ErbB2高表達(dá)的人乳腺癌原位移植瘤裸鼠模型的建立

沈國(guó)棟，趙 婷，張安莉，凌 斌，劉 兢，宋禮華，，魏 偉

ErbB2/HER2是細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(EGFR)家族中的重要成員，它在乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤中的高表達(dá)預(yù)示腫瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良，且與放化療、內(nèi)分泌治療抵抗高度相關(guān)［1－3］。由于ErbB2表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的表面，而在成人正常組織中不表達(dá)或者僅有極低表達(dá)，使得它成為一個(gè)良好的藥物靶點(diǎn)。第一個(gè)抗ErbB2的人源化單克隆抗體藥物曲妥珠單抗(trastuzumab，商品名Herceptin)在10余年的臨床治療中展示了獨(dú)特的功效，然而還存在單藥有效率低及大部分初始接受曲妥珠單抗治療有效的病人常在1年內(nèi)產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)象，這促使人們不斷研究與開(kāi)發(fā)針對(duì)ErbB2受體的治療藥物［4］。

本實(shí)驗(yàn)室在國(guó)內(nèi)較早開(kāi)展了這方面工作，對(duì)制備的抗ErbB2鼠源性單克隆抗體A21進(jìn)行人源化改造得到了嵌合抗體chA21，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它具有特異性地抗ErbB2高表達(dá)的腫瘤的作用，并能夠提高腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇等化療藥物的敏感性［5－7］。為了尋找一種適于進(jìn)行chA21等抗體藥物藥效評(píng)價(jià)的人乳腺癌移植瘤模型，本研究分別采用乳房墊內(nèi)原位接種、脅部皮下及腋窩接種3種方法制備了BT-474細(xì)胞的裸鼠移植瘤模型，并對(duì)它們?cè)谀[瘤生長(zhǎng)與ErbB2受體表達(dá)等方面進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 裸鼠(BALB/c-nu/nu)購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào):SCXK(滬)2009－0002，SPF級(jí)，32只，♀4～5周齡;飼養(yǎng)于中國(guó)科技大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房中，按中國(guó)科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞系 人乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌細(xì)胞株BT-474，購(gòu)自美國(guó)ATCC，接種前經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其細(xì)胞表面高表達(dá)ErbB2受體。

1.3 試劑 免疫組化方法檢測(cè)用的ErbB2試劑盒HercepT-est購(gòu)于丹麥Dako公司，BrdU、VEGF試劑盒購(gòu)于北京中杉公司，Ki-67、CD31、CD34試劑盒購(gòu)于武漢博士德公司;17β雌二醇60天緩釋片購(gòu)于美國(guó)IRA公司;matrigel膠購(gòu)于德國(guó)BD公司;RPMI 1640培養(yǎng)液及胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。

1.4 腫瘤細(xì)胞接種 36只裸鼠隨機(jī)分為乳房墊內(nèi)原位接種和脅部皮下接種二組，接種前1 d均在頸部皮下埋植0.5 mg 17β雌二醇緩釋片，然后將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BT-474細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，以無(wú)血清1640培養(yǎng)液洗滌，調(diào)整活細(xì)胞濃度為5×1010·L－1，取0.1 ml細(xì)胞懸液與matrigel膠1 ∶1 混勻后，分別接種于裸鼠左側(cè)第二乳房墊內(nèi)或者脅部皮下，次日記為接種第1天。

1.5 腫瘤體積測(cè)量與給藥處理 腫瘤細(xì)胞接種后，每周2次用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑(L)和短徑(W)，腫瘤體積(TV)的計(jì)算公式為:TV=0.5×L×W2。計(jì)算每組裸鼠的移植瘤體積平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差。為考察制備的裸鼠原位移植瘤模型對(duì)抗ErbB2抗體處理的反應(yīng)，在腫瘤細(xì)胞接種第2周后荷瘤裸鼠隨機(jī)分為3組，每組7只，分別按下述方法給藥處理:生理鹽水對(duì)照組注射劑量為10 g·kg－1，曲妥珠單抗組注射劑量為20 mg·kg－1，chA21組注射劑量為30 mg·kg－1，紫杉醇組注射劑量為10 mg·kg－1，各組均采用尾靜脈注射給藥，除紫杉醇組給藥頻率是每周1次外，其余組為每周2次，連續(xù)5周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱量各組裸鼠所荷腫瘤質(zhì)量。

