孕酮對(duì)嗎啡條件性位置偏愛(ài)大鼠相關(guān)腦區(qū)中樞多巴胺D2受體水平的影響

于動(dòng)震，侯艷寧

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)同樣是與阿片類物質(zhì)依賴有密切關(guān)系的一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，包括兒茶酚胺和吲哚胺等，前者主要指去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、腎上腺素(epinephrine，E)和多巴胺(dopamine，DA)，后者主要指 5-羥色胺 (5-hydroxytryptamine，5-HT)。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與腦缺血、鎮(zhèn)痛以及學(xué)習(xí)記憶等多種病理生理過(guò)程。另外，該類神經(jīng)活性物質(zhì)在嗎啡依賴的形成和復(fù)吸過(guò)程中也具有重要的作用，而且DA是動(dòng)機(jī)活動(dòng)和產(chǎn)生欣快感的重要神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)情緒、學(xué)習(xí)記憶和運(yùn)動(dòng)等的調(diào)節(jié)至關(guān)重要［1］。DA發(fā)揮上述生理作用，必須通過(guò)與其受體結(jié)合才能實(shí)現(xiàn)。多巴胺受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體，都是由大約400個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子質(zhì)量在50 000 u左右。氨基酸鏈在細(xì)胞外為N-末端，細(xì)胞內(nèi)為C-末端，所有亞型受體都穿透膜。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的差異，即其結(jié)構(gòu)特性及其對(duì)腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)的不同調(diào)節(jié)作用，主要分為DⅠ型和DⅡ型兩類受體。DⅠ型受體包括D1和D5受體，DⅡ型受體包括D3、D4和D5受體。D1受體參與嗎啡引起的運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)效應(yīng)，其拮抗劑可以減少嗎啡成癮大鼠對(duì)環(huán)境刺激的反應(yīng)，即降低了該大鼠感受欣快的效應(yīng)，增加了大鼠覓藥動(dòng)機(jī)，又抑制了該大鼠的行為活動(dòng)［2］。在藥物依賴的作用中，與D1受體相比，D2受體的作用似乎更加突出。行為實(shí)驗(yàn)證明，D2受體激動(dòng)劑可產(chǎn)生精神興奮劑樣的行為效應(yīng)，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)性活動(dòng)、定型行為及其他強(qiáng)化反應(yīng)，并降低伏隔核內(nèi)腦啡肽前體mRNA的生成量［3］。D2拮抗劑明顯阻滯動(dòng)物自身給藥的獎(jiǎng)賞效應(yīng)和減弱條件性位置偏愛(ài)［4－5］。中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)(meolimbic dopamine system，MLDS)是公認(rèn)的與成癮有關(guān)的重要腦區(qū)［6］，在藥物的反復(fù)作用下MLDS內(nèi)相關(guān)核團(tuán)或神經(jīng)元突觸發(fā)生持續(xù)的對(duì)抗性適應(yīng)，特別是DA受體會(huì)發(fā)生一系列適應(yīng)性變化，涉及到受體的數(shù)量或活性、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子活性或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以及進(jìn)一步的基因表達(dá)等的改變，這些適應(yīng)性變化構(gòu)成了藥物依賴的神經(jīng)生物化學(xué)基礎(chǔ)［6－7］。有研究表明，伏隔核內(nèi)多巴胺神經(jīng)元直接參與阿片的急性獎(jiǎng)賞效應(yīng)及負(fù)性強(qiáng)化作用［8］。

