三七總皂苷對血管平滑肌細胞遷移的抑制作用及機制探討

蘇 明，溫進坤，鄭 斌，李會宣，2，劉 莎，付建然，張 靜，韓 梅

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的遷移是動脈粥樣硬化、高血壓以及冠狀動脈血管成形術后再狹窄等心血管疾病的重要病理基礎。在各種因素的刺激下，血管內(nèi)皮細胞功能紊亂和內(nèi)皮損傷、炎性細胞浸潤并釋放大量致炎因子和生長因子，誘導VSMC的遷移。因此，設計并應用藥物阻斷VSMC的遷移，是治療心血管疾病的重要策略。

三七總皂苷(total panax notoginseng saponins，tPNS)是三七中含有的主要有效成分，包括人參皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1)、人參皂苷 Rg1(Ginsenoside Rg1)和三七皂苷R1(Notoginsenoside R1)等。研究證明，tPNS及其單體成分具有抑制心肌細胞肥大和對缺血/再灌損傷的保護作用［1-2］?；赩SMC遷移在動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，本研究重點檢測tPNS對體外培養(yǎng)的VSMC遷移的影響，并探討其作用的分子機制，為該藥在臨床中的應用提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 三七總皂苷 三七總皂苷(血栓通注射液)由廣東麗珠制藥利民公司生產(chǎn)，批號:0903029，質量濃度:35 g·L-1

1.2 細胞培養(yǎng) 選取80～100 g清潔級♂ SD大鼠，取胸主和腹主動脈血管中膜用貼塊法分離、培養(yǎng)VSMC。細胞在含體積分數(shù)為10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中生長至融合后，胰蛋白酶消化傳代，取3～5代細胞進行實驗。各組于實驗前換用含2%FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后進行以下實驗。

1.3 傷口愈合實驗 將各組VSMC接種于玻片上，待細胞生長至完全匯合后血清饑餓24 h，取出玻片，用無菌吸頭在玻片上劃痕。PBS洗凈被刮下的細胞后，分別將玻片置于含tPNS不同濃度梯度(0、175、350、700 mg·L-1)的培養(yǎng)液中，以不加tPNS刺激組為對照，在倒置顯微鏡下照相。繼續(xù)孵育24 h后取出，進行固定和結晶紫染色，于低倍鏡下觀察細胞傷口愈合情況。任取3個視野，計數(shù)遷移細胞的數(shù)量，以此表示細胞的遷移活性。

1.4 總RNA提取及RT-PCR 采用TRIzol從VSMC中提取總RNA。取等量RNA進行逆轉錄反應，并使用以下特異性引物進行PCR擴增鑒定:MMP-2 上游引物 5′-GCAACCACAACCAACTACGA-3′，下游引物 5′-CTGTCCGCCAAATAAACCGAT-3′;MMP-9 上游引物 5′-AACCCTGCGTATTTCCAT-3′，下游引物 5′-GCTGTACCCTTGGTCTGG-3′;OPN 上游引物 5′-CCGATGAGGCTATCAAGGTC-3′，下游引物 5′-ACTGCTCCAGGCTGTGTGTT-3′;GAPDH 上 游 引 物5′-CCCACGGCAAGTTCAACGGCA-3′，下游引物 5′-TGGCAGGTTTCTCCAGGCGGC-3′。

擴增條件:PCR 反應體系為 20 μl，包括 1 μl逆轉錄產(chǎn)物，上、下游引物(10 pmol)各取 2 μl，dNTP(2 mmol·L-1)1 μl，10 × PCR 反應緩沖液 2 μl，Taq DNA 聚合酶(5 U·μl-1)0.2 μl，無菌水補齊至 20 μl。

MMP-2:94℃預變性5 min，而后94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃ 延伸 35 s，30 個循環(huán)。再 72℃延伸10 min，擴增片段長度為369 bp。

MMP-9:94℃預變性 5 min，94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，30 個循環(huán)，之后 72℃延伸10 min，擴增片段長度為326 bp。

OPN:94℃預變性5 min，而后94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)之后，72℃再延伸 10 min，擴增片段長度為 135 bp［3］。

以GAPDH為內(nèi)參照，擴增產(chǎn)物為606 bp。PCR擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，掃描成像，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行密度分析。

1.5 明膠酶譜分析 本實驗采用明膠酶譜法檢測MMP-2及MMP-9的活性。經(jīng)細胞計數(shù)標定后，分別取等量各組VSMC的培養(yǎng)液，在含2 mg·L-1明膠(Sigma)的SDS-PAGE中以4℃條件下恒壓(120 V)電泳2～2.5 h。