1.6 免疫組化檢測(cè)與結(jié)果判斷 自全部成瘤日起每2周處死3只裸鼠，摘取移植瘤，福爾馬林固定，石蠟包埋，進(jìn)行免疫組化染色SP法，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。每張切片按試劑盒說(shuō)明書(shū)加入適當(dāng)比例的一抗如ErbB2(即用型)、Ki-67(1 ∶100)、VEGF(即用型)、CD31(1 ∶100)等抗體，并用 PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。二抗采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，然后加新鮮配制的DAB溶液進(jìn)行顯色。ErbB2染色結(jié)果判定根據(jù)美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ASCO)和美國(guó)病理家協(xié)會(huì)(CAP)2007年發(fā)布的《ErbB2檢測(cè)臨床實(shí)踐指南》標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞膜棕黃色的染色結(jié)果被分為0～+++(四級(jí)):染色為+++，即＞30%浸潤(rùn)性癌細(xì)胞膜呈全周的強(qiáng)著色代表ErbB2陽(yáng)性表達(dá);染色為，即指至少10%腫瘤細(xì)胞有完整的胞膜染色，但是不均勻或強(qiáng)度較弱代表結(jié)果不確定;染色為0或+，即任何比例的腫瘤細(xì)胞有微弱的、不完整的膜染色或無(wú)著色代表ErbB2陰性表達(dá)。Ki-67、VEGF標(biāo)記結(jié)果根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，以切片中細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。CD31標(biāo)記微血管，參考文獻(xiàn)［8］的判斷標(biāo)準(zhǔn)，凡呈現(xiàn)棕色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 12.0處理;方差分析后進(jìn)行q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 成瘤率和成瘤時(shí)間 采用乳房墊內(nèi)原位接種的裸鼠1周后全部長(zhǎng)出體積大于100 mm3的腫瘤，且形狀、大小較整齊;而脅部皮下與腋窩接種的裸鼠1周后的成瘤率雖然也為100%，但形狀和大小不一致，腫瘤平均體積也明顯小于原位組(P ＜0.05，F(xiàn)ig 1)。

2.2 腫瘤生長(zhǎng)曲線 3組裸鼠均從接種后1周起，統(tǒng)計(jì)每周的腫瘤體積做腫瘤生長(zhǎng)曲線。如Fig 2所示，乳房墊內(nèi)原位接種的裸鼠移植瘤第1周至第2周生長(zhǎng)平穩(wěn)，從第3周起生長(zhǎng)迅速，且所有腫瘤生長(zhǎng)速度較一致;相比而言，脅部皮下與腋窩接種7周后的腫瘤平均體積明顯小于原位組(P＜0.05)，而且組內(nèi)腫瘤體積差異很大，提示這兩種方法接種形成的腫瘤生長(zhǎng)速度不一致。

