劑盒說明書操作)測各組蛋白濃度，用細(xì)胞裂解液將各組蛋白稀釋至等濃度，與2×上樣緩沖液1∶1混合，100℃煮沸5 min蛋白變性。取蛋白 30 μg/組，10%SDS-PAGE凝膠電泳(70 V，30 min;150 V，90 min);轉(zhuǎn)膜(50 V，90 min)至硝酸纖維素膜;5%脫脂牛奶室溫封閉2 h(或4℃過夜);一抗:1∶250，室溫孵育2 h(或4℃過夜);TPBS洗滌3次;二抗:1∶2500，室溫孵育2 h;TPBS洗滌3次，PBS洗滌1次;ECL發(fā)光試劑盒暗室發(fā)光、顯影、定影。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.2.6 集落克隆實驗 用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度后，分別以每孔800個細(xì)胞接種于6孔板中，24 h后加0.132 mg·L-1ADM，1 mmol·L-12-DG以及兩者合用處理乳腺癌細(xì)胞，置CO2孵箱中培養(yǎng)d 5，觀察到細(xì)胞集落形成后，去除培養(yǎng)基，PBS洗滌2遍，20%甲醇 -20℃固定10 min，結(jié)晶紫染色，集落形成率的降低證實，2-DG增加ADM對乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3的增殖抑制作用。

2 結(jié)果

2.1 2-DG增強ADM對乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3增殖的抑制作用 為觀察2-DG抑制乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3增殖的作用及對ADM抑制乳腺癌細(xì)胞增殖作用的影響，實驗中使用不同濃度的2-DG刺激細(xì)胞，并聯(lián)合ADM，使用MTT法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果表明，10 mmol·L-12-DG作用于乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3的24、48、72 h 的存活率分別為 80.73%、57.16%、70.10%。ADM作用于乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3的24、48、72 h增殖抑制率分別為 76.89%、76.79%、70.07%。10 mmol·L-12-DG對 0.625 mg·L-1ADM誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3 24、48、72 h的存活率分別為67.18%、67.52%、67.13%。ADM、2-DG與2-DG誘導(dǎo)ADM乳腺癌細(xì)胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見Fig 1。

2.2 2-DG增強ADM誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3凋亡的作用 實驗中對不同因素處理的細(xì)胞進行PI染色，并通過流式細(xì)胞儀分析，觀察藥物誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用，結(jié)果見Fig 2。10 mmol·L-12-DG刺激48h，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞 Sk-Br-3的凋亡率為5.8%(Fig 2B)，與陰性對照組0.16%比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，F(xiàn)ig 2A)。0.4 mg·L-1ADM 誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3 48 h的凋亡率為35.12%(Fig 2C)。10 mmol·L-12-DG 對 0.4 mg·L-1ADM誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3 48 h的凋亡率為58.11%(Fig 2D)，與2A及2B比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。上述表明，2-DG本身并不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但可以增強阿霉素誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡。

Fig 1 MTT conversion after treated with 2-DG，ADM and 2-DG combination with ADMSk-Br-3 cells were incubated with the indicated concentrations of 2-DG，ADM and 2-DG combination with ADM for 24 h，48 h and 72 h.MTT was added the amount of reduced formazan product determined spectrophotometrically.Results are expressed as percent of control non-treated cells.

Fig 2 ADM-induced Sk-Br-3 apoptosis was increased by 2-DGA，B and C show that Sk-Br-3 cells were treated with 2-DG(10 mmol·L-1)，ADM(0.4 mg·L-1)and 2-DG+ADM for 48 h.Sub-G1 populations among the Sk-Br-3 cells were counted by FACS，and the data are expressed as the ˉx± s for the three determinations in triplicate(*P ＜0.05 vs control).

2.3 2-DG增強ADM對乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3的集落克隆形成的抑制作用 為進一步觀察2-DG抑制乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3增殖的作用及對ADM抑制乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3增殖作用的影響，實驗中使用1 mmol·L-12-DG刺激細(xì)胞，并聯(lián)合0.1 mg·L-1ADM，使用集落克隆形成實驗檢測乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3增殖作用的影響。Fig 3中，A、B、C、D分別是空白對照組、1 mmol·L-12-DG、0.1 mg·L-1ADM和1 mmol·L-12-DG+0.1 mg·L-1ADM處理Sk-Br-3細(xì)胞，給藥處理5 d后，20%甲醇-20℃固定10 min，結(jié)晶紫染色。結(jié)果表明，2-DG在低濃度即可明顯抑制Sk-Br-3細(xì)胞的集落克隆形成，并可增強ADM的抑制作用。

Fig 3 2-DG increased the colony formation inhibited effect of ADM on Sk-Br-3 cellsB，C and D:Sk-Br-3 cells were treated with 1 mmol·L-12-DG，0.1 mg·L-1ADM and 1 mmol·L-12-DG+0.1 mg·L-1ADM for five days.

