染料木素促成骨樣細胞增殖作用及其機制研究

牛銀波，李宇華，黃海濤，孔祥鶴，王婷梅，梅其炳，

目前，在骨質(zhì)疏松防治研究領(lǐng)域，通過刺激骨形成防治骨質(zhì)疏松已成為研究的熱點［1］。染料木素是大豆異黃酮的主要成份，研究表明［2］染料木素具有抗骨質(zhì)疏松的作用，它在抑制骨吸收的同時還可以促進骨形成。

研究表明［3-4］，在骨形成過程中骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)及 Wnt/βcatenin信號通路發(fā)揮著極其重要的調(diào)控作用。BMP-2可促進骨形成和成骨細胞分化［5］。Wnt/βcatenin信號通路中的關(guān)鍵核心分子β-catenin在胞質(zhì)中積聚轉(zhuǎn)入核內(nèi)時，可促進體外成骨細胞發(fā)育及體內(nèi)的骨形成［6］。因此，本研究通過不同濃度染料木素對成骨樣細胞增殖作用的影響及對BMP-2和β-catenin表達的影響，初步探討染料木素防治骨質(zhì)疏松癥的機制。

1 材料

1.1 藥物和試劑 染料木素(純度為98%)購于西安斯諾特生物技術(shù)有限公司，雌激素(β-estradiol，E2，純度為98%)購于 Sigma公司，小鼠MC3T3-E1成骨樣細胞株購自中國科學院上海生化細胞所細胞庫，DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(四季青生物制劑公司)，胰蛋白酶、EDTA、二甲基亞砜(DMSO)，MTT(均購于 Sigma公司)，ALP試劑盒(南京建成生物公司)，BMP-2(Bio worlde公司)，β-catenin及 β-actin抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 實驗分組 實驗分為對照組(Control組)，雌激素組(E2，1 ×10-9mol·L-1的雌激素)，染料木素各組(1 ×10-10、1 ×10-9、1 ×10-8、1 ×10-7、1 ×10-6和1×10-5mol·L-1)，分別按濃度配制成相應含藥培養(yǎng)液備用。

2 方法

2.1 MTT法檢測細胞增殖率 取生長良好、處于對數(shù)增生期的MC3T3-E1細胞以5×106·L-1的密度接種于96孔板內(nèi)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，使細胞充分貼壁。隨機分組處理，分別加入含1×10-9mol·L-1雌激素和不同濃度染料木素(1 ×10-10、1 ×10-9、1 ×10-8、1 ×10-7、1 ×10-6和 1×10-5mol·L-1)的培養(yǎng)液 200 μl，對照組僅加入200 μl的含0.54‰ DMSO的培養(yǎng)液，同時設(shè)置空白組用于調(diào)零，空白組未接種細胞，僅加入200 μl的DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)5個平行孔。將96孔板置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h。取出培養(yǎng)板，每孔加入5 g·L-1MTT溶液20 μl，再繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)。棄去存留的孵育液，每孔加入150 μl的DMSO，于微量振蕩儀上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標儀上檢測各孔570 nm波長的吸光度。計算細胞增殖率:

2.2 堿性磷酸酶(ALP)活性測定 24孔板每孔接種1×108·L-1細胞，細胞貼壁后換含1×10-9mol·L-1雌激素和不同濃度染料木素(1×10-10、1×10-9、1 ×10-8、1 × 10-7、1 × 10-6和 1 × 10-5mol·L-1)的培養(yǎng)液。加藥24和48 h后，按照堿性磷酸酶測定試劑盒說明進行操作，采用DU800型紫外分光光度計測定各組520 nm處吸光度，計算ALP活力單位，同時測定每個樣品的蛋白含量，結(jié)果用U·mg-1Pro表示。