目前，關(guān)于嗎啡精神依賴對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)甾體水平影響報(bào)道較多，而對(duì)外源性神經(jīng)甾體影響嗎啡精神依賴及其機(jī)制研究的相關(guān)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明［9－11］，孕酮可以有效的抑制大鼠嗎啡條件性位置偏愛(ài)的獲得，并且中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化在孕酮逆轉(zhuǎn)嗎啡CPP過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，但是DA受體在孕酮逆轉(zhuǎn)大鼠嗎啡位置偏愛(ài)時(shí)是否發(fā)生了變化在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，為了解決這一問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)采用了免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)方法，研究了嗎啡CPP時(shí)，大鼠伏隔核(nucleus accumbens，NA)、腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area，VTA)及紋狀體(striatum，ST)內(nèi) D2 受體水平的變化，最終探討了單獨(dú)使用孕酮訓(xùn)練或與嗎啡合用時(shí)，對(duì)大鼠伏隔核、腹側(cè)被蓋區(qū)及紋狀體內(nèi)D2受體水平的影響，進(jìn)一步深入探討神經(jīng)甾體孕酮抑制嗎啡CPP效應(yīng)的中樞單胺受體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 ♂ Sprague Dawley(SD)大鼠32只，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)體質(zhì)量170～180 g，河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(清潔 Ⅱ級(jí)，合格證號(hào):603216)。將大鼠隨機(jī)分為4組，分別為空白對(duì)照(C)組、嗎啡(Mor)組、孕酮(PROG)組和孕酮加嗎啡(PROG+Mor)組，每組動(dòng)物8只。動(dòng)物適應(yīng)新環(huán)境5 d后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，水和食物自由獲得。

1.2 藥品和試劑 孕酮購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，溶于10%的2-羥丙基-β-環(huán)糊精中，配成濃度為5 g·L－1的孕酮溶液;鹽酸嗎啡注射液購(gòu)自沈陽(yáng)第一制藥廠，溶于生理鹽水中，配成濃度為2.5 g·L－1的溶液;兔抗鼠多巴胺 D2受體，購(gòu)于 Chemicon公司。二抗SP-9001系列工作液試劑盒(包括A:內(nèi)源性過(guò)氧化酶阻斷劑，B:封閉用正常山羊血清，C:生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，D:辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液)及抗體稀釋液購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 Dig Behv動(dòng)物行為分析系統(tǒng)和位置偏愛(ài)視頻分析系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司);A0392脫水機(jī)、HISTOECENTR包埋機(jī)、AS325R切片機(jī)(英國(guó)Thermo公司);PHY-Ⅱ病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器廠);YWY781B醫(yī)用微波儀(浙江臨安電子器材廠);DH64電熱恒溫干燥箱(上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 CPP的建立 參考文獻(xiàn)方法［4］略做修改。訓(xùn)練前先分析大鼠在訓(xùn)練箱的黑室和白室的累積停留時(shí)間，測(cè)定大鼠的自然位置偏愛(ài)，在本實(shí)驗(yàn)條件下為黑室。以非位置偏愛(ài)側(cè)即訓(xùn)練箱的白室為伴藥側(cè)，訓(xùn)練時(shí)用隔板封閉黑白兩室的通道，大鼠每天訓(xùn)練2次，上午(8:00)注射后放入白室，下午(14:00)注射后放入黑室，大鼠每次在箱內(nèi)均停留45 min，兩次間隔6 h。Mor和PROG+Mor組大鼠上午腹腔注射嗎啡5 mg·kg－1，給予嗎啡的前10 min分別給予皮下注射10%的2-羥丙基-β-環(huán)糊精和PROG均為15 mg·kg－1，下午均注射等量的生理鹽水和10%的2-羥丙基-β-環(huán)糊精，連續(xù)訓(xùn)練10 d。最后1次訓(xùn)練后24 h進(jìn)行CPP測(cè)試，測(cè)試時(shí)將隔板倒置，使大鼠可以在黑白箱中自由出入，記錄在不給藥狀態(tài)下10 min內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況，并軟件分析大鼠在白室的累積停留時(shí)間。

1.4.2 樣品的處理 CPP測(cè)試結(jié)束后，將SD大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉(2%，W/V，0.3 ml/100 g體質(zhì)量)，開(kāi)胸，以30℃的生理鹽水(50～100 ml/250～350 g)經(jīng)左心室灌流，然后以4%多聚甲醛200 ml灌流固定，總時(shí)間大于30 min。開(kāi)顱，取出整個(gè)大腦，去除小腦，置4%多聚甲醛60 ml于4℃后固定，石蠟包埋，進(jìn)行連續(xù)冠狀切片，切片厚3 μm，隔二取一，每只大鼠每個(gè)腦區(qū)做6套切片，置干燥箱烘干備用。