2.4 2-DG增強ADM誘導(dǎo)乳腺癌Sk-Br-3細(xì)胞的Caspase-3激活作用 為觀察2-DG誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3的Caspase-3的活性改變及對ADM誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3的Caspase-3的活性增加的影響，根據(jù)Caspase-3活性試劑盒檢測Caspase-3活性，結(jié)果表明:2-DG刺激細(xì)胞后，并未出現(xiàn)Caspase-3的激活，但2-DG對ADM誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3的Caspase-3激活有明顯的增強作用(P＜0.01)。

2.5 2-DG 對ADM誘導(dǎo)的Sk-Br-3的GRP-78及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 Sk-Br-3給予不同的刺激后收集蛋白，Western blot檢測 GRP-78以及Caspase-3蛋白的表達(dá)，從Fig 5可以看出，2-DG可誘導(dǎo)GRP-78表達(dá)，隨時間延長，GRP-78的表達(dá)不斷增強。2-DG聯(lián)合ADM處理Sk-Br-3細(xì)胞后，可誘導(dǎo)更為明顯的GRP-78的表達(dá)。2-DG本身并未誘導(dǎo)Caspase-3蛋白的表達(dá)，聯(lián)合ADM后激活型的Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加。

3 討論

糖基化抑制劑2-DG的抗腫瘤作用被廣泛關(guān)注，從培養(yǎng)細(xì)胞到實驗動物，以及臨床實驗不斷的開展，并針對單獨抗腫瘤到與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用方面進行探索。同其他腫瘤一樣，乳腺癌必須依賴于對葡萄糖攝取的增加來維持自身的快速增殖。本次研究觀察了2-DG增強ADM抗乳腺癌的作用。從上述的結(jié)果可以看出，2-DG可增加ADM對乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3的增殖抑制作用，增強其誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡;2-DG還可增高ADM誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3的GRP-78表達(dá)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并增強Caspase-3蛋白的表達(dá)。

Fig 4 2-DG enhanced ADM induced activation of casepase-3 in Sk-Br-3Cells treated with 2-DG(10 mmol·L-1)，ADM(0.4 mg·L-1)，2-DG+ADM.Sk-Br-3 cells were treated with 10 mmol·L-12-DG，0.4 mg·L-1ADM，2-DG+ADM for 6 h.Cells were harvested and Caspase-3 activity measured using a spectrophotometric assay according to the manufacturer′s instructions.Control cells were incubated for 6 h in the presence of media only.＊＊P＜0.01 vs 2-DG

Fig 5 Expressions of GRP-78 and Caspase-3 in Sk-Br-3 cellsA:2-DG induced activation of UPR in Sk-Br-3 cells;B:2-DG+ADM induced activation of UPR in Sk-Br-3;C:2-DG activation Caspase-3 in Sk-Br-3 cells.

