利用蛋白質(zhì)微陣列篩選抗胸腺瘤優(yōu)勢抗原表位

方 序，王軼雄，羅陳啟，聞樹群，陳 敏

(1.浙江省微生物研究所，浙江 杭州 310012；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬二院，浙江 杭州 310009；3.杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)發(fā)病率近年在我國呈明顯上升趨勢，重癥肌無力是一類自身免疫病，是由于機(jī)體免疫抑制性T細(xì)胞功能減弱，在自身反應(yīng)性Th細(xì)胞協(xié)同作用下，以神經(jīng)肌肉接頭處的N型乙酰膽堿受體(Nicotinic acetylcholine receptor, AChR)等分子作為抗原誘發(fā)自身抗體，通過抗體依賴的補(bǔ)體溶解作用參與對(duì)突觸后膜運(yùn)動(dòng)終板的破壞，導(dǎo)致神經(jīng)肌肉傳遞功能障礙，從而引發(fā)了一系列臨床癥狀[1-3]．目前發(fā)現(xiàn)MG除了產(chǎn)生抗乙酰膽堿受體抗體外，還產(chǎn)生針對(duì)胸腺瘤相關(guān)抗原Titin等多種抗原成分的自身抗體．Titin是個(gè)大分子蛋白，是維持橫紋肌功能的關(guān)鍵組分．以前的自身抗體檢測集中在它的一個(gè)多肽片段(MGT30)上[4]，除了MGT30，MG血清是否還存在Titin其他表位自身抗體呢？探明抗Titin抗體識(shí)別抗原表位，特別是優(yōu)勢抗原線性表位對(duì)進(jìn)一步的免疫干預(yù)有重要意義．但迄今為止尚缺少相應(yīng)文獻(xiàn)報(bào)道．在此通過設(shè)計(jì)了多個(gè)針對(duì)Titin蛋白胞外區(qū)的多肽序列，用蛋白質(zhì)微陣列的方法篩選抗Titin抗體識(shí)別的優(yōu)勢抗原表位，結(jié)果報(bào)告如下．

1 材料與方法

1.1 樣 本

共收集重癥肌無力患者新鮮血清84例，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室提供．重癥肌無力診斷均由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科確認(rèn)．所有樣本經(jīng)ELISA法檢測為抗AchR自身抗體陽性．

1.2 多肽設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)偶聯(lián)

表1 合成多肽序列

根據(jù)生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)9條針對(duì)Titin蛋白胞外區(qū)多肽序列見表1．多肽合成采用固相合成法(SPPS)，合成后的多肽再采用琥珀酰亞胺4-[N-甲基馬來酸]-1-羧環(huán)己烷(SMCC)雙功能交聯(lián)劑在多肽巰基端與牛血清白蛋白(BSA)的氨基端偶聯(lián)．

1.3 蛋白質(zhì)微陣列點(diǎn)制

用BCD法調(diào)整各蛋白濃度后，用蛋白點(diǎn)樣儀按8×12的方式將各多肽-BSA偶聯(lián)蛋白點(diǎn)樣于硝酸纖維膜(100 ng/點(diǎn))，每個(gè)多肽檢測重復(fù)6次，同時(shí)設(shè)立β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)內(nèi)參照，待干燥后，用5%小牛血清封閉后，備用．

1.4 蛋白質(zhì)微陣列檢測

將待檢稀釋血清(1∶100，用5%小牛血清稀釋)與微陣列芯片反應(yīng)室溫2 h，用含0.5%Tween 20的0.01 mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌5次，再加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗室溫1 h，用含0.5%Tween 20的0.01 mol/L，pH7.4的PBS洗滌4次和無Tween 20的0.01 mol/L，pH7.4 PBS洗滌1次，最后加入CDP-star發(fā)光底物，曝光顯色1 min．將微陣列檢測結(jié)果轉(zhuǎn)換成TIFF圖片格式后，用Array2.0 version軟件分析，凡反應(yīng)信號(hào)與對(duì)照比較相差1.5倍以上者，為陽性，否則為陰性．

1.5 微陣列結(jié)果驗(yàn)證

對(duì)微陣列檢測陽性結(jié)果分別用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法進(jìn)行驗(yàn)證．將各多肽-BSA偶聯(lián)蛋白以1 μg/mL濃度包被微孔，過夜，次日取出，用含0.5%Tween 20的0.01 mol/L，pH7.4 PBS洗滌3次，用5%小牛血清封閉后，加入100 μL用5%小牛血清1∶100稀釋的待檢稀釋血清，37 ℃反應(yīng)2 h，洗滌5次，再加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫1 h，洗滌5次，最后加入鄰苯二胺底物100 μL/孔，室溫避光顯色5～10 min．加入50 μL/孔硫酸終止反應(yīng)，在490 nm處測各孔吸光度(A)．凡A值≥對(duì)照1.5倍者，判為陽性，否則為陰性．

2 結(jié) 果

2.1 重癥肌無力患者血清針對(duì)各多肽自身抗體陽性例數(shù)

在84例MG血清中，51例抗多肽自身抗體陽性，陽性率為60.71%．經(jīng)蛋白質(zhì)微陣列方法篩選，結(jié)果表明，在設(shè)計(jì)的9條多肽抗原中，針對(duì)多肽P5、P6和P9的陽性例數(shù)高于其他各多肽(見圖1)．經(jīng)卡方檢驗(yàn)，P<0.05．說明P5、P6和P9是優(yōu)勢識(shí)別表位．