2.3 腫瘤的病理組織學(xué)特點(diǎn) 3組移植瘤切面均為灰白色、半透明、質(zhì)實(shí)的實(shí)性區(qū)。HE染色后觀察，組織內(nèi)微血管多見(jiàn)，腫瘤細(xì)胞大，不規(guī)則團(tuán)塊狀排列，細(xì)胞胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核大小不一，深染，核分裂相多見(jiàn)，核仁清楚(Fig 3 HE);進(jìn)一步采用免疫組化染色方法對(duì)腫瘤切片中細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67及新生血管標(biāo)記分子VEGF與CD31進(jìn)行了檢測(cè)，代表性結(jié)果如Fig 3所示，Ki-67、VEGF與CD31分子均呈陽(yáng)性表達(dá)，提示移植瘤具有細(xì)胞增殖活躍、血管生成能力強(qiáng)的特點(diǎn)。通過(guò)對(duì)這些標(biāo)記分子的量化分析，結(jié)果如Fig 4所示，原位組移植瘤組織中VEGF表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯高于脅部皮下和腋窩組(P＜0.05)，Ki-67表達(dá)的細(xì)胞數(shù)與微血管密度(microvessel density，MVD)雖和脅部皮下及腋窩組之間的差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，但標(biāo)準(zhǔn)方差明顯增加，提示原位組腫瘤和對(duì)照組相比，其病理組織學(xué)特點(diǎn)也更為一致。

Fig 1 The xenograft volume of BT-474 cell inoculation by three methods after 1 week

Fig 2 Tumor growth curve of BT-474 xenografts prepared by three methods*P＜0.05 vs flank or axilla group

Fig 3 The pathological observation of BT-474 xenografts

Fig 4 Quantification of expression of Ki-67，VEGF and MVD of BT-474 xenografts prepared by two methods*P＜0.05 vs flank or axilla group

2.4 腫瘤的ErbB2表達(dá)情況及對(duì)治療藥物的反應(yīng) 對(duì)3組移植瘤的ErbB2表達(dá)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，光學(xué)顯微鏡下觀察免疫組化染色的移植瘤切片，可見(jiàn)ErbB2陽(yáng)性染色細(xì)胞膜定位準(zhǔn)確，條狀棕色或深棕色帶清晰環(huán)繞整個(gè)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜(Fig 5)。根據(jù)材料與方法中描述的ErbB2表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)予以評(píng)分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3組移植瘤組織ErbB2表達(dá)均為陽(yáng)性(染色為+++)，且在動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)期間表達(dá)穩(wěn)定，提示我們制備的BT-474細(xì)胞移植瘤保持了ErbB2陽(yáng)性表達(dá)的生物學(xué)特性。為考察制備的裸鼠原位移植瘤模型對(duì)抗ErbB2抗體處理的反應(yīng)，我們?cè)谌巳橄侔┞闶笤灰浦擦瞿Ｐ蜕戏謩e進(jìn)行了抗ErbB2抗體曲妥珠單抗和chA21的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，連續(xù)給藥5周后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)chA21、曲妥珠單抗和紫杉醇處理組的腫瘤質(zhì)量分別是注射生理鹽水對(duì)照組質(zhì)量的63%、42%及19%，單藥處理組與對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，F(xiàn)ig 6);表明制備的裸鼠原位移植瘤模型對(duì)治療藥物有著良好的反應(yīng)性，適合我們進(jìn)行工程抗體chA21等藥物的藥效評(píng)價(jià)。

Fig 5 ErbB2-positive expression of BT-474 xenografts by IHC method

3 討論

Fig 6 Decreased weight of BT-474 xenografts treated by chA21，PTX or TraPTX:paclitaxel;Tra:trastuzumab.＊＊P＜0.01 vs control

