PPARδ激動劑GW501516調(diào)節(jié)小鼠骨骼肌線粒體生物合成和纖維類型轉(zhuǎn)換的作用

方海琴，張 勇，許佑君，吳英良

(1.天津體育學(xué)院天津市運動生理與運動醫(yī)學(xué)重點實驗室，天津 300381;2.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧沈陽 110016)

骨骼肌既是執(zhí)行運動及調(diào)節(jié)機(jī)體葡萄糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝的重要器官，也是一可塑性器官。人類許多代謝疾病如糖尿病等可出現(xiàn)肌萎縮、肌纖維類型改變［1］。近來的報道指出［2］，在長時間靜坐、少動人群中，由于線粒體不能完全氧化體內(nèi)脂肪酸導(dǎo)致不完全代謝產(chǎn)物蓄積，代謝疾病發(fā)生。苯氧乙酸化合物GW501516已經(jīng)進(jìn)入三期臨床試驗，是目前受到人們關(guān)注最多的選擇性PPARδ受體激動劑［3］。PPARδ受體分布在骨骼肌和棕色脂肪等多種組織中，在控制脂肪酸氧化方面起著重要作用，運動訓(xùn)練能導(dǎo)致此受體含量的增加。Wang等［4］2004年報道在PPARδ轉(zhuǎn)基因鼠中，骨骼肌由Ⅱ型向Ⅰ型發(fā)生了轉(zhuǎn)變，COXⅡ、COXⅣ等線粒體標(biāo)志性蛋白含量明顯升高，且耐力運動到力竭的時間和運動距離都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型。這些研究提示，PPARδ可能在促進(jìn)骨髂肌線粒體的生物合成和骨骼肌肌纖維發(fā)生代謝性質(zhì)的轉(zhuǎn)變中具有重要調(diào)節(jié)作用。因此，本研究以C57BL/6小鼠為對象，觀察和比較GW501516補充和(或)耐力訓(xùn)練對線粒體生物合成和骨骼肌肌纖維類型的影響，并探討其分子機(jī)制，以期為其用于肌萎縮/病理性肥大相關(guān)疾病、殘疾康復(fù)、糖尿病等代謝疾病的治療提供初步的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 ♂ C57BL/6小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。小鼠購入后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，苦味酸編號，單只分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食，每日記錄飲水量及激動劑干預(yù)量。實驗總時程16周。

1.2 主要試劑與藥品 GW501516由沈陽藥科大學(xué)許佑君教授饋贈。PGC-1α一抗(Santa Cruz CA)，PPARδ、COXⅣ、MHCⅠ、MHCⅡ、MHCⅡa和 β tubline單抗(均購自ABcam公司)，HRP標(biāo)記的二抗(中杉金橋生物技術(shù)公司)，甲苯胺藍(lán)(Amoroso)。

1.3 儀器設(shè)備 動物電動跑臺(天津運動醫(yī)學(xué)研究所)，臺式高速低溫離心機(jī)AvantiTM30(Beckman Co，USA)，DU800型可見-紫外分光光度計(Beckman Co，USA)，垂直電泳槽(Bio-Rad Co，USA)，蛋白轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rad Co，USA)，穩(wěn)壓電泳儀(Lab net Co，USA)，BLATER 冰凍切片機(jī)(Attenpon Co，Ger-many)，顯微鏡 AVNOX(Olympus Co，Japan)，透射電子顯微鏡(Philips EM208S)。

2 方法

2.1 動物分組 80只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5個組，分別為:對照組(C)、耐力運動訓(xùn)練組(T)、低劑量GW501516組(LG)、低劑量GW501516并耐力運動訓(xùn)練組(TG)，高劑量GW501516組(HG)，每組16只(劑量因素本論文不做討論)。

2.2 實驗動物激動劑干預(yù)及耐力訓(xùn)練模型 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 wk后，LG、HG和TG小鼠開始隨飲水補給GW501516，逐漸增量。補充劑量從1 mg·kg-1逐漸升高至3 mg·kg-1及10 mg·kg-1時，分別固定在3 mg·kg-1和10 mg·kg-1的低、高兩個劑量。

［5］方法，T和TG組小鼠進(jìn)行無坡度跑臺訓(xùn)練，14 m·min-1，每次50 min，每周5次，全程監(jiān)控小鼠耐力訓(xùn)練，共15周。