1.4.3 D2受體ABC法免疫細(xì)胞化學(xué)染色 取出標(biāo)本，過(guò)氧化氫室溫孵育5 min;正常羊血清封閉非特異性抗原;傾去血清，滴加一抗工作液(1∶100稀釋)室溫濕盒中放置1 h后置4℃冰箱過(guò)夜;滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，室溫濕盒中放置75 min;滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液;DAB顯色，蘇木精復(fù)染10 min，自來(lái)水沖洗;體積分?jǐn)?shù)為1%鹽酸乙醇分色;1%氨水中和;常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Image-Pro Plus 5.1分析軟件測(cè)定D2受體表達(dá)的平均光密度(MOD)，結(jié)果以±s表示，每張片子隨機(jī)選5個(gè)視野，取均值作為此樣本的MOD值，數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件，各組間采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，繼于LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 孕酮對(duì)嗎啡CPP效應(yīng)獲得的影響 5 mg·kg－1嗎啡訓(xùn)練10 d后，嗎啡組在伴藥側(cè)的停留時(shí)間明顯長(zhǎng)于本組訓(xùn)練前及空白對(duì)照組，分別延長(zhǎng)了40.24%和36.99%(P＜0.01)。單獨(dú)給予15 mg·kg－1孕酮訓(xùn)練10 d，大鼠在伴藥側(cè)的停留時(shí)間與本組訓(xùn)練前及空白對(duì)照組比較差異均無(wú)顯著性(P＞0.05)。在給予嗎啡的前10 min給予15 mg·kg－1孕酮，大鼠在伴藥側(cè)的停留時(shí)間與訓(xùn)練前及空白對(duì)照組比較差異均無(wú)顯著性(P＞0.05)，與嗎啡組比較縮短22.78%(P＜0.01)。結(jié)果見(jiàn)Tab 1。

2.2 D2受體在正?！岽笫蟛糠帜X區(qū)內(nèi)的分布 在空白對(duì)照組大鼠各個(gè)腦區(qū)中，可以發(fā)現(xiàn)D2受體在腹側(cè)被蓋區(qū)、紋狀體和伏隔核中均有表達(dá)，但以紋狀體和伏隔核中的表達(dá)密度較高，而腹側(cè)被蓋區(qū)的表達(dá)密度較低，僅為紋狀體中的56.58%，結(jié)果見(jiàn)Tab 2，F(xiàn)ig 1 ～3。

2.3 外源性嗎啡慢性處理對(duì)大鼠腦區(qū)中D2受體表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組相比，5 mg·kg－1嗎啡訓(xùn)練10d后，Mor組大鼠腹側(cè)被蓋區(qū)、紋狀體和伏隔核中D2受體水平降低(均為P＜0.01)，分別減少了37%、20%和27%。結(jié)果見(jiàn)Tab 2，F(xiàn)ig 1～3。

Fig 1 Immunohistochemical staining of D2 receptor in ventral tegmental area of rats brain(×400)A:Blank control group;B:Morphine group;C:PROG group;D:PROG+morphine group

Fig 2 Immunohistochemical staining of D2 receptor in striatum of rats brain(×400)A:Blank control group;B:Morphine group;C:PROG group;D:PROG+morphine group

Fig 3 Immunohistochemical staining of D2 receptor in nucleus accumbens of rats brain(×400)A:Blank control group;B:Morphine group;C:PROG group;D:PROG+morphine group

Tab 1 Effects of progesterone on time that the rats spent in the drug-paired chamber of the test apparatus(T/s，±s，n=8)

Tab 1 Effects of progesterone on time that the rats spent in the drug-paired chamber of the test apparatus(T/s，±s，n=8)

C:Trained with 15 mg·kg－1cyclodextrin plus 5 mg·kg－1saline;Mor:Trained with 15 mg·kg－1cyclodextrin plus 5 mg·kg－1morphine;PROG:Trained with 15 mg·kg－1progesterone plus 5 mg·kg－1saline;PROG+Mor:Trained with 15 mg·kg－1progesterone plus 5 mg·kg－1 morphine.BT:Before training，AT:After training.＊＊P ＜0.01 vs C;##P＜0.01 vs BT;△△P＜0.01 vs Mor

C Mor PROG PROG+Mor BT 171±36 169.0±45 172±48 175.0±53 AT 173±41 237.0±51＊＊##177 ±60 183.0±56△△