裸鼠是一種先天性T、B細(xì)胞功能缺陷的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有移植瘤容易成活、價(jià)格相對(duì)便宜等優(yōu)點(diǎn)，而成為目前最常使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。在多數(shù)裸鼠移植瘤保持原發(fā)腫瘤特性的同時(shí)，研究也發(fā)現(xiàn)有少數(shù)移植瘤生物學(xué)特性發(fā)生了改變，如人肺癌移植瘤與原發(fā)腫瘤相比，α1-抗胰蛋白酶、促腎上腺皮質(zhì)激素、鐵蛋白、癌胚抗原、降鈣素等標(biāo)記物丟失［9］。雖然采用BT-474細(xì)胞株建立的荷瘤裸鼠模型已有報(bào)道［10］，但其細(xì)胞接種部位為頸部皮下，而此部位同時(shí)需要埋置雌激素緩釋片，從而影響移植瘤的生長(zhǎng)及其體積的測(cè)量;另外該部位與人乳腺癌發(fā)生的微環(huán)境也相差甚遠(yuǎn)，為此我們采用乳房墊內(nèi)原位接種BT-474細(xì)胞建立了人乳腺癌裸鼠移植瘤模型，并以脅部皮下和腋窩兩種接種部位作為對(duì)照，對(duì)其移植瘤的生長(zhǎng)速度、一致性及ErbB2表達(dá)等特點(diǎn)作了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳房墊內(nèi)原位組比對(duì)照組的移植瘤生長(zhǎng)更為快速、一致，且高表達(dá)ErbB2的生物學(xué)特性保持穩(wěn)定。鑒于Ki-67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，Ki-67陽(yáng)性表達(dá)表明癌細(xì)胞增殖活躍［11］;而血管生成使腫瘤能夠獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是促成腫瘤快速生長(zhǎng)與侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［12－13］;通過(guò)對(duì)各組移植瘤上述標(biāo)志物表達(dá)的比較，結(jié)果證實(shí)原位接種形成的移植瘤病理組織學(xué)的一致性也好于對(duì)照。

實(shí)際建模過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)為了建立成瘤率高、成瘤齊、腫瘤大小一致的荷瘤裸鼠，還要注意以下幾點(diǎn):(1)激素水平:BT-474為人乳腺癌細(xì)胞株，因此選用♀裸鼠，但BT-474細(xì)胞株需要與matrigel膠混勻接種及外源添加雌激素才能在裸鼠體內(nèi)成瘤;然而在雌激素藥物的選擇上也要多加注意，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苯甲酸雌二醇、戊酸雌二醇及己烯雌酚等短效雌激素雖能促進(jìn)BT-474移植瘤生長(zhǎng)，但不容易掌握給藥劑量與時(shí)間間隔，血藥濃度低則達(dá)不到促進(jìn)生長(zhǎng)的效果，高了易造成小鼠靶器官中毒甚至導(dǎo)致死亡。參照文獻(xiàn)［10］方法，在裸鼠頸部皮下埋置0.72 mg 17β雌二醇60 d緩釋片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該劑量緩釋片埋置1個(gè)月后可致小鼠出現(xiàn)體重下降，影響藥物安全性評(píng)價(jià);研究發(fā)現(xiàn)埋置的17β雌二醇60 d緩釋片劑量減至0.5 mg效果更好。(2)動(dòng)物年齡:裸鼠并非毫無(wú)免疫力，與普通小鼠相比甚至有更高的NK細(xì)胞比例，且其N(xiāo)K細(xì)胞數(shù)隨年齡增長(zhǎng)而增加，4～5周齡NK細(xì)胞開(kāi)始顯示細(xì)胞殺傷作用，至4～5月齡達(dá)到高峰［14］。因而選擇5周左右的裸鼠腫瘤移植成功率較高。(3)實(shí)驗(yàn)環(huán)境:裸鼠接觸到病原微生物可能造成感染死亡，病毒、細(xì)菌等抗原刺激可能激活非T細(xì)胞依賴免疫活性造成移植成功率降低，因此飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要嚴(yán)格無(wú)菌操作。(4)接種部位:不同接種部位成瘤率不同，本研究通過(guò)對(duì)裸鼠脅部皮下、腋窩以及乳房墊3個(gè)接種部位的比較，發(fā)現(xiàn)BT-474細(xì)胞接種于乳房墊內(nèi)效果最好，具有成瘤早、生長(zhǎng)快且形狀均勻等優(yōu)點(diǎn)，這可能和乳房墊具有天然的囊狀結(jié)構(gòu)以及微血管豐富等特點(diǎn)有關(guān)。

綜上所述，我們建立了ErbB2高表達(dá)的人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型，這為工程抗體chA21等治療藥物進(jìn)行藥理作用的研究提供了一個(gè)很好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

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