2.3 Western blot測定 BMP-2 和 β-catenin 的表達 將對照組和染料木素各組(1×10-9、1×10-8和1×10-7mol·L-1)的細胞用細胞刮收集后加入RIPA(含PMSF蛋白酶抑制劑)細胞裂解液提取總蛋白，用Bio-Rad酶標儀進行蛋白定量。蛋白變性后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。NC膜用5%脫脂牛奶室溫封閉3 h，依次加兔抗BMP-2(1∶500)、βcatenin(1∶200)及鼠抗β-actin(1∶500)一抗室溫孵育30 min后4℃過夜，TBST洗膜后加1∶5 000稀釋的相應HRP標記二抗，室溫孵育1 h，TBST及TBS洗膜后，進行化學發(fā)光。發(fā)光條帶進行灰度分析以觀察各蛋白表達水平的變化。

2.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件中的方差分析(ANOVA)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

3 結(jié)果

3.1 MTT細胞增殖試驗檢測染料木素的促細胞增殖效應 MC3T3-E1細胞經(jīng)雌激素和不同濃度染料木素處理后，MTT法測各組A值。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，1×10-8、1×10-7、1 ×10-6和 1×10-5mol·L-1的染料木素作用于細胞24 h后均能促進成骨樣細胞增殖(P＜0.05或P＜0.01)，染料木素作用于細胞48和72 h后，各濃度染料木素(1×10-10、1 ×10-9、1 ×10-8、1 ×10-7、1 ×10-6和 1 ×10-5mol·L-1)均能促進成骨樣細胞增殖(P＜0.05或 P ＜0.01)，見Fig 1。

3.2 不同濃度的染料木素對成骨樣細胞ALP活性的影響 染料木素作用于細胞24和48 h后，1×10-10mol·L-1濃度組與對照組相比ALP含量無明顯變化(P＞0.05)，但隨著濃度的升高，染料木素組ALP含量水平均升高，1×10-9、1×10-6和1×10-5mol·L-1濃度組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);1×10-8、1 ×10-7mol·L-1濃度組與對照組相比差異有顯著性(P＜0.01)，見Fig 2。

3.3 染料木素對 MC3T3-E1細胞 BMP-2和 βcatenin蛋白表達的影響 不同濃度染料木素(1×10-9、1 ×10-8和1 ×10-7mol·L-1)培養(yǎng) MC3T3-E1細胞48 h后，通過Western blot檢測MC3T3-E1細胞BMP-2和β-catenin蛋白的表達。結(jié)果表明，染料木素可使細胞中BMP-2和β-catenin表達水平升高，且呈濃度依賴性變化，見Fig 3。

Fig 1 Effect of genistein on the proliferation of MC3T3-E1 cells(n=5)*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Fig 2 Effect of genistein on the ALP of MC3T3-E1 cells(n=3)*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

4 討論

雌激素雖然能有效地防止老年或絕經(jīng)婦女的骨丟失，保持骨量，減少骨折發(fā)生，但同時也增加了用藥者乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌等的患病風險［7］。因此，尋找天然物質(zhì)進行替代治療，降低治療帶來的副作用十分必要。染料木素是豆類及其制品中含量較多的一種植物雌激素，其結(jié)構(gòu)與雌激素相似，同時它具有抗骨質(zhì)疏松的作用，在抑制骨吸收的同時還可以促進骨形成［8］。

成骨細胞是間質(zhì)起源的單個核細胞，是骨形成的主要功能細胞，負責骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化［9］。ALP是成骨細胞分化時所分泌的酶，是其分化和功能的標志，ALP的活性反映了成骨細胞的成骨活性［10］。本實驗結(jié)果表明，不同濃度染料木素作用于成骨樣細胞MC3T3-E1后可促進成骨樣細胞增殖和分化，其促成骨細胞增殖分化作用雖弱于雌激素，但對子宮的副作用明顯弱于雌激素［7，11］。BMPs可誘導骨髓基質(zhì)干細胞分化為成骨細胞，現(xiàn)已證明，BMPs參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡，在成骨細胞的分化過程中發(fā)揮的作用尤為重要［12］。大量臨床前及臨床研究表明重組的BMPs可以促進動物和人的骨組織再生。目前，BMP-2已經(jīng)獲準臨床使用。本實驗結(jié)果顯示染料木素可促進BMP-2表達。Wnt/β-catenin信號通路在骨形成和骨代謝過程中發(fā)揮著極其重要的調(diào)控作用，其通路中的關(guān)鍵分子GSK3β的底物 β-catenin在胞質(zhì)中積聚并穿梭進入核內(nèi)時，可刺激Wnt信號下游一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮調(diào)控細胞生長，促進體外成骨細胞發(fā)育及體內(nèi)的骨形成［13-14］。染料木素可以上調(diào)β-catenin的表達。表明染料木素可同時通過BMP-2和Wnt/β-catenin信號通路促進成骨樣細胞增殖與分化。