2.2 P5、P6和P9識(shí)別表位交叉性鑒定

為鑒定P5、P6和P9識(shí)別表位有無交叉性，筆者分析了各樣本之間的共同陽性情況．發(fā)現(xiàn)P5與P9多肽共同陽性有8例(44.4%)，而P5與P6多肽、P6與P9多肽間共同陽性例數(shù)明顯低于P5與P9多肽間(見圖2)，P<0.05．P5、P6和P9均陽性的血清僅2例．結(jié)果表明，自身抗體識(shí)別的P5與P9多肽表位存在交叉性．

圖1 重癥肌無力患者血清針對(duì)各多肽自身抗體陽性例數(shù)Fig. 1 Positive rate of autoantibodies to designed peptides of Titin in myasthenia gravis

圖2 P5、P6和P9識(shí)別表位交叉性鑒定Fig. 2 Validation of overlapped epitopes recognized by P5, P6, P9

2.3 ELISA驗(yàn)證試驗(yàn)

圖3 ELISA驗(yàn)證試驗(yàn)Fig. 3 Identification by ELISA assay

將微陣列檢測陽性結(jié)果分別用ELISA法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果100%重復(fù)；并且均能被多肽抗原阻斷，說明自身抗體與多肽結(jié)合呈特異性，蛋白質(zhì)微陣列方法篩選有效性好，如圖3所示．

3 討 論

重癥肌無力個(gè)體中，約85%的患者體內(nèi)存在針對(duì)AChR分子的自身抗體，致病性自身抗體的主要結(jié)合靶點(diǎn)位于AChR分子亞單位上的主要免疫原性區(qū)(main immunogenic region，MIR)．依賴抗體的補(bǔ)體溶解作用是AChR分子破壞的主要原因；同時(shí)抗體介導(dǎo)的抗原調(diào)變作用也加速了AChR分子的內(nèi)化和溶酶體的降解作用，使得AChR分子的半衰期由7 d降至2 d，體內(nèi)神經(jīng)突觸后膜上功能性AChR分子的數(shù)量急劇減少．在單純眼外肌型患者體內(nèi)，僅有50%的血清學(xué)陽性率，而這些患者自身性抗體的主要結(jié)合靶點(diǎn)是胎兒型AChR分子．胎兒型AChR分子與成人型AChR分子最大的區(qū)別是AChR五聚體分子中的亞單位替代了t亞單位．胎兒型AChR分子主要分布于眼外肌，因此這類自身抗體導(dǎo)致了患者單純眼外肌受累，而無其它相關(guān)臨床癥狀出現(xiàn)．重癥肌無力患者血清中除乙酰膽堿受體抗體(AchRab)外，還可以檢測到其他自身抗體．如抗肌動(dòng)蛋白(actin)抗體、肌球蛋白(myosin)抗體、輔肌動(dòng)蛋白(α-actinin)抗體、肌聯(lián)蛋白(titin)抗體、AChR分子相關(guān)瞄定蛋白(mpsyn)抗體和肌肉特異性酪氨酸激酶(muscle specific tyrosine kinase Musk)抗體等．在這些自身抗體中，尤其是Titin在重癥肌無力伴胸腺瘤患者和重癥肌無力晚期中與疾病進(jìn)展密切相關(guān)[5-7]．

調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞在自身免疫性疾病和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用．現(xiàn)有研究已證實(shí)腫瘤組織局部表現(xiàn)為Treg細(xì)胞免疫功能抑制，激活Treg細(xì)胞可導(dǎo)致動(dòng)物移植腫瘤消退；而在自身免疫性疾病中Treg細(xì)胞免疫功能過度激活．因而抑制Treg細(xì)胞功能可能是自身免疫性疾病治療的新方法．篩選和鑒定抗原特異性Treg細(xì)胞是免疫治療的前提和基礎(chǔ)．重癥肌無力中95%的患者外周血可檢測到抗Titin抗體，表明Titin在重癥肌無力患者中是優(yōu)勢識(shí)別抗原，提示重癥肌無力患者中存在Titin特異性Treg細(xì)胞，可從Titin蛋白分子中篩選和鑒定抗原特異性Treg細(xì)胞識(shí)別的抗原線性表位．Titin是個(gè)巨大的微絲狀蛋白質(zhì)，在橫紋肌中單一的Titin跨越半個(gè)肌小節(jié)．Titin從Z-盤狀轉(zhuǎn)變?yōu)镸-線狀在肌肉結(jié)構(gòu)、功能和發(fā)育過程中起重要作用．盡管Titin分子量巨大，但自身抗體識(shí)別的表位主要集中在主要免疫原性區(qū)(MIR)，MGT30(30 kD)．除了MGT30外是否還存在其他識(shí)別的表位呢？目前并不清楚．

微陣列和芯片診斷技術(shù)具有同時(shí)對(duì)幾十個(gè)，乃至數(shù)萬個(gè)基因或蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，不僅大大減少了分別檢測的人力和物力，而且同時(shí)分析時(shí)克服了實(shí)驗(yàn)室的檢測誤差[8-9]．該研究采用生物信息學(xué)的手段，在微陣列檢測的基礎(chǔ)上，分別對(duì)單個(gè)表位抗體的診斷有效性進(jìn)行評(píng)估，通過對(duì)其有效性的不斷擬合，克服了單個(gè)檢測的不足．用該方法從中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)多肽表位在重癥肌無力患者中呈優(yōu)勢表達(dá)，但其是否為對(duì)抗原特異性Treg細(xì)胞識(shí)別表位需進(jìn)一步研究．

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