電泳結束后，凝膠經(jīng)25 ml·L-1Triton X-100(Sigma)漂洗3次，每次15 min，之后換為反應緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol·L-1NaCl，10 mmol·L-1CaCl2)，37℃孵育 9 h。

反應結束后，棄去反應緩沖液，經(jīng)考馬斯亮藍染色和脫色后，采用凝膠成像系統(tǒng)進行密度掃描和相對定量分析。

1.6 Western blot分析 樣品采集及處理同上述明膠酶譜分析，經(jīng)SDS-PAGE恒壓電泳(120 V)、半干式恒壓(20 V)電轉膜、脫脂奶粉封閉后用特異性抗OPN兔多克隆抗體(Santa Cruz)于4℃下孵育過夜，之后用特異性二抗(Santa Cruz)室溫孵育2 h。洗膜后用化學發(fā)光試劑盒檢測抗體結合區(qū)帶。采用成像分析軟件對顯色區(qū)帶的信號強度進行相對定量分析。

1.7 統(tǒng)計學處理 上述實驗均重復3次，取其均值。計量資料以±s表示，所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行處理，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One way ANOVA)。

2 結果

2.1 三七總皂苷抑制VSMC遷移 傷口愈合實驗結果顯示，tPNS濃度在175、350和700 mg·L-1時，VSMC遷移活性較對照組降低(P＜0.05，F(xiàn)ig 1)。

2.2 三七總皂苷抑制MMP-2，MMP-9和OPN的表達和活性 MMP-2和MMP-9在VSMC遷移中發(fā)揮著重要的作用，為了闡明tPNS抑制VSMC遷移是否與抑制MMP-2及MMP-9活性有關，本研究通過RT-PCR和明膠酶譜分析分別檢測了酶基因的表達和酶活性。RT-PCR結果顯示，tPNS抑制MMP-2和MMP-9的表達(P＜0.05，F(xiàn)ig 2)。明膠酶譜分析顯示，MMP-2和MMP-9的酶活性在相同處理條件下隨tPNS劑量的增加呈降低趨勢(Fig 3)。tPNS對黏附分子OPN表達的影響與MMP-2及MMP-9相似(Fig 2，4)。這些結果提示，tPNS通過抑制黏附分子表達和基質降解而抑制VSMC遷移活性。

Fig 1 The effect of tPNS on VSMC migration

3 討論

動脈粥樣硬化、高血壓、血管成形術后再狹窄等臨床常見心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展與動脈管腔狹窄密切相關。大多數(shù)血管管腔狹窄都伴有新生內(nèi)膜的增厚和血管壁的重塑［4］。當各種因素造成血管內(nèi)皮損傷時，中膜的VSMC因失去內(nèi)皮細胞保護而直接暴露于高濃度血清中，促使VSMC發(fā)生表型轉化，即由收縮型轉化為合成型。同時血管局部損傷部位募集的炎癥細胞，釋放炎癥因子，促使VSMC的遷移并合成大量的細胞外基質，導致血管管腔狹窄［5-6］。因此，抑制VSMC遷移的藥物在心血管疾病的防治中具有重要意義。

Fig 2 RT-PCR analysis for expression of MMP-2，MMP-9 and OPN in VSMCsA，B:RT-PCR;C:Densitometric scanning，*P ＜0.05 vs 0 mg·L-1 group;D:Densitometric scanning，*P ＜0.05 vs 0 h group

Fig 3 The effects of tPNS on MMP-2 and MMP-9 activity in VSMCsA:Zymography;B:Densitometric scanning.*P ＜0.05 vs 0 mg·L-1tPNS group

Fig 4 The effects of tPNS on OPN expression in VSMCsA:Western blot analysis;B:Densitometric scanning.*P＜0.05 vs 0 mg·L-1tPNS group