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP-78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)功能的中心調(diào)節(jié)者，由于其在蛋白質(zhì)折疊、聚集、促進非折疊蛋白降解、ER Ca2+連接和控制ER跨膜感受器的激活等過程中具有重要作用，因此GRP-78的誘導(dǎo)被廣泛用作ER應(yīng)激和UPR啟動的生物標(biāo)記［5-6］。體外研究顯示［7］，腫瘤細(xì)胞程度性地合成GRP-78維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，構(gòu)筑自身防御機制。在生長環(huán)境惡劣的腫瘤微環(huán)境中，乳腺癌細(xì)胞自身發(fā)生ER應(yīng)激激活UPR。給予2-DG時可影響腫瘤細(xì)胞對葡萄糖的攝取，降低ATP的產(chǎn)生，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，2-DG可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的ER應(yīng)激，GRP-78表達(dá)明顯增強，啟動劇烈的UPR。由于ER應(yīng)激的保護作用，削弱了細(xì)胞凋亡反應(yīng)的發(fā)生，因此乳腺癌細(xì)胞對能夠激活UPR的化療藥物介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不敏感。GRP-78的高表達(dá)則是乳腺癌細(xì)胞對ER應(yīng)激途徑的化療藥耐藥的原因之一。可見，2-DG上調(diào) GRP-78的表達(dá)可能是Sk-Br-3細(xì)胞對2-DG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不敏感的原因之一。但必須強調(diào)的是，UPR本身是一種細(xì)胞保護反應(yīng)，但過度的UPR最終啟動細(xì)胞凋亡進程［8］。因此，觸發(fā)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生過強的ER應(yīng)激反應(yīng)，促使UPR保護機制無法產(chǎn)生抗凋亡作用，而激活下游Caspase的活性，實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。本研究中發(fā)現(xiàn)，2-DG本身誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生明顯的ER應(yīng)激反應(yīng)，使得乳腺癌細(xì)胞Sk-Br-3僅出現(xiàn)增殖的抑制，而不誘導(dǎo)明顯的凋亡作用，ER應(yīng)激反應(yīng)可能發(fā)揮保護作用，當(dāng)其與ADM聯(lián)合應(yīng)用時，出現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞凋亡明顯增加，UPR機制并沒有保護腫瘤細(xì)胞免于凋亡。檢測ER應(yīng)激標(biāo)記物的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2-DG與ADM共同作用下，觸發(fā)了更為強烈的ER反應(yīng)，通過檢測凋亡通路中Caspase-3活性的改變，也說明了凋亡的增加。這些結(jié)果說明了過度的ER應(yīng)激可促使UPR從細(xì)胞保護轉(zhuǎn)變成促進凋亡的現(xiàn)象存在。當(dāng)然，關(guān)于ER應(yīng)激的不同程度對腫瘤細(xì)胞的存活的影響尚需更多的實驗進行說明［9］，這也是本研究需要進一步深入探討的問題，而本次研究恰為深入認(rèn)識ER應(yīng)激提供了一定的實驗基礎(chǔ)。

2-DG與葡萄糖結(jié)構(gòu)的差別在于由氫替代第2個碳的羥基。而且2-DG有選擇性地積聚在腫瘤細(xì)胞代謝中，這個可能歸咎于提高了腫瘤細(xì)胞內(nèi)的己糖激酶或細(xì)胞內(nèi)磷酸化活性以及減少細(xì)胞內(nèi)的磷酸鹽的水平［10-11］。葡萄糖類似物2-DG可競爭葡萄糖的轉(zhuǎn)運，抑制其吸收代謝，并降低 ATP產(chǎn)生［11-12］。體外和體內(nèi)的實驗均證實了葡萄糖類似物能抑制腫瘤細(xì)胞的葡萄糖代謝［13］。2-DG已被廣泛研究作為一種可能的靶向治療劑來治療腫瘤，或者用來增強其他抗腫瘤藥物的治療效果［14-15］。乳腺癌和其他腫瘤細(xì)胞一樣，都依賴于增加葡萄糖攝取，以維持細(xì)胞的生長，表現(xiàn)為葡萄糖攝取率增加并且葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)增強。最近的研究表明［11］，干擾糖酵解的非代謝葡萄糖類似物2-DG能通過干預(yù)糖酵解導(dǎo)致細(xì)胞死亡。2-DG能否調(diào)高臨床腫瘤治療療效的研究也在不斷深入，例如，2-DG可通過提高細(xì)胞表面TRAIL-R2的表達(dá)，而增強TRAIL誘導(dǎo)的黑色素瘤細(xì)胞的凋亡［16］;2-DG還具有協(xié)同放射治療增強乳腺癌細(xì)胞死亡的作用。本實驗中發(fā)現(xiàn)了2-DG對乳腺癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用，在聯(lián)合臨床常用抗腫瘤藥物ADM時，證明了其增強ADM誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用。

總之，本研究證實了糖基化抑制劑2-DG對乳腺癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用，但其本身并不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但可明顯增加臨床常用治療乳腺癌細(xì)胞的藥物誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用。其機制可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過度的ER應(yīng)激反應(yīng)，增強Caspase-3活性而發(fā)揮作用。本研究為糖基化抑制劑的臨床應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)，也為增強臨床常用化療藥物療效提供了一個良好的策略。但本實驗中僅選用了體外培養(yǎng)的細(xì)胞株進行觀察，進一步的體內(nèi)外藥效及機制有待深入研究。

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