木犀草素對(duì)四氯化碳致大鼠肝纖維化的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

李林林,龔國(guó)清,馮貽東,王 寅

(中國(guó)藥科大學(xué) 藥理教研室 藥學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,江蘇 南京 210009)

肝纖維化主要是一種病理概念,系指肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix,ECM)成分過度增生與異常沉積,所導(dǎo)致的肝臟結(jié)構(gòu)和(或)功能異常改變的病理變化。研究發(fā)現(xiàn)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)是過多 ECM沉積的主要來源細(xì)胞,抑制HSC活化增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡是肝纖維化防治的方向[1]。木犀草素(luteolin)是一種很具有代表性的天然黃酮,具有抗菌、消炎、抗腫瘤等多種藥理作用[2-4],并且是白毛夏枯草中治療慢性支氣管炎的主要活性成分。本研究探討了木犀草素對(duì)大鼠肝纖維化的保護(hù)作用,為開發(fā)有潛力的抗肝纖維化藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

木犀草素,杭州福斯特藥業(yè)有限公司,批號(hào):080511;四氯化碳(CCl4,分析純),汕頭市西隴化工廠有限公司,批號(hào):080103-2;秋水仙堿,昆明制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn),批號(hào):090325-01;透明質(zhì)酸(HA)、層黏蛋白(LN)放射免疫分析藥盒,北京北方生物技術(shù)研究所,批號(hào):20100120;谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、肝組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛 (MDA)、羥脯氨酸(Hyp)測(cè)定試劑盒,南京建成生物工程研究所;新生牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司;DMEM(高糖)培養(yǎng)基,美國(guó) Gibco公司;胰蛋白酶,Amresco公司;MTT,Amresco公司。

1.2 動(dòng)物與細(xì)胞

SD大鼠 50只,體重 180～220 g,♂♀各半,南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SCXK(蘇)2002-0031。

大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6),為SV40轉(zhuǎn)染 SD大鼠 HSC,為永生化細(xì)胞,表型為活化的HSC,具纖維化特性,購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù);人肝星狀細(xì)胞(Lx-2),美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(American Type Culture Collection),由華僑大學(xué)呂穎慧博士惠贈(zèng)。

1.3 肝纖維化大鼠模型建立

將大鼠隨機(jī)分為5組,每組10只,分別為空白對(duì)照組、CCl4模型組、秋水仙堿陽(yáng)性對(duì)照組(0.2mg/kg)、木犀草素低劑量(20mg/kg)組和高劑量(80mg/kg)組,其中秋水仙堿和木犀草素均研磨后用0.5%CMC-Na溶液混懸后給藥,灌胃體積均為1mL/100 g。全部動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周后,對(duì)照組與模型組給予 0.5%CMC-Na溶液,其余組灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物,1次/d。同時(shí),對(duì)照組皮下注射花生油溶液,其余各組每周 2次按0.2mL/100 g劑量皮下注射 40%CCl4花生油溶液(首劑量用純CCl4),連續(xù) 12周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)和方法

末次給藥后,禁食不禁水過夜,24 h后摘眼球取血,分離出血清。另取左葉肝組織用10%中性甲醛固定,石蠟包埋切片,HE染色,光鏡下觀察其組織形態(tài)學(xué)變化;采血后取肝右葉約0.5 g,在低溫條件下剪碎,放入勻漿器中,再加入9倍體積的冷生理鹽水,研磨成勻漿后,離心取得肝勻漿液。

按照試劑盒說明書檢測(cè)血清 ALT、AST、TP、Alb、肝組織SOD、MDA、Hyp。按照試劑盒操作說明用放射免疫法測(cè)定血清 HA、LN。

1.5 MTT法檢測(cè) HSC-T6增殖抑制率

取指數(shù)生長(zhǎng)期 HSC-T6(5×104/mL)接種于96孔培養(yǎng)板中,100μL/孔,在37℃,5%CO2條件下孵育,24 h后加無血清培養(yǎng)液37℃再孵育 24 h,使細(xì)胞生長(zhǎng)同步進(jìn)入休止期。棄上清,換含不同濃度藥物(木犀草素濃度為1,10,100μmol/L)的全培養(yǎng)液200 μL/孔,每組6復(fù)孔,培養(yǎng)至24,48,72 h,終止培養(yǎng)前 4 h加5mg/mL MTT溶液20μL/孔,棄上清液,加入二甲亞砜(DMSO)150 μL/孔,震蕩混勻,在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度(A)值。細(xì)胞增殖抑制率(IR)=(1-A實(shí)驗(yàn)/A對(duì)照)×100%。

