腎上腺素對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞增殖、分化及其細(xì)胞內(nèi)cAMP的影響

戴 冰,肖子曾,黃開(kāi)顏,彭 柳,郭小鴿,趙 婧

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院,2.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙 410007)

增殖和分化是細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的兩個(gè)不同方向,人及動(dòng)物的脂肪組織含有增殖、分化活躍的前脂肪細(xì)胞,它對(duì)脂肪組織的增生、肥大起重要的作用,脂肪組織在體內(nèi)受到各種因素包括體液、神經(jīng)和激素的作用。腎上腺素類(lèi)是重要的神經(jīng)遞質(zhì)和內(nèi)分泌物質(zhì),有研究證明,腎上腺素可升高視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平,其作用機(jī)制是通過(guò)結(jié)合RPE細(xì)胞膜上 β受體,使細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加[1]。有報(bào)道腎上腺素對(duì)人前脂肪細(xì)胞有刺激增殖、分化作用[2],但腎上腺素對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞增值和分化的作用未見(jiàn)報(bào)道。本文選用腎上腺素作用大鼠前脂肪細(xì)胞,旨在探討腎上腺素對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響及其作用機(jī)制。

1 材 料

1.1 動(dòng)物

健康SD大鼠,清潔級(jí),雌雄各半,體重(200±20)g,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK(豫)2005-0001。

1.2 試劑

腎上腺素、細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM/低糖),美國(guó)Hyclone公司;胎牛血清,蘭州民海生物有限公司;胰酶,Sigma公司;cAMP試劑盒,上海中醫(yī)藥大學(xué)同位素室;其余試劑均為分析純。

1.3 儀器

3K30型高速冷凍離心機(jī),Sigma公司;UV-1600紫外分光光度計(jì),北京瑞利分析儀器公司產(chǎn)品;佳能照相系統(tǒng)、XDS-1B體式倒置相差顯微鏡,日本Olympus;Heracell型細(xì)胞培養(yǎng)箱,德國(guó)賀利氏。

2 方法與結(jié)果

2.1 磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制

NaCl8.00g,KCl0.20g,Na2HPO4·12H2O3.49g,KH2PO40.20g溶于去離子水1000mL,調(diào)整pH值為7.2,高壓滅菌,4℃保存。

2.2 大鼠前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代

取雄性大鼠腹股溝部純凈脂肪顆粒,用PBS洗滌后剪成0.5～1mm3大小的顆粒,1 000 r/min離心 10 min取上層純脂肪顆粒,輕輕地鋪于經(jīng)培養(yǎng)液潤(rùn)濕的培養(yǎng)瓶壁上。3～5min后徐徐加入含20%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液5～10mL,塞緊瓶塞,將底面翻轉(zhuǎn)朝上。37℃、5%CO2培養(yǎng)1～2h,待黏附牢固后,翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶做正常培養(yǎng),每日觀察。原代培養(yǎng)區(qū)域性單層匯合達(dá)到約1/2瓶底面積后即可傳代,取培養(yǎng)7代以?xún)?nèi)的大鼠前脂肪細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 大鼠前脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)血線

按馬瑾瑜等[3]的方法測(cè)定。結(jié)果如圖1。從生長(zhǎng)曲線可見(jiàn)前脂肪細(xì)胞的倍增時(shí)間約為60 h左右。

2.4 組織化學(xué)提取法測(cè)定大鼠前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的標(biāo)志物——磷酸甘油脫氫酶(GPDH)

根據(jù)Stuart等[4]的方法進(jìn)行測(cè)定,吸棄培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液,用PBS沖洗 2～3次,每孔加入凍存的細(xì)胞超聲破碎溶液0.5mL,搖晃數(shù)分鐘,將含有細(xì)胞的懸液加入小瓶中冰浴30～60s,用分光光度法測(cè)定GPDH的活性。吸取已配制的酶測(cè)定液1.5mL,加入待測(cè)溶液300μL,測(cè)定340 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值,加入磷酸二羥丙酮 100μL,1 min后再次測(cè)定340 nm波長(zhǎng)處的A值。1單位GPDH的活性為每1min氧化NADH 1.0nmol的量。作出時(shí)間-A值曲線。結(jié)果如圖2。圖2表明,傳代細(xì)胞形成單層匯合后,在10μmol/L胰島素和1μmol/L地塞米松的作用下即開(kāi)始上升并迅速增加,9d左右到達(dá)高峰并維持在高水平。形態(tài)上表現(xiàn)為單層匯合1周后,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴。而傳代的前脂肪細(xì)胞不能自發(fā)形成分化。

