以siRNA表達載體穩(wěn)定抑制縫隙連接蛋白43表達的睪丸間質細胞和睪丸支持細胞系的建立

鄭素平，洪曉婷，王 琴，陶 亮

睪丸中的非生殖細胞主要包括睪丸支持細胞和睪丸間質細胞，這兩種細胞對精子的生成和睪丸正常功能的維持具有重要作用。其中睪丸支持細胞構成血睪丸屏障、維持睪丸內(nèi)正常微環(huán)境，對生殖細胞起著支持和營養(yǎng)作用;睪丸間質細胞則分泌雄激素等活性物質以調節(jié)生殖功能。近年來的研究表明［1］，這兩種細胞的作用與其細胞間的縫隙連接(gap junction，GJ)功能密切相關。GJ是細胞間的一種特殊通道，它溝通相鄰細胞的胞質，介導細胞間直接的信號傳遞。GJ由特殊的連接蛋白——connexin(Cx)組成，迄今為止發(fā)現(xiàn)的Cx有20種，通常以其分子量來命名，如分子量為43 ku的 Cx命名為Cx43［2-3］。睪丸支持細胞表達 Cx43、Cx32等9種連接蛋白，其中Cx43占90%以上;睪丸間質細胞則僅表達Cx43。由Cx43組成的GJ介導了睪丸支持細胞對生精細胞的支持和營養(yǎng)作用，對睪丸間質細胞的內(nèi)分泌活動也起重要調節(jié)作用，但作用機制不明［1］。阻礙該領域研究進展的一大障礙是迄今尚無能特異、直接改變GJ通道功能的藥物和方法。本研究采用RNA干擾 (RNA interference，RNAi)這一特異性干擾目標基因表達的方法，通過設計針對Cx43基因的RNA干擾序列，構建能在真核細胞中表達Cx43-siRNA的質粒，并導入睪丸支持細胞和睪丸間質細胞，建立能穩(wěn)定表達siRNA的睪丸間質細胞和睪丸支持細胞系，并證明了該兩種細胞系上的Cx43蛋白表達及GJ功能能夠被長期穩(wěn)定抑制。本研究為進一步研究Cx43及其組成的GJ在睪丸非生殖細胞中的作用提供了有用工具。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑 小鼠睪丸支持細胞株(TM4細胞)及睪丸間質細胞株(TM3細胞)均購自美國ATCC公司;siRNA表達質粒pSilencerTM2.1-U6 neo購自美國Ambion公司;DH5α大腸桿菌和DNA片段購自上海生工公司;T4 DNA連接酶購自NEB公司;質粒提取試劑盒購自QIAGEN公司;G418購自Merck公司;Cx43單克隆抗體購自Sigma公司;HRP標記的山羊抗小鼠二抗、ECL-plus化學發(fā)光劑和DC蛋白定量試劑盒購自Bio-Rad公司;陽離子脂質體轉染試劑(LipofectamineTM2 000)購自Invitrogen公司。

1.2 siRNA序列的設計與合成 在GenBank檢索出小鼠Cx43的mRNA全長序列，遵循siRNA設計原則，利用Invitrogen公司siRNA在線設計軟件，設計了針對小鼠Cx43蛋白的3個干擾RNA序列，分別為“CAGTCTGCCTTTCGCTGTA”，“GAACCTACATCATCAGCAT”和“GCTCACGTGTTCTATGTGA”。經(jīng)BLAST檢索確認與其它已知小鼠基因序列無同源性。以“BamH I酶切位點+siRNA正義序列+發(fā)夾環(huán)(TTCAAGAGA)+siRNA反義序列+終止信號+HindⅢ酶切位點”為原則合成寡核苷酸單鏈及互補鏈。