1.6 木犀草素對(duì)Lx-2增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lx-2以1×104個(gè)/mL濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔加入細(xì)胞懸液0.2mL,置于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 24 h。待大部分細(xì)胞貼壁后棄上清,加入含不同濃度木犀草素的DMEM培養(yǎng)基,木犀草素各組的濃度分別為20,25,30,35,40 mol/L,另設(shè)空白對(duì)照組。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,48,72,96 h后,每孔加入5mg/mLMTT溶液20μL,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后輕輕吸盡上清液,每孔加入DMSO 150μL,溶解細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶,在492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況

正常組大鼠的精神好,活動(dòng)佳,飲食正常,體重增加明顯,大便正常,皮毛有光澤;模型組大鼠精神萎靡,活動(dòng)明顯減少,體重增加慢且飲食少,大便稀水樣,皮毛無光澤而且略發(fā)黃。木犀草素高、低劑量組及秋水仙堿陽(yáng)性對(duì)照組的大鼠精神活動(dòng)尚可,皮毛有光澤,體重亦增加,但比正常組的大鼠體重低,狀態(tài)好于模型組。

2.2 木犀草素對(duì)肝纖維化大鼠肝功能的影響

結(jié)果見表1。模型組大鼠的血清 ALT、AST明顯升高,TP、Alb顯著降低,與正常對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.01或 P＜0.05),各給藥組均可降低大鼠血清 ALT、AST的含量(P＜0.01),改善 TP,升高 Alb(P＜0.05)的含量。

表1 木犀草素對(duì)CCl4致大鼠肝損傷肝功能的影響(n=10,±s)Tab.1 Effect of luteolin on the hepatic function in rats with CCl4 induced liver fibrosis(n=10,±s)

表1 木犀草素對(duì)CCl4致大鼠肝損傷肝功能的影響(n=10,±s)Tab.1 Effect of luteolin on the hepatic function in rats with CCl4 induced liver fibrosis(n=10,±s)

與正常組比較:1P＜0.05,2P＜0.01;與模型組比較:3P＜0.05,4P＜0.01Compared with control group:1 P＜0.05,2P＜0.01;Compared with modle group:3P＜0.05,4 P＜0.01

秋水仙堿組 0.2 177.4±13.14 207.9±35.84 65.1±4.41 29.2±2.73

2.3 木犀草素對(duì)大鼠血清 HA、LN及肝組織SOD、MDA、Hyp的影響

結(jié)果見表2。12周時(shí)肝纖維化模型組血清HA、LN顯著升高,肝組織MDA、Hyp含量明顯升高,SOD活性顯著降低,與正常組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較,木犀草素高、低劑量組與秋水仙堿陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的HA、LN顯著降低(P＜0.05),肝組織MDA、Hyp含量明顯下降(P＜0.05或 P＜0.01),而且這三組均可以顯著升高 SOD的活性(P＜0.05或 P＜0.01)。

表2 木犀草素對(duì)CCl4致肝損傷大鼠血清 HA、LN及肝組織SOD、MDA、Hyp的影響(n=10,±s)Tab.2 Effects of luteolin on the levels of serum HA,LNand thecontents of SOD,MDA,Hyp in rats with CCl4 induced liver fibrosis(n=10,±s)

表2 木犀草素對(duì)CCl4致肝損傷大鼠血清 HA、LN及肝組織SOD、MDA、Hyp的影響(n=10,±s)Tab.2 Effects of luteolin on the levels of serum HA,LNand thecontents of SOD,MDA,Hyp in rats with CCl4 induced liver fibrosis(n=10,±s)

與正常組比較:1P＜0.01;與模型組比較:2 P＜0.05,3P＜0.01Compared with control group:1P＜0.01;Compared with modle group:2P＜0.05,3P＜0.01

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2.4 肝組織病理學(xué)變化

2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察 正常組為正常肝臟表現(xiàn),顏色深紅,表面光滑,質(zhì)地較軟;纖維化模型組肝臟體積增大,顏色淺,灰黃色,表面有粗顆粒狀;木犀草素低劑量組與秋水仙堿組大鼠肝臟體積有顯著增大,顏色淺,表面欠光滑;木犀草素高劑量組大鼠肝臟顏色呈暗紅色,體積略增大,邊緣略鈍,表面欠光滑。