2.3 動物取材及標(biāo)本制備 各組小鼠均以10%水合氯醛(400 mg·kg-1，ip)麻醉后，迅速取出腓腸肌。按纖維走行方向取部分腓腸肌，即刻按所需截面修正為約1 mm3的立方小塊，迅速以電鏡固定液固定，定時1 h，取出用磷酸緩沖液沖洗干凈，重復(fù)3次。將固定標(biāo)本制備超薄切片，透射電鏡觀察，拍照，分析。另取部分腓腸肌，剔除肌膜，迅速放入液氮預(yù)冷的異戊烷中，保存于-70℃;按照編號取出相應(yīng)的組織，待溫度回升到-25℃時OTC包埋，冰凍切片，厚度為5 μm，每例樣本按照“一對一”連續(xù)切片，分別用于肌纖維類型(異染性染料ATP酶法)檢測［6］。剩余腓腸肌，液氮速凍，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 小鼠腓腸肌ATP酶染色及肌纖維類型分析參照文獻(xiàn)［6］(Ogilvie RW)以異染性染料法測定腓腸肌ATP酶活性，并在Olympus顯微照像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄。染色片中呈陽性的I型肌纖維顯深藍(lán)色，Ⅱa型纖維顯淺藍(lán)色，Ⅱb型骨骼肌纖維為陰性未被著色，呈白色，IPP圖像系統(tǒng)處理，電腦格度掃描，計算出各類肌纖維的構(gòu)成比例。

2.5 骨骼肌 PPARδ、PGC-1α、COXⅣ、MHCⅠ、MHCⅡ、MHCⅡa蛋白含量測定［7］取適量液氮凍存骨骼肌組織勻漿，用 RIPA法提取骨骼肌中PPARδ蛋白，NP-40法提取骨骼肌全細(xì)胞蛋白(PGC-1α、COXⅣ、MHCⅠ、MHCⅡ、MHCⅡa)，以考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白濃度，確定合適的上樣量。蛋白電泳完畢后，采用濕法將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，根據(jù)預(yù)染蛋白Marker剪取目的蛋白條帶。按各蛋白所用一抗的說明書，稀釋一抗，4℃孵育過夜后，TBST洗膜，HRP標(biāo)記的二抗(中杉金橋生物技術(shù)公司)室溫溫育1～2 h;使用LumiGLO?Chemiluminescent Substrate(KPL)進(jìn)行發(fā)光底物孵育，曝光。使用Quantity ONE(Bio-Rad)軟件對目的蛋白進(jìn)行光密度分析，以β-tubulin為內(nèi)參蛋白。目的蛋白相對含量=目的蛋白灰度值/β-tubulin蛋白灰度值。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 激動劑補充與耐力訓(xùn)練為本實驗涉及的兩種干預(yù)因素，兩個因素既有單獨效應(yīng)也表現(xiàn)出交互作用，故采用SPSS 13.0軟件中的2*2析因分析法進(jìn)行統(tǒng)計分析檢驗。實驗結(jié)果以±s表示。

3 結(jié)果

3.1 小鼠腓腸肌超微結(jié)構(gòu)觀察 如Fig 1所示:透射電鏡6 000倍下觀察，小鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)顯示出:無激動劑干預(yù)的C組和T組，線粒體呈粒狀或桿狀，體積小、數(shù)目相對較少;激動劑干預(yù)各組(LG、TG)線粒體呈橢圓形，排列整齊，數(shù)目明顯增多，提示線粒體的生物合成增加。

Fig 1 Transmission EM photos of mice’s gastrocnemius muscles(×6 000)C:Control;T:Training;LG:Low dose GW501516(3 mg·kg-1·d-1);TG:Training and low dose GW501516(3 mg·kg-1·d-1)

3.2 GW501516及耐力訓(xùn)練對小鼠腓腸肌PPARδ、PGC-1α和 COXIV及 MHCs蛋白表達(dá)的影響 如Fig 2所示:A圖中，T組(P＜0.05)、LG組(P＜0.01)和TG組(P＜0.05)小鼠腓腸肌PPARδ蛋白表達(dá)量均較C組提高;B圖中，T組(P＜0.05)、LG組(P＜0.05)和TG組(P＜0.05)小鼠腓腸肌PGC-1α蛋白表達(dá)量均較C組提高;C圖中，T組(P＜0.05)、LG組(P＜0.05)和TG組(P＜0.05)小鼠腓腸肌COXIV蛋白表達(dá)量均較C組提高;激動劑和訓(xùn)練在小鼠骨骼肌以上各蛋白表達(dá)量變化中均有交互作用(P＜0.05)。