圖1 前脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of preadipocytes

圖2 前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中GPDH的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 The dynamic change of GPDH in preadipocyte differentiation process

2.5 油紅O染色提取法測(cè)定脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪含量

根據(jù)Ramirez等方法測(cè)定,吸棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,用PBS沖洗2～3次,加入10%的甲醛緩沖液室溫下固定1h,去固定液,加入油紅O染色,室溫下染色2h,去染色劑,以無(wú)菌雙蒸水沖洗2次,洗去未著色的染料,倒置顯微鏡下觀察,照相。結(jié)束后,以DMSO溶解,測(cè)定490nm波長(zhǎng)處的A值。結(jié)果如圖3。由圖3可見(jiàn),前脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂肪含量在單層形成6～7d后迅速增加,11d左右到達(dá)高峰,與形態(tài)學(xué)上的單層匯合后1周左右細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪顆粒完全吻合。細(xì)胞內(nèi)脂肪含量的增加比 GPDH的出現(xiàn)要晚約6d。說(shuō)明酶的出現(xiàn)在先,脂肪出現(xiàn)在后。

2.6 前脂肪細(xì)胞的指標(biāo)測(cè)定

取傳代7代以?xún)?nèi)的細(xì)胞分為:空白組,腎上腺素組,腎上腺素+普萘洛爾組,測(cè)定細(xì)胞的增殖、GP-DH及細(xì)胞內(nèi)脂肪含量,結(jié)果如表1。

圖3 前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)脂肪含量的變化Fig.3 The changes of cell′s fat content in preadipocyte differentiation process

表1 腎上腺素對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞增殖、分化的影響(±s,n=6)Tab.1 Effects of epinephrine on rat preadipocyte proliferation and differentiation(±s,n=6)

表1 腎上腺素對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞增殖、分化的影響(±s,n=6)Tab.1 Effects of epinephrine on rat preadipocyte proliferation and differentiation(±s,n=6)

與空白對(duì)照組比較:1 P＜0.05,2P＜0.01;與腎上腺素組比較:3 P＜0.051 P＜0.05,2 P＜0.01 vs control group;3P＜0.05 vs epinephrine group

普萘洛爾+腎上腺素組0.23±0.05 0.58±0.06 0.47±0.07

表1表明,腎上腺素組、普萘洛爾 +腎上腺素組與空白對(duì)照組比較,前者各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著性差異,后者無(wú)著性差異;提示腎上腺素對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用,對(duì)分化過(guò)程中 GPDH的升高及脂肪積聚均有抑制作用,β受體阻滯劑普萘洛爾可以阻斷腎上腺素誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞增殖的促進(jìn)及對(duì)分化過(guò)程中 GPDH的升高及脂肪積聚的抑制作用。

2.7 不同時(shí)間點(diǎn)腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的測(cè)定

2.7.1 分組、給藥 取傳代 7代以?xún)?nèi)的細(xì)胞分為:空白血清對(duì)照組、腎上腺素+空白血清組(即每1mL 10%培養(yǎng)液加腎上腺素0.01mL,簡(jiǎn)稱(chēng)腎上腺素組)。

2.7.2 細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的檢測(cè)取第6代大鼠前脂肪細(xì)胞,以2×105個(gè)/mL的濃度傳于50mL培養(yǎng)瓶中,置37℃、5%CO2培養(yǎng)至生長(zhǎng)旺盛時(shí),棄培養(yǎng)液,給藥后分別培養(yǎng)48,72,96h,收集細(xì)胞,用pH 4.75的醋酸緩沖液懸浮,調(diào)整濃度至106個(gè)/mL,取細(xì)胞懸液1mL,1500r/min離心5min,使細(xì)胞沉淀,棄去上清液,細(xì)胞沉淀加pH 4.75醋酸緩沖液1mL混懸,反復(fù)凍融 3～4次,3 000r/min離心15min,取上清液100μL按照藥盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。利用cAMP與125I-cAMP和特異性蛋白激酶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合原理測(cè)定細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度,GC-1200r放射免疫計(jì)數(shù)器上測(cè)定放射性強(qiáng)度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出細(xì)胞內(nèi)cAMP。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(±s)表示,方差齊者采用單因素方差分析方法,方差不齊者以秩和檢驗(yàn)。細(xì)胞內(nèi)cAMP水平檢測(cè)如表2。