2.4.2 組織病理學(xué)分析 HE染色觀察結(jié)果顯示,正常對(duì)照組的肝組織肝細(xì)胞索排列規(guī)則有序,結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀分布,肝組織內(nèi)無脂肪空泡,僅匯管區(qū)和中央靜脈有少許膠原纖維存在;模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,肝索排列紊亂,少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),纖維組織增生明顯,將肝小葉分隔成大小不等的肝細(xì)胞團(tuán),肝細(xì)胞廣泛變性壞死,匯管區(qū)擴(kuò)大、膠原沉積;同纖維化模型組比較,木犀草素低劑量肝小葉結(jié)構(gòu)破壞程度降低,肝臟膠原纖維增生亦減輕,纖維條索疏松變窄;木犀草素高劑量組結(jié)締組織增生不明顯,肝小葉結(jié)構(gòu)明顯改善,肝細(xì)胞脂肪空泡變性減少,炎性反應(yīng)及壞死減輕;秋水仙堿組肝小葉樣結(jié)構(gòu)較正常,肝細(xì)胞體積增大,間質(zhì)增生較明顯,輕于模型組。見圖1。

2.5 木犀草素對(duì)HSC-T6及Lx-2增殖的影響

木犀草素對(duì)HSC-T6的增殖有明顯的抑制作用,且隨著濃度的上升而抑制率逐漸升高,并且呈明顯的時(shí)間劑量依賴性。10μmol/L木犀草素48 h時(shí)的抑制率達(dá) 34.4%;對(duì)Lx-2細(xì)胞增殖也有一定抑制作用,40μmol/L木犀草素48 h時(shí)的抑制率達(dá)18.7%。本犀草素對(duì)兩種細(xì)胞的抑制結(jié)果有所不同,可能與人和大鼠 HSC對(duì)木犀草素的敏感性不同有關(guān)。

圖1 肝組織切片HE染色(×100)Fig.1 Light microscopy showing liver tissue in each group(HE staining,×100)

3 討 論

各種原因引起的肝細(xì)胞脂肪變性、淤膽及炎癥等,達(dá)到一定嚴(yán)重程度均可刺激肝內(nèi)局部貯脂細(xì)胞、靜止的纖維母細(xì)胞增生并形成膠原纖維,增多的纖維組織形成細(xì)小的條索和菲薄的間隔,使肝臟纖維化。肝纖維化是各種病因所致的慢性肝病的共同病理過程,也是向肝硬化發(fā)展的主要中間環(huán)節(jié)[5],對(duì)它早期診斷和及時(shí)抗纖維化治療,對(duì)肝硬化的防治、延緩、逆轉(zhuǎn)等都起到極大的作用。

本實(shí)驗(yàn)中,木犀草素組與模型組比較,顯著降低血清 ALT、AST,升高 Alb,反映出木犀草素對(duì)肝臟有一定的保護(hù)作用。Hyp是膠原蛋白所特有的氨基酸,測(cè)定Hyp含量可明確膠原總體水平,評(píng)定纖維化病變程度。本實(shí)驗(yàn)中,模型組Hyp顯著升高,而各給藥組Hyp明顯降低。因?yàn)镠A、LN與肝纖維化形成關(guān)系密切[6-7],本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了血清 HA、LN的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清 HA、LN顯著升高,而藥物組血清 HA、LN濃度較模型組明顯減小。提示通過木犀草素干預(yù),能減少膠原的生成,抑制肝纖維化的進(jìn)程。同時(shí),木犀草素能明顯降低肝纖維化大鼠肝組織中的MDA的水平和提高 SOD的活性,說明木犀草素能提高肝組織的抗氧化酶 SOD活性,抑制自由基的產(chǎn)生,促進(jìn)其清除,并能抑制氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),使 MDA生成減少,從而對(duì)肝組織起保護(hù)作用,使大鼠肝纖維化減輕,提示抗脂質(zhì)過氧化作用可能是其抗肝纖維化的作用機(jī)理之一。

近年來,抑制HSC的增殖,促進(jìn)其凋亡是抗肝纖維化研究的熱點(diǎn)[8],目前的許多關(guān)于抗肝纖維化的研究都是在大鼠及其 HSC上進(jìn)行的,鑒于人與鼠具有不同的種屬特異性,從大鼠身上獲得的研究成果并不一定適用于人。Lx-2細(xì)胞株保留了人 HSC的主要特征,為將從大鼠 HSC上獲得的研究成果應(yīng)用于人類提供了很好的工具[9]。

抗纖維化治療,尚缺乏有效或較為理想的藥物,目前中醫(yī)藥在抗肝纖維化方面具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì),并已證實(shí)有抑制與逆轉(zhuǎn)作用[10]。木犀草素對(duì)CCl4致大鼠肝纖維化有明確的抑制作用,關(guān)于其抗肝纖維化的進(jìn)一步的機(jī)制問題,還有待深入研究。

致謝:感謝華僑大學(xué)分子藥物學(xué)研究所呂穎慧博士提供人肝星狀細(xì)胞(Lx-2)及對(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的大力幫助。

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