2.4 單獨(dú)給予外源性神經(jīng)甾體孕酮對(duì)大鼠腦區(qū)中D2受體表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，單獨(dú)給予15 mg·kg－1孕酮訓(xùn)練10 d，D2受體的數(shù)量在各個(gè)腦區(qū)中未有變化(P＞0.05)。

Tab 2 Effect of PROG on the MOD of D2 receptor in hippocampus and striatum of rats brain( ± s，n=8)

Tab 2 Effect of PROG on the MOD of D2 receptor in hippocampus and striatum of rats brain( ± s，n=8)

VTA:Ventral tegmental area;ST:Striatum;NA:Nucleus accumbens;＊＊P＜0.01 vs C;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs Mor

VTA ST NA C 51.95 ±5.20 91.82 ±6.19 84.45 ±6.29 Mor 32.33 ±7.61＊＊ 73.41 ±3.26＊＊ 61.98 ±3.54＊＊PROG 54.74 ±6.18 88.38 ±7.19 86.76 ±5.72 P+Mor 30.13 ±6.58 86.62 ±4.52△ 85.37 ±4.46△△

2.5 孕酮對(duì)嗎啡CPP大鼠相關(guān)腦區(qū)中D2受體表達(dá)的影響 與嗎啡組比較，在給予嗎啡的前10 min給予15 mg·kg－1孕酮進(jìn)行條件性訓(xùn)練10 d后，大鼠紋狀體和伏隔核中D2受體水平升高(P＜0.05和P＜0.01)，但腹側(cè)被蓋區(qū)中還是保持較低的水平(P ＞0.05)，結(jié)果見(jiàn) Tab 2，F(xiàn)ig 1～3。

3 討論

阿片類物質(zhì)的精神依賴是指用藥才能達(dá)到心理滿足，驅(qū)使其覓藥和濫用。關(guān)于精神依賴的發(fā)生機(jī)制，以Wise和Bozart為代表的“精神刺激”學(xué)說(shuō)認(rèn)為，追求阿片類藥物帶來(lái)的欣快感和獎(jiǎng)賞效應(yīng)(正性強(qiáng)化作用)是引起依賴形成的始動(dòng)因素。藥物的正性強(qiáng)化效應(yīng)主要涉及3個(gè)大腦系統(tǒng)，即:中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)、內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)和β-氨基丁酸/谷氨酸能神經(jīng)系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化技術(shù)，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期的工作基礎(chǔ)，有選擇性的測(cè)定了與阿片類獎(jiǎng)賞回路相關(guān)的部分腦區(qū)中D2受體的表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中，我們根據(jù)Chemicon公司所提供的資料，在抗體效價(jià)的1∶200～1∶500區(qū)間中，采用了1∶200、1∶300、1∶400和1 ∶500分別進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均不是十分理想，最后抗體的效價(jià)到1∶100時(shí)，發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)性最強(qiáng)。從Tab 2中可以發(fā)現(xiàn)，在空白對(duì)照組動(dòng)物的不同腦區(qū)中，D2受體在紋狀體、伏隔核、腹側(cè)被蓋區(qū)等處都有分布，但存在著很大的差別，其中以紋狀體和伏隔核中的密度較高，這與以往的研究報(bào)道結(jié)果相一致［12］。

研究表明，嗎啡產(chǎn)生精神依賴的神經(jīng)解剖基礎(chǔ)是伏隔核、腹側(cè)被蓋區(qū)、額葉皮質(zhì)、海馬和杏仁核等，即所謂的獎(jiǎng)賞回路。神經(jīng)生化研究表明［13］，嗎啡覓藥行為的形成涉及氨基酸、單胺、類阿片肽等多種神經(jīng)遞質(zhì)。其中腹側(cè)被蓋區(qū)－伏隔核是一條DA能通路，阿片類藥物通過(guò)與腹側(cè)被蓋區(qū)神經(jīng)元上的阿片μ受體結(jié)合，降低GABA能神經(jīng)元活性，減少GABA的釋放，從而取消了對(duì)DA能神經(jīng)元的緊張性抑制，導(dǎo)致伏隔核內(nèi)DA釋放增加，被公認(rèn)為是嗎啡產(chǎn)生獎(jiǎng)賞效應(yīng)的主要神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)［13］。但也有研究認(rèn)為［14－15］，促進(jìn)紋狀體內(nèi) DA 釋放增加，亦是大多數(shù)成癮類藥物的一個(gè)共同特征，阻斷腹側(cè)紋狀體的DA釋放可以降低成癮藥物的大部分作用，比如條件性位置偏好。本研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡CPP形成時(shí)，腹側(cè)被蓋區(qū)、伏隔核和紋狀體內(nèi)D2的表達(dá)均明顯減少，分別減少37%、20%和27%，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示在嗎啡所致的CPP發(fā)生的病理過(guò)程中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)D2受體發(fā)生了適應(yīng)性變化，此變化可能參與了嗎啡CPP的形成，腹側(cè)被蓋區(qū)、伏隔核及紋狀體內(nèi)D2受體水平的變化對(duì)嗎啡覓藥行為具有重要的意義。