1.3 Cx43-siRNA質粒的構建 將合成的互補的寡核苷酸單鏈加入到退火緩沖液中反應，退火產(chǎn)物與線性化載體pSilencer 2.1-U6 neo在T4 DNA連接酶作用下連接，構建出3種能表達Cx43-siRNA的質粒:Cx43-siRNA1、Cx43-siRNA2及 Cx43-siRNA3質粒。以Ambion公司提供的pSilencer 2.1-U6 Negative Control作為陰性對照質粒，其上帶有陰性對照的干擾 RNA序列:“ACTACCGTTGTTATAGGTG”，該序列與已知小鼠基因序列無同源性。將重組質粒轉化DH5α感受態(tài)菌，收集轉化后的菌液，涂布在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)皿上，37℃倒置培養(yǎng)12～16 h，挑取陽性菌落，擴增并送上海生工公司進行測序鑒定。

1.4 質粒轉染及穩(wěn)定陽性細胞克隆的建立 擴增培養(yǎng)含目標質粒的DH5α大腸桿菌，以質粒提取試劑盒提取質粒。將對數(shù)生長期的細胞以8×104密度接種于12孔板，用含5%馬血清、2.5%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，至80% ～90%融合時以脂質體轉染試劑LipofectamineTM2 000將質粒轉染細胞。轉染后48 h，收獲細胞備用。穩(wěn)定轉染則在轉染后24 h消化傳代，以10個/cm2接種至10 cm培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，更換為含100 mg·L-1G418的培養(yǎng)液進行篩選。10～20 d后，干擾質粒組和陰性對照質粒組均可見抗性克隆形成，未轉染組細胞全部死亡。以無菌克隆環(huán)挑取單細胞陽性克隆消化傳代并擴大培養(yǎng)。

1.5 Western blot檢測蛋白表達 冰上裂解細胞，超聲破碎，4℃，12 000 ×g，離心 30 min，取上清液以DC蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。將含20 μg蛋白的樣品90℃水浴5 min變性，經(jīng)SDS-PAGE電泳(8%分離膠)分離后電轉印至硝酸纖維素膜上。脫脂奶粉封閉，加入Cx43一抗(1∶4 000)，4℃孵育過夜。TBST洗膜后加入 HRP標記的二抗(1∶5 000)，室溫孵育30 min，洗膜后用增強型化學發(fā)光底物(ECL)顯影曝光。用Bio Imaging system(Gene Genius)對膠片進行灰度掃描分析。以β-actin為內(nèi)參對照，蛋白表達強度以Cx43蛋白表達灰度值與β-actin灰度值的比值表示。

1.6 “Parachute”熒光示蹤法檢測GJ功能 “Parachute”熒光示蹤法是檢測GJ功能的一種常用方法［4］。將細胞接種于12孔板，培養(yǎng)至融合后，取其中一孔作為“供體細胞”，加入熒光指示劑Calcein-AM(0.5 μmol·L-1)和 DiI-CM(1 μmol·L-1)孵育30 min。Calcein-AM進入細胞后，其上所帶的乙酰甲酯(acetoxymethyl ester，AM)被胞內(nèi)脂酶水解而形成發(fā)綠色熒光的calcein，不能透過細胞膜，但能經(jīng)GJ傳遞至鄰近細胞。Dil-CM是一種親脂性細胞膜染料，不能通過GJ傳遞到毗鄰細胞，用于識別供體細胞。胰酶消化收獲熒光標記好的供體細胞，以1∶200接種到已生長融合的細胞(接受細胞)上。培養(yǎng)4 h，待“供體細胞”與“接受細胞”間形成穩(wěn)定的GJ后，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照，計數(shù)一個“供體細胞”周圍含有綠色熒光的“接受細胞”的數(shù)目，作為評價GJ功能的指標。

2 結果

2.1 Cx43-siRNA表達載體的鑒定 測序結果證實，所獲得的Cx43-siRNA表達質粒目的片段與預期完全相符(Fig 1)。表明siRNA真核表達載體構建成功。

2.2 瞬時轉染Cx43-siRNA質粒后，TM4細胞中Cx43的表達水平 Cx43是一種磷酸化蛋白，在聚丙烯電泳中能分離出3條帶，分子質量在43～45 ku之間，分別為非磷酸化 形式(P0)和兩種磷酸化形式(P1 和 P2)［5］。Western blot結果顯示，瞬時轉染3種Cx43-siRNA質粒后，TM4細胞上Cx43蛋白的3種形式(P0、P1和P2)均受到不同程度的抑制，以Cx43-siRNA3的抑制效果最佳。轉染陰性對照質粒的細胞，其Cx43表達水平無改變(Fig 2)。