Fig 3 Effect of genistein on protein level of β-catenin and BMP-2 in MC3T3-E1 cells(n=3)*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

綜上所述，染料木素具有促成骨樣細胞增殖、分化的作用，其與 BMP-2和 Wnt/β-catenin信號通路的激活密切相關(guān)。這將為染料木素開發(fā)成新型抗骨質(zhì)疏松藥物提供實驗依據(jù)。

［1］Canalis E，Giustina A，Bilezikian J P.Mechanisms of anabolic therapies for osteoporosis［J］.N Engl J Med，2007，357(9):905-16.

［2］季煜華，曾耀英，俞 瑜.染料木黃酮對生長板軟骨細胞膠原合成的影響及其機制［J］.中國藥理學通報，2006，22(8):927-9.

［2］Ji Y H，Zeng Y Y，Yu Y.The effect and mechanism of genistein on collagen synthesis of growth plate chondrocytes［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(8):927-9.

［3］Krishnan V，Bryant H U，MacDougald O A.Regulation of bone mass by Wnt signaling［J］.J Clin Invest，2006，16(5):1202-9.

［4］Bennett C N，Longo K A，Wright W S，et al.Regulation of osteoblastogenesis and bone mass by Wnt10b［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(9):3324-9.

［5］Canalis E，Economides A N，Gazzerro E.Bone morphogenetic proteins，their antagonists，and the skeleton［J］.Endocr Rev，2003，24(2):218-35.

［6］Kulkarni N H，Onyia J E，Zeng Q，et al.Orally bioavailable GSK-3alpha/beta dual inhibitor increases markers of cellular differentiation in vitro and bone mass in vivo［J］.J Bone Miner Res，2006，21(6):910-20.

［7］Rossouw J E，Anderson G L，Prentice R L，et al.Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy post-menopausal women:principal results from the women′s health initiative randomized controlled trial［J］.J Am Med Assoc，2002，288(3):321-33.

［8］Wong R W，Rabie A B.Effect of genistein on bone formation［J］.Front Biosci(Elite Ed)，2010，2:764-70.

［9］徐昌水，梁尚棟.骨骼系統(tǒng)P2受體的功能與炎癥性骨疾?。跩］.中國藥理學通報，2009，25(4):429-33.

［9］Xu C S，Liang S D.Function of P2 receptors in skeletal system and inflammatory disease of bone［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(4):429-33.

［10］范煥瓊，崔 燎.丹酚酸B對體外培養(yǎng)新生大鼠顱骨成骨細胞的影響［J］.中國藥理學通報，2008，24(7):978-9.

［10］Fan H Q，Cui L.Effects of salvianolic acid B on osteoblast in vitro［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(7):978-9.

［11］楊麗娜 ，段 穎 ，張英福，等.雌激素及植物雌激素對去卵巢大鼠子宮組織VEGF表達和形態(tài)的影響［J］.中國藥理學通報，2009，25(8):1041-4.

［11］Yang L N，Duan Y，Zhang Y F，et al.Effects of estrogen and phytoestrogens on the VEGF expression and morphology in uterine tissue of ovariectomized rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(8):1041-4.

［12］Yamaguchi A，Sakamoto K，Minamizato T，et al.Regulation of osteoblast differentiation mediated by BMP，Notch，and CCN3/NOV［J］.J Dent Sci Rev，2008，44(1):48-56.

［13］Tulac S，Nayak N R，Kao L C，et al.Identification，characterization，and regulation of the canonical Wnt signaling pathway in human endometrium［J］.J Clin Endocrinol Metab，2003，88(8):3860-6.

［14］Nuttall M E，Gimble J M.Is there a therapeutic opportunity to either prevent or treat osteopenic disorders by inhibiting marrow adipogenesis［J］?Bone，2000，27(2):177-84.