以往的許多研究證據(jù)表明，D1和D2受體在藥物依賴中有相似的作用，兩種受體都參與藥物的運(yùn)動(dòng)效應(yīng)和行為敏感化，D1和D2受體的拮抗劑都能阻斷嗎啡導(dǎo)致的活動(dòng)增強(qiáng)，所以D1和D2受體可能在藥物的強(qiáng)化、獎(jiǎng)賞、活動(dòng)增強(qiáng)、行為敏感化等方面都有重要的作用。但是，它們可能通過(guò)各自不同分受體后傳導(dǎo)途徑，參與到強(qiáng)化等的調(diào)節(jié)過(guò)程，D1受體可能參加與感覺(jué)成分有關(guān)的強(qiáng)化反應(yīng)，而D2受體可能更多的與成癮過(guò)程中的覓藥行為有關(guān)［16－17］。伏隔核的殼部屬于邊緣系統(tǒng)，是參與多種成癮性藥物獎(jiǎng)賞效應(yīng)的部分，該部位盡管接受杏仁核、額葉皮質(zhì)、海馬、顳葉皮層及大部分丘腦核團(tuán)的傳入投入，但主要接受來(lái)自于中腦腹側(cè)被蓋區(qū)的DA能投射［18］，大量的研究發(fā)現(xiàn)中腦被蓋區(qū)－伏隔核－額葉皮質(zhì)是成癮性藥物獎(jiǎng)賞效應(yīng)的最后公共通路［19］，在我們的實(shí)驗(yàn)中，在給予嗎啡的前10 min給予15 mg·kg－1孕酮進(jìn)行條件性訓(xùn)練10 d后，在行為學(xué)上表現(xiàn)為大鼠嗎啡精神依賴得到了有效控制［9－11］，神經(jīng)生化上表現(xiàn)為伏隔核和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)內(nèi)DA水平明顯降低［14］，分子生物學(xué)水平上表現(xiàn)為大鼠紋狀體和伏隔核中D2受體水平明顯升高18%和39%，該結(jié)果提示，外源性神經(jīng)甾體孕酮可以通過(guò)改變嗎啡精神依賴時(shí)明顯降低的D2受體水平，進(jìn)而影響中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放，這一過(guò)程是孕酮對(duì)大鼠嗎啡CPP實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)的有效途徑之一。所以，根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)，孕酮與嗎啡合用時(shí)可能直接解除了嗎啡對(duì)伏隔核區(qū)DA轉(zhuǎn)運(yùn)子的抑制效應(yīng)，D2受體水平升高使細(xì)胞外DA濃度降低，從而產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)大鼠CPP的效應(yīng)。與嗎啡組相比，孕酮+嗎啡組大鼠盡管在中腦腹側(cè)被蓋區(qū)中D2受體水平未見(jiàn)明顯升高，但受體的活性是否發(fā)生了改變，是值得進(jìn)一步深入研究的問(wèn)題。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明大鼠嗎啡條件性位置偏愛(ài)形成時(shí)，腹側(cè)被蓋區(qū)、紋狀體和伏隔核中D2受體表達(dá)水平下降;孕酮伴隨給藥時(shí)可以逆轉(zhuǎn)大鼠條件性位置偏愛(ài)的形成，紋狀體和伏隔核中D2受體表達(dá)水平的改變可能參與了上述逆轉(zhuǎn)過(guò)程。

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