Fig 1 Results of DNA sequencing

Fig 2 Expression of Cx43 in TM4 cells after being transiently transfected with siRNA expression vectorsP0，unphosphorylated Cx43;P1 and P2，phosphorylated Cx43.*P＜0.05 vs control

2.3 穩(wěn)定表達Cx43-siRNA細胞株Cx43蛋白表達的變化 以干擾效果最佳的Cx43-siRNA3質粒轉染TM3細胞和TM4細胞，經(jīng)G418篩選獲得4株陽性細胞克隆，在20～22次傳代后，所獲得的4株細胞克隆全部穩(wěn)定存活，隨機挑選1株細胞檢測其Cx43蛋白表達及其形成的GJ功能。Western blot結果顯示，這兩種細胞株與對照組相比，Cx43表達水平均明顯下降(Fig 3)。

Fig 3 Expression of Cx43 in stably transfected TM3 cells and TM4 cells*P＜0.05 vs control

Fig 4 Dye couping through GJ composed of Cx43 in stably transfected TM3 cells(A)and TM4 cells(B)(200×)*P＜0.05 vs control

2.4 穩(wěn)定表達Cx43-siRNA細胞株GJ功能的變化“Parachute”熒光示蹤法檢測結果顯示，與對照組相比，穩(wěn)定表達Cx43-siRNA的TM3細胞和TM4細胞calcine傳遞細胞數(shù)明顯減少，表明這兩種細胞的GJ功能均明顯降低(Fig 4)。

3 討論

GJ是細胞之間信號傳遞的一種重要方式，廣泛存在于幾乎所有的實質臟器中。它在同步細胞的活動、維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、控制細胞的生長和發(fā)育中發(fā)揮重要的作用［2］。相反，Cx的異常表達及GJ功能的減弱或消失將一定程度上阻礙了細胞間信號傳遞，進而導致心律失常、腫瘤等多種疾病的發(fā)生［6-7］。Cx在不同的器官、組織中分布不同，Cx43是睪丸組織中表達最豐富的連接蛋白，也是組成睪丸組織中GJ的主要連接蛋白［1］。睪丸間質細胞之間、睪丸支持細胞之間以及睪丸支持細胞和生殖細胞間均存在大量由Cx43組成的GJ。這些GJ通道在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用［8］。Cx43本身及其形成的GJ對睪丸支持細胞的增殖和分化起調節(jié)作用［9］。睪丸支持細胞中Cx43對維持血-睪丸屏障的完整性也起著重要作用［10］，Cx43的敲除可能導致血-睪丸屏障及睪丸支持細胞GJ復合物的分解［9］。此外，Cx43形成的GJ還介導睪丸間質細胞的內(nèi)分泌活動［11］。Cx43也是二硝基苯、棉酚及順鉑等生殖毒物的作用靶點［12］。研究GJ在睪丸生理、病理中的作用，將為男性生殖系統(tǒng)疾病研究開拓新的方向。但是，由于缺乏能選擇性作用于GJ而改變GJ功能的藥物和方法，使人們難以深入研究GJ在睪丸組織中的生理功能和它在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用。