D圖中，LG組(P＜0.05)和TG組(P＜0.05)小鼠腓腸肌MHCⅠ蛋白表達(dá)量均較C組提高，T組較C組無增加;E圖中LG組(P＜0.01)和TG組(P＜0.05)小鼠腓腸肌MHCⅡ蛋白表達(dá)量均較C組降低;F圖中，T組(P＜0.05)、LG組(P＜0.05)和TG組(P＜0.05)小鼠腓腸肌MHCⅡa蛋白表達(dá)量均較C組提高;激動劑和訓(xùn)練在小鼠腓腸肌MHCⅠ、MHCⅡ、MHCⅡa蛋白含量變化中有交互作用(P＜0.05)。

3.3 小鼠腓腸肌異染性染料ATP酶染色圖片分析如Fig 3所示，T組(P＜0.05)、LG組(P＜0.05)和TG組(P＜0.01)Ⅱb型肌纖維(%)均較C組降低;T組(P＜0.05)、LG組(P＜0.05)和TG組(P＜0.01)Ⅱa型肌纖維(%)均較C組提高;相對于C組，T組的Ⅰ型肌纖維比例無變化;TG組的Ⅰ型肌纖維明顯增加。激動劑和訓(xùn)練在小鼠各型肌纖維(%)變化中有交互作用(P＜0.01)。

Fig 3 Metachromatic staining of mice’s gastrocnemius(A)and the analysis of muscle types(%)(B)A:TypeⅠ fibers were stained dark blue，type Ⅱa fibers were stained light blue，and TypeⅡb fibers were white;*P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 exhibited additional enhancing effects in TG group by GW501516 and training

4 討論

Oliver等［3］在 2003 年研發(fā)了 GW501516，此化合物對PPARδ的激動作用具有很強的選擇性，其選擇性高出其它亞型1 000倍，在nmol·L-1的濃度水平就可以激動PPARδ。Wang等［4］實驗證明在服用GW501516激動劑10 d后，C57鼠的線粒體生物合成和呼吸氧化和骨骼肌慢肌纖維的基因皆有上調(diào)。

線粒體的生物合成(mitochondrial biogenesis)，是指線粒體的種系發(fā)生也可以指線粒體的個體發(fā)生的過程。細(xì)胞內(nèi)線粒體的生物合成至少包括以下兩種改變:①單位體積組織中線粒體含量的改變，②線粒體本身成分的改變，如線粒體蛋白/磷脂的構(gòu)成比例的改變。線粒體生物合成是一個復(fù)雜的過程，包括核基因和線粒體基因的激活、轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)前體的運輸以及進(jìn)入線粒體的蛋白質(zhì)的正確組裝等多個步驟。運動和電刺激引起的肌肉收縮會誘導(dǎo)線 粒 體 生 物 合 成 已 成 共 識［8-9］。PGC-1α 即PPARGC-1α(PPAR γ coactivator-1α)是線粒體合成途徑中一個關(guān)鍵因子［10］，其屬于 PGC-1家族，是PPAR γ的轉(zhuǎn)錄輔激活因子，也是通用的輔激活因子，同時PGC-1α是PPAR s及甲狀腺素受體(TR)的強烈轉(zhuǎn)錄協(xié)同刺激因子，對線粒體的生物合成和細(xì)胞能量代謝起著關(guān)鍵的調(diào)控作用［11］。另有Lin等［12］研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α是I型肌纖維的生理性調(diào)節(jié)因子，當(dāng)PGC-1α在富含Ⅱ型纖維(快肌纖維)的肌肉里表達(dá)升高時，其可導(dǎo)致肌肉形態(tài)、基因及功能發(fā)生變化，促進(jìn)I型肌纖維的形成。Arany等［13］曾報道PGC-1α的輔因子PGC-1β的增多上調(diào)了線粒體生物合成，使骨骼肌纖維的Ⅱx型纖維增多。

PGC-1α的表達(dá)受很多因素影響，已明確PGC-1α可以與大多數(shù)核激素受體包括PPARδ在內(nèi)的超家族成員，以不同的方式與其發(fā)生分子對接，進(jìn)而調(diào)控其生物學(xué)功能［14］，這也提示可以考慮從激活PPARδ上調(diào)PGC-1α的表達(dá)，增加由PGC-1α調(diào)控的線粒體生物合成分子機(jī)制的為切入點進(jìn)行研究觀察。

我們參考Arany等［13］的實驗方法，用電鏡觀察骨骼肌超微結(jié)構(gòu)，也發(fā)現(xiàn)了GW501516補充組小鼠骨骼肌線粒體合成明顯增加。從蛋白分析結(jié)果可以看出，GW501516補充可明顯增加小鼠骨骼肌PGC-1α、COXIV蛋白含量，說明伴隨著PPARδ受體的激活，誘導(dǎo)了小鼠骨骼肌的線粒體生物合成。

