miR-101在胰腺癌組織中的表達(dá)以及對(duì)胰腺癌細(xì)胞ASPC-1增殖的影響

李先鵬 郭世偉 金震東 曲樂(lè)

·論著·

miR-101在胰腺癌組織中的表達(dá)以及對(duì)胰腺癌細(xì)胞ASPC-1增殖的影響

李先鵬 郭世偉 金震東 曲樂(lè)

目的觀察miR-101在胰腺癌組織中的表達(dá)，探討其對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響。方法采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)miR-101在胰腺癌組織、癌旁組織和胰腺癌細(xì)胞株ASPC-1中的表達(dá)。通過(guò)基因重組技術(shù)構(gòu)建miR-101的表達(dá)載體peGFPc1-miR-101，應(yīng)用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染到ASPC-1細(xì)胞，熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR-101的表達(dá)水平，以癌旁正常胰腺組織為1，折算成相對(duì)倍數(shù)；MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖率。利用在線軟件targetScan預(yù)測(cè)miRNA可能的靶基因。結(jié)果miR-101在胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞株ASPC-1中相對(duì)表達(dá)量分別為55%和39%，較癌旁正常胰腺組織顯著降低(P<0.01)。peGFPc1-miR-101轉(zhuǎn)染ASPC-1細(xì)胞后，miR-101表達(dá)增加，為對(duì)照組的19.8倍(P<0.01)，癌細(xì)胞增殖率明顯降低，最低僅為原代細(xì)胞的26%(P<0.01)。EZH2基因是miR-101影響胰腺癌細(xì)胞增殖活力的可能靶基因。結(jié)論胰腺癌組織miR-101低表達(dá)，它可能通過(guò)抑制EZH2的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞的增殖。

胰腺腫瘤； miR-101； 細(xì)胞增殖

微小RNA(microRNA，miRNA)是近期發(fā)現(xiàn)的生物體內(nèi)源長(zhǎng)度約為19～25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，通過(guò)與靶基因miRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)互補(bǔ)配對(duì)，而在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，導(dǎo)致miRNA的降解或翻譯抑制。最近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，在各種腫瘤組織中存在miRNA的異常表達(dá)[1]。目前已有胰腺癌組織的miRNA異常表達(dá)譜的報(bào)道[2]，但針對(duì)某一特定異常表達(dá)的miRNA在胰腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的功能作用尚缺乏研究。為此，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-101在胰腺癌組織中的表達(dá)，探討其對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響。

材料與方法

一、材料

真核表達(dá)質(zhì)粒載體peGFPc1購(gòu)自Clonetech公司，E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生物公司。胰腺癌細(xì)胞株ASPC-1為本實(shí)驗(yàn)室凍存。3例胰腺癌及其相應(yīng)癌旁正常胰腺組織為長(zhǎng)海醫(yī)院手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本。Trizol、脂質(zhì)體、miRNAs檢測(cè)試劑盒等均購(gòu)自Invitrogen公司，限制性內(nèi)切酶、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA marker、反轉(zhuǎn)錄酶、實(shí)時(shí)定量PCR試劑等均購(gòu)自TAKARA公司，MTT試劑盒購(gòu)自天根生物公司。

二、方法

1．miR-101表達(dá)的檢測(cè)：采用Trizol法提取胰腺癌組織、癌旁組織及胰腺癌細(xì)胞株ASPC-1細(xì)胞的總RNA。瓊脂糖凝膠電泳以及分光光度計(jì)分別檢測(cè)RNA濃度和質(zhì)量。

根據(jù)Gene Bank公布的人miR-1基因的序列，用primer primerer5.0軟件設(shè)計(jì)克隆引物。miR-101-F：GAAGATCTATATGGCCCATCTGAGGTTG，含Bgl Ⅱ酶切位點(diǎn)；miR-101-R：CCCAAGCTTAAAAACCTCCCACCACGAAT，含Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。內(nèi)參U6購(gòu)自Invitrogen公司。引物由Invitrogen公司合成。以100 ng總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，RT反應(yīng)條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。再利用taqman miRNA assay進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。PCR反應(yīng)：94℃ 10 min， 94℃ 30 s、60℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用Ct值分析，以癌旁正常胰腺組織表達(dá)量為1，折算為相對(duì)倍數(shù)。每組PCR實(shí)驗(yàn)均以持家基因U6作為內(nèi)參。

2．miR-101表達(dá)載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染：以人的基因組DNA為模板，PCR法擴(kuò)增miR-101片段。 PCR反應(yīng)條件：94℃ 10 min，94℃ 30 s、55℃ 20 s、72℃ 15 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。擴(kuò)增片段經(jīng)電泳分離、回收，由Invitrogen公司負(fù)責(zé)測(cè)序。測(cè)序正確后，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶酶切，連接至質(zhì)粒peGFPc1中，構(gòu)建miR-101表達(dá)載體peGFPc1-miR-101。

將ASPC-1細(xì)胞按1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)60%～70%后，采用脂質(zhì)體Lipofectamine-2000將peGFPc1-miR-101轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以僅加入脂質(zhì)體的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

3．轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖率檢測(cè)：轉(zhuǎn)染后0、12、24、48、72 h收集細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。細(xì)胞相對(duì)增殖率=(實(shí)驗(yàn)孔A530-空白孔A530)/(陰性對(duì)照孔A530值-空白孔A530)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

4．miRNA靶基因的預(yù)測(cè)：采用miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件targetScan(http://www.targetscan.org/)篩選miR-101靶向作用的基因。