表2 測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)腎上腺素對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP的影響(±s,n=6)Tab.2 Effects of epinephrine on cAMP which was from rat preadipocyte at different time points(±s,n=6)

表2 測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)腎上腺素對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP的影響(±s,n=6)Tab.2 Effects of epinephrine on cAMP which was from rat preadipocyte at different time points(±s,n=6)

與空白對(duì)照比較:1P＜0.05,2P＜0.011P＜0.05,2P＜0.01 vs control group

組別 cAMP濃度/(nmol/L)48h 72 h 96h空白對(duì)照組 15.54±1.54 14.45±1.35 14.33±1.21腎上腺素組 18.71±1.522 18.47±1.032 16.37±1.731

表2表明,腎上腺素組與空白對(duì)照組比較,在48,72,96h3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有顯著性差異,提示腎上腺素可使大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高;48,72 h時(shí)間點(diǎn)與96 h時(shí)間點(diǎn)比較,有顯著性差異。腎上腺素對(duì)cAMP水平升高的促進(jìn)作用在48 h可達(dá)到最佳作用效果,而后,隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。

3 討 論

前脂肪細(xì)胞在促分化條件下單層匯合形成10 d后,細(xì)胞內(nèi)已積聚了相當(dāng)多的脂肪,變?yōu)榻茍A形的多脂滴細(xì)胞。此時(shí)在培養(yǎng)液內(nèi)加入各濃度的含藥血清及其入血成分,作用5d后細(xì)胞內(nèi)的脂肪明顯減少,原來(lái)的大脂滴變細(xì)小,少數(shù)細(xì)胞甚至消失了細(xì)胞內(nèi)的脂肪。油紅 O的染色變淺,提取后A值降低,故據(jù)此來(lái)判斷藥物對(duì)脂肪積聚的作用。

前脂肪細(xì)胞為脂肪細(xì)胞的前身,又稱(chēng)成脂細(xì)胞,前脂肪細(xì)胞通過(guò)有絲分裂使脂肪細(xì)胞增多的方式稱(chēng)脂肪細(xì)胞的增殖。根據(jù)脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中脂滴的變化可將脂肪細(xì)胞大致分為脂肪前體細(xì)胞(尚未出現(xiàn)脂滴之前的梭形細(xì)胞,adipocytepreeursc)、前脂肪細(xì)胞(剛出現(xiàn)脂滴后的細(xì)胞,preadipocyte)和成熟的脂肪細(xì)胞(1個(gè)或多個(gè)大脂滴以飽和狀態(tài)充滿了細(xì)胞的大部分,稍微扁平的核位于周?chē)麧{的狹帶中,GPDH酶活性顯著升高,adipocyte)。人和動(dòng)物的脂肪組織中存在功能活躍的前脂肪細(xì)胞,是脂肪組織增生、肥大以及脂肪分解的重要作用位點(diǎn),它的存在和作用持續(xù)于人的一生,與肥胖及脂肪移植成活率都有密切的關(guān)系。有研究表明其分化異?？蓪?dǎo)致肥胖及脂肪發(fā)育不良等疾病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)的研究,有助于進(jìn)一步探討藥物對(duì)人體脂肪代謝的影響。

本研究通過(guò)在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定腎上腺素對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的作用,證明腎上腺素使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高,同時(shí)證明各個(gè)單體在48,72,96h3個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平均有明顯變化。綜上各實(shí)驗(yàn)表明,腎上腺素對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP的作用,與腎上腺素作用的時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān),48h后可達(dá)到最高水平。

本實(shí)驗(yàn)證明腎上腺素對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用,對(duì)分化過(guò)程中GPDH的升高及脂肪積聚均有抑制作用,而普萘洛爾與腎上腺素合用時(shí)可阻斷上述作用;腎上腺素還可使前脂肪細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平降低。由于腎上腺素有激活α、β受體的作用,普萘洛爾是β受體阻斷劑[5],通過(guò)用普萘洛爾阻斷 β受體的作用,故腎上腺素的這些作用可能通過(guò)前脂肪細(xì)胞的β受體完成。表明腎上腺素-β受體-cAMP系統(tǒng)可能參與了大鼠前脂肪細(xì)胞的增殖與分化。

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