骨骼肌由慢縮肌纖維和快縮肌纖維組成。根據(jù)肌球蛋白ATP酶染色或(和)肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)異構(gòu)體的表達(dá)，成年嚙齒動物骨骼肌纖維可單純地分為Ⅰ型(氧化型慢縮肌，線粒體極為豐富)和Ⅱa型(糖氧化型快縮肌)、Ⅱb型(糖酵解型快縮肌)、Ⅱx型(介于Ⅱa與Ⅱb之間)。骨骼肌既是執(zhí)行運動及調(diào)節(jié)機(jī)體葡萄糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝的重要器官，也是一可塑性器官。不同的代謝功能需求和代謝變化(如運動、飲食的改變)，骨骼肌纖維大小和類型可產(chǎn)生相應(yīng)的適應(yīng)性改變。高果糖飲食不僅可以導(dǎo)致胰島素抵抗(IR)，而且用ATP酶染色可見慢肌纖維比例的下降［15］。IR和糖尿病顯示骨骼肌慢肌比例下降［1］。

Luquet等［16］首次使用PPARδ的轉(zhuǎn)基因小鼠，觀察到這種小鼠骨骼肌中慢肌纖維比例的明顯增加。Wang等［4］在 PPARδ轉(zhuǎn)基因小鼠的研究中，運用慢肌肌鈣蛋白以及異染性染料ATP酶染色發(fā)現(xiàn)，PPARδ轉(zhuǎn)基因小鼠的肌纖維類型發(fā)生了明顯改變，即快肌纖維向慢肌纖維的轉(zhuǎn)換。

與轉(zhuǎn)基因動物研究不同，以往的研究對于運動訓(xùn)練能否造成骨骼肌纖維從Ⅱ型肌纖維(快肌類型)向Ⅰ型肌纖維(慢肌纖維)類型轉(zhuǎn)換的結(jié)論并不一致。Demirel等［17］注意到SD大鼠75%強度跑臺訓(xùn)練10周的實驗中，當(dāng)訓(xùn)練時間為每天30 min和60 min時，沒有觀察到足底肌MHC蛋白組成的改變，但訓(xùn)練時間延長至90 min時觀察到MHCs組成的改變。Perhonen等［18］Wistar大鼠跑臺訓(xùn)練，測得的趾長伸肌和比目魚肌肌纖維組成無明顯改變。近年來人們通過MHCs的觀察研究，在運動對骨骼肌纖維類型的影響上持有的觀點漸趨一致:即耐力運動對骨骼肌的纖維類型影響大多局限于Ⅱa，Ⅱb，Ⅱx之間的轉(zhuǎn)變。

本研究中以耐力訓(xùn)練為運動模型，對C57鼠進(jìn)行15周的跑臺訓(xùn)練(每天50 min)，未觀察到運動小鼠骨骼肌纖維比例以及肌球蛋白重鏈MHCs有明顯肌纖維類型上的轉(zhuǎn)換。但在GW501516激動劑的長期干預(yù)下，小鼠骨骼肌纖維表現(xiàn)出從快肌纖維向慢肌纖維的轉(zhuǎn)換，尤其TG組可見明顯增加。

我們的研究結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)［4，16］報道說明，不同于單純運動訓(xùn)練，無論是轉(zhuǎn)PPARδ基因還是PPARδ激動劑干預(yù)，都可以促使實驗動物骨骼肌纖維類型的轉(zhuǎn)換。

我們還發(fā)現(xiàn)GW501516與耐力訓(xùn)練存在交互作用，這可能是運動會使骨骼肌長鏈不飽和脂肪酸氧化增加，而使PPARδ內(nèi)源性配體增加。因此，在同劑量激動劑干預(yù)的情況下，由于運動因素的加入，加大了受體被激活的程度。此外，運動上調(diào)了PGC-1α，PGC-1α與PPARδ相互應(yīng)答，使二者的活性與表達(dá)協(xié)調(diào)共增，作用疊加。

綜上所述，本研究用小鼠外源性補充PPARδ激動劑GW501516并輔以運動的實驗?zāi)Ｐ?，證實了單純耐力訓(xùn)練和GW501516補充都可誘導(dǎo)小鼠骨骼肌線粒體生物發(fā)生，同時GW501516補充促進(jìn)了骨骼肌纖維類型從糖酵解型向有氧氧化型轉(zhuǎn)換，而單純耐力訓(xùn)練未發(fā)生肌纖維類型轉(zhuǎn)變。其機(jī)制可能為GW501516激活PPARδ受體后，與受體共激活因子PGC1α協(xié)同作用，進(jìn)而上調(diào)線粒體的生物合成，并促使小鼠骨骼肌代謝類型的轉(zhuǎn)化。

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