GJ是一種結構特殊的蛋白質通道，與其它膜通道不同，GJ兩端開口都在細胞內(nèi)，因此，難以找到直接作用于GJ的工具藥，這為研究其功能帶來了困難。而RNAi技術作為一種調控特定基因表達的手段，能夠高效、特異地抑制目的基因表達，被廣泛用于基因功能鑒定和基因治療，從而為研究GJ功能開辟了新的方法。傳統(tǒng)的RNAi技術是以化學方法合成長度為21～23個核苷酸序列siRNA，瞬時轉染進入細胞后發(fā)揮其高效阻抑靶基因表達的作用，但合成費用昂貴，受轉染效率的影響，抑制效率也不高，而且只能達到短期抑制(2～7 d)。siRNA特異性表達載體的發(fā)明為細胞內(nèi)合成siRNA創(chuàng)造了條件。以“siRNA正義序列+發(fā)夾環(huán)+siRNA反義序列”為原則設計DNA模板克隆入siRNA特異性表達載體并轉染細胞后，其在細胞內(nèi)轉錄產(chǎn)生發(fā)夾樣的siRNA，在Dicer酶的作用下，發(fā)夾環(huán)被切除，生成siRNA從而引起基因沉默。載體上所帶的抗性基因能用于篩選出穩(wěn)定轉染細胞，從而實現(xiàn)更長時間及更高效的基因沉默效應。本研究成功構建了Cx43-siRNA真核表達載體，并將其穩(wěn)定轉染至兩種睪丸非生殖細胞系，從而建立了Cx43被長期抑制的兩株細胞系。以Western blot及“Parachute”熒光示蹤法檢測證實，此兩株細胞系的Cx43蛋白水平均明顯降低，GJ功能均被明顯抑制。以siRNA表達載體穩(wěn)定抑制Cx43表達的睪丸間質細胞和睪丸支持細胞系的建立，為研究Cx43及其組成的GJ在睪丸中的作用以及與睪丸疾病發(fā)生的關系提供了有效的工具。

［1］Pointis G，Segretain D.Role of connexin-based gap junction channels in testis［J］.Trends Endocrinol Metab，2005，16(7):300-6.

［2］Sohl G，Willecke K.Gap junctions and the connexin protein family［J］.Cardiovasc Res，2004，62(2):228-32.

［3］楊 燕，陶 亮.細胞縫隙連接與HSV-TK/GCV系統(tǒng)旁觀者效應的關系［J］.中國藥理學通報，2009，25(1):9-12.

［3］Yang Y，Tao L.The relationship of gap junction with the bystander effect in the HSV-TK/GCV treatment［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(1):9-12.

［4］Goldberg G S，Bechberger J F，Naus C C.A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer［J］.Biotechniques，1995，18(3):490-7.

［5］Sato T，Haimovici R，Kao R，et al.Downregulation of connexin 43 expression by high glucose reduces gap junction activity in microvascular endothelial cells［J］.Diabetes，2002，51:1565-71.

［6］潘國聘，王 玲，孫麗華，等.縫隙連接蛋白43在腦心綜合癥中的作用研究［J］.中國藥理學通報，2008，24(4):526-30.

［6］Pan G P，Wang L，Sun L H，et al.The effect of ventricular connexin 43 in cerebrocardial syndrome model rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(4):526-30.

［7］孫 華，劉耕陶.細胞間隙連接通訊與腫瘤［J］.中國藥理學通報，2004，20(11):1205-8.

［7］Sun H，Liu G T.Gap junctional intercellular communication and cancer［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(11):1205-8.

［8］Gilleron J，Carette D，Durand P，et al.Connexin 43 a potential regulator of cell proliferation and apoptosis within the seminiferous epithelium［J］.Int J Biochem Cell Biol，2009，41(6):1381-90.

［9］Sridharan S，Brehm R，Bergmann M，et al.Role of connexin 43 in Sertoli cells of testis［J］.Ann N Y Acad Sci，2007，1120:131-43.

［10］Pelletier R M.The distribution of connexin 43 is associated with the germ cell differentiation and with the modulation of the Sertoli cell junctional barrier in continual(guinea pig)and seasonal breeders′(mink)testes［J］.J Androl，1995，16(5):400-9.

［11］Goldenberg R C，F(xiàn)ortes F S，Cristancho J M，et al.Modulation of gap junction mediated intercellular communication in TM3 Leydig cells［J］.J Endocrinol，2003，177(2):327-35.

［12］Fiorini C，Tilloy-Ellul A，Chevalier S，et al.Sertoli cell junctional proteins as early targets for different classes of reproductive toxicants［J］.Reprod Toxicol，2004，18(3):413-21.