tPNS是由五加科植物三七中提取出來的藥用成分，是活血化瘀藥物。tPNS具有活血化瘀，通脈活絡，降低血糖，調(diào)節(jié)血脂，抗氧化和抗動脈粥樣硬化等藥理作用。有研究表明［7］，人參皂苷Rg1能抑制小腸平滑肌收縮。當血管內(nèi)皮受到各種損傷因素作用后，各種生長因子和細胞因子等刺激VSMC，促使VSMC合成并釋放大量的 OPN［8-9］、MMP-2和MMP-9等成分［10］。這些蛋白水解酶和細胞外基質成分可以促進VSMC由中膜遷移至內(nèi)膜，并導致新生內(nèi)膜的增厚和管腔狹窄。有研究發(fā)現(xiàn)，在心血管疾病中，血清MMP-9水平與冠心病發(fā)病率之間有相關性［11］，血清 MMP-2、MMP-9 和 OPN 水平與 PCI術后再狹窄相關［12-13］。因此MMP-2和MMP-9與心血管疾病密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)，tPNS可抑制VSMC的遷移作用。為探明tPNS抑制VSMC遷移的機制，檢測tPNS對遷移相關基因MMP-2、MMP-9和OPN的表達的影響。RT-PCR結果顯示，tPNS呈劑量和時間依賴性地抑制MMP-2、MMP-9及OPN基因的表達水平。明膠酶譜分析及Western blot分析表明，tPNS降低MMP-2及MMP-9的活性和OPN蛋白的水平。因此tPNS抑制體外培養(yǎng)VSMC遷移的作用與其抑制MMP-2和MMP-9的活性以及OPN基因的表達有關。

綜上所述，tPNS具有抑制VSMC遷移的作用，該作用與抑制遷移相關蛋白OPN、MMP-2和MMP-9的表達有關。

［1］王英婷，黃燮南，王風安，等.人參皂苷Rg1抑制PGF_(2α)誘導心肌細胞肥大［J］.中國藥理學通報，2008，24(5):611-5.

［1］Wang Y T，Huang X N，Wang F A，et al.Ginsenoside Rg1 inhabits cardiomyocyte hypertrophy induced by prostaglandin F_(2α)［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(5):358-61.

［2］李 茜，張彥敏，關 玥，等.人參皂苷Rg1對大鼠腸缺血/再灌注損傷的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(3):358-61.

［2］Li Q，Zhang Y M，Guan Y，et al.Effect of ginsenoside Rg1 on gut injury following intestinal ischemia reperfusion in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(3):358-61.

［3］Chidlow G，Wood J P，Manavis J，et al.Expression of osteopontin in the rat retina:effects of excitotoxic and ischemic injuries［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49(2):762-71.

［4］Rudijanto A.The role of vascular smooth muscle cells on the pathogenesis of atherosclerosis［J］.Acta Med Indones，2007，39:86-93.

［5］Li J，Zhu X，Chen M，et al.Myocardin related transcription factor B is required incardiac neural crest for smooth muscle differentiation and cardiovascular development［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(25):8916-21.

［6］Zhang Y H，F(xiàn)ang L H，Ku B S.Fangchinoline inhibits rat aortic vascular smooth muscle cell proliferation and cell cycle progression through inhibition of ERK1/2 activation and c-fos expression［J］.Biochem Pharmacol，2003，66(9):1853-60.

［7］李 茜，馬會杰，關 玥，等.人參皂苷Rg1對家兔離體小腸平滑肌自發(fā)收縮活動的影響［J］.中國藥理學通報，2009，10:1350-3.

［7］Li Q，Ma H J，Guan Y，et al.Influences of ginsenoside Rg1 on spontaneous contraction of small intestine smooth muscle of rabbits in vitro［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(10):1350-3.

［8］Li G H，Chen Y F，Stacey S K，et al.Estrogen attenuates integrin-β 3-dependent adventitial fibroblast migration after inhibition of osteopontin production in vascular smooth muscle cell［J］.Circulation，2000，101(25):2949-55.

［9］Li J J，Han M，Wen J K，et al.Osteopontin stimulates vascular smooth muscle cell migration by inducing FAK phosphorylation and ILK dephosphorylation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，356(1):13-9.

［10］Hlawaty H，San Juan A，Jacob M P，et al.Inhibition of MMP-2 gene expression with small interfering RNA in rabbit vascular smooth muscle cells［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293(6):3593-601.

［11］Welsh P，Whincup P H，Papacosta O，et al.Serum matrix metalloproteinase-9 and coronary heart disease:a prospective study in middle-aged men［J］.QJM，2008，101(10):785-91.

［12］Katsaros K M，Kastl S P，Zorn G，et al.Increased restenosis rate after implantation of drug-eluting stents in patients with elevated serum activity of matrix metalloproteinase-2 and-9［J］.JACC Cardiovasc Interv，2010，3(1):90-7.

［13］Cho H J，Cho H J，Kim H S.Osteopontin:a multifunctional protein at the crossroads of inflammation，atherosclerosis，and vascular calcification［J］.Curr Atheroscler Rep，2009，11(3):206-13.