結(jié) 果

一、 miR-101在胰腺癌組織中的表達(dá)

miR-101在胰腺癌和胰腺癌細(xì)胞株ASPC-1的相對(duì)表達(dá)量分別是癌旁正常胰腺組織的55%和39%，較癌旁正常胰腺組織顯著降低(P<0.01)。

二、peGFPc1-miR-101的鑒定

帶GFP報(bào)告基因的peGFPc1-miR-101轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，>70%的ASPC-1細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光基因信號(hào)(圖1a)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的miR-101表達(dá)量明顯升高，為陰性對(duì)照組的19.8倍(P<0.01)，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間無(wú)明顯變化 (圖1b)。

圖1peGFPc1-miR-101轉(zhuǎn)染的ASPCA-1細(xì)胞(a)及其miR-101表達(dá)(b)

三、轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖的變化

轉(zhuǎn)染后12 h，細(xì)胞的增殖率降低，為對(duì)照組的85%；轉(zhuǎn)染后24 h，增殖率僅為對(duì)照組的27%(P<0.01)；轉(zhuǎn)染后72 h，增殖率為對(duì)照組的26%(P<0.01，圖2)。

圖2 轉(zhuǎn)染后ASPC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

四、miR-101抑制靶基因的篩選

根據(jù)targetScan的預(yù)測(cè)，miR-101在Zeste基因增強(qiáng)子(EZH2)的3′-UTR區(qū)域中有兩個(gè)作用位點(diǎn)，能較強(qiáng)地抑制該基因的表達(dá)(圖3)。

圖3 miR-101在Zeste基因增強(qiáng)子(EZH2)的靶位點(diǎn)

討 論

隨著研究的不斷深入，目前認(rèn)為miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有與癌基因或抗癌基因相似的作用[3]。因此，深入研究miRNA在腫瘤中的功能，了解其作用的機(jī)制和通路，對(duì)腫瘤的治療、診斷以及進(jìn)程監(jiān)控都具有重要意義[4]。

miR-101是脊椎動(dòng)物所特有的一個(gè)miRNA，它有兩個(gè)前體，分別位于人的1號(hào)染色體和9號(hào)染色體中，但其成熟序列在各個(gè)物種中高度保守。目前已有研究證實(shí)，miR-101在肝癌、前列腺癌等實(shí)體腫瘤中發(fā)揮著重要的作用[5-7]。本結(jié)果顯示，miR-101在胰腺癌組織中表達(dá)降低，而轉(zhuǎn)染表達(dá)miR-101的胰腺癌細(xì)胞的增殖被明顯抑制，提示miR-101在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著如同抑癌基因的重要作用。Zeste基因增強(qiáng)子(EZH2)基因是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一個(gè)組蛋白甲基化酶，具有促進(jìn)目標(biāo)基因沉默的能力，對(duì)癌細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移也具有重要的調(diào)控功能。

EZH2過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞具有侵入性，加快實(shí)體腫瘤組織癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[8]。本實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)miR-101靶點(diǎn)在EZH2基因的3′-UTR區(qū)域，能抑制該基因的的轉(zhuǎn)錄后水平，從而達(dá)到抑制癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

最近也有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞的抗凋亡基因MCL-1也是miR-101的靶基因之一[4,9-10]。MCL-1是一種受高度調(diào)節(jié)的蛋白，其表達(dá)受到各種生存及分化信號(hào)的調(diào)節(jié)。細(xì)胞凋亡的過(guò)程中它的表達(dá)下調(diào)，在細(xì)胞的存活過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。因此推測(cè)，在胰腺癌細(xì)胞的增殖過(guò)程中，MCL-1基因的表達(dá)可能也受miR-101的調(diào)控。

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2010-05-26)

(本文編輯：屠振興)

TheexpressionofmiR-101inpancreaticcanceranditseffectonproliferationofpancreaticcancercelllineASPC1

LIXian-peng,GUOShi-wei,JINZhen-dong,QULe.

DepartmentofGatroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

ObjectiveTo investigate the expression of miR-101 in pancreatic cancer and the effect of down-regulation miR-101 on proliferation of pancreatic cancer cell line ASPC1.MethodsReal-time PCR was used to determine the expression of miR-101 in pancreatic cancer, adjacent tissues and pancreatic cancer cell line ASPC-1. The miR-101 over-expression vector (peGFPc1-miR-101) was constructed and was transfected into ASPC-1 cell. Transfection efficiency was measured by fluorescence microscope. The expression of miR-101in the transfected cells was detected by real-time PCR. Cell viability analysis was performed by MTT. The targeted genes of miR-101 in pancreatic cancer were scanned by the online targeted gene prediction software (target Scan).ResultsThe expression of miR-101 was in pancreatic cancer tissues, adjacent tissues and ASPC-1 cell line, respectively. The expressions in pancreatic cancer tissues and ASPC-1 cells were significantly lower than that in adjacent tissues (P<0.01). The expression of miR 101 in transfected cells increased to 19.8 folds as much as that in the control group (P<0.01). Proliferation rate of transfected cells was significantly decreased, which was only 26% of primary cells (P<0.01). EZH2 was the potential targeted gene of miR-101 in pancreatic cancer.ConclusionsmiR-101 was weakly expressed and it may affect the proliferation of pancreatic cancer cell by inhibiting the EZH2 expression.

Pancreatic neoplasms; miR-101; Cell proliferation

Correspongdingauthor：JINZhen-dong,Email:zhendjin@126.com

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.016

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科(李先鵬、金震東)，普外三科(郭世偉)；第二軍醫(yī)大學(xué)(曲樂(lè))

共同第一作者：郭世偉

金震東，Email:zhendjin@126.com