毛細管電泳法測定增味劑中的5'-肌苷酸二鈉和5'-鳥苷酸二鈉的含量

杜建中，曾秀文，黃少春，丁 玎

（1.湛江師范學院廣東高校新材料工程技術開發(fā)中心，廣東湛江524048；2.圣地亞哥州立大學公共衛(wèi)生學院，美國圣地亞哥92123；3.加州大學圣地亞哥分校預防醫(yī)學系，美國圣地亞哥92037）

毛細管電泳法測定增味劑中的5'-肌苷酸二鈉和5'-鳥苷酸二鈉的含量

杜建中1，曾秀文1，黃少春1，丁 玎2，3

（1.湛江師范學院廣東高校新材料工程技術開發(fā)中心，廣東湛江524048；2.圣地亞哥州立大學公共衛(wèi)生學院，美國圣地亞哥92123；3.加州大學圣地亞哥分校預防醫(yī)學系，美國圣地亞哥92037）

建立了同時測定5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉的毛細管電泳法，研究了緩沖溶液種類、濃度、pH、電壓等對測定的影響，對測定條件進行了優(yōu)化。在波長250nm，分離電壓15kV，5mmol·L-1磷酸二氫鈉-5mmol·L-1硼酸-5%乙醇緩沖溶液（pH=10.3）中，增味劑中的5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉在5min內得到了較好的分離，濃度與峰面積之間具有良好的線性關系。

毛細管電泳，5′-肌苷酸二鈉，5′-鳥苷酸二鈉

呈味核苷酸主要包括5′-肌苷酸二鈉（IMP）和5′-鳥苷酸二鈉（GMP），與谷氨酸鈉混合時產生協同效應，使鮮度提高數倍至數十倍；同時核苷酸對甜味和肉味有增效作用，對咸、酸、苦味及腥、焦味有抑制作用，在食品工業(yè)生產中越來越受到重視和歡迎［1］。目前用于檢測5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉的方法有雙波長法［2］、雙波長比值光譜法［3］、高效液相色譜法［4］、離子色譜法［5］等。高效毛細管電泳是基于被分離物質的凈電荷與質量比的差異，各組分按其表面電荷的差異，以不同的速率在毛細管內運行緩沖溶液中地移動而導致分離［6］的一種新型分析方法。本文詳細研究了5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉的毛細管電泳分離條件，并用于部分市售鮮味劑中5′-肌苷酸二鈉、5′-鳥苷酸二鈉的測定，取得了較好的效果。方法具有高效、快速、試樣用量少、分離效果高等特點。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5′-肌苷酸二鈉 德國；5′-鳥苷酸二鈉 日本；磷酸二氫鈉 天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；硼酸、鹽酸 汕頭市光華化學廠；氫氧化鈉 天津市化學試劑三廠；十二烷基硫酸鈉 SDS，天津市服晨化學試劑廠；所有實驗用水 均為去離子水；試劑 均為分析純；微孔醋酸纖維濾膜 Φ=0.45μm，上海醫(yī)藥工業(yè)研究所亞東分離器材廠。

GL2001高效毛細管電泳儀 北京采陸科學儀器有限公司；未涂層熔融石英毛細管 內徑75μm，有效長度47cm，河北永年光導纖維廠；PHS-3C型精密酸度計 上海雷磁儀器廠；離心機 金壇市新航玻璃儀器廠；UV-2550型紫外可見分光光度計 日本島津制作所。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 標準貯備液：準確稱取5′-肌苷酸二鈉標準品0.1140g，5′-鳥苷酸二鈉標準品0.1143g，分別用水溶解并定容至50.00mL，于暗處保存。

1.2.2 樣品的預處理 準確稱取待測樣品2.00g，加適量水溶解并定容至10.00mL，搖勻，用離心機進行離心分離，取其上清液，用0.45μm濾膜過濾，收集濾液待用。

1.2.3 電泳條件 檢測波長250nm，采用陽極端手動壓差進樣，進樣高度10cm，進樣時間3s，分離電壓15kV，運行緩沖溶液：5mmol·L-1NaH2PO4-5mmol·L-1H3BO3-5%乙醇溶液（pH=10.3）。

毛細管在每次運行前分別用0.1mol·L-1HCl、0.1mol·L-1NaOH、水和緩沖溶液沖洗3min，每次進樣前用水、緩沖溶液分別沖洗2min。

1.2.4 測定方法 將5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉的標準溶液以1∶1混合，并逐級稀釋，配制一系列的標準溶液，在電泳條件下測定5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉的峰面積，以峰面積（A）對濃度（C）作圖，得到其標準曲線，計算回歸方程。測定已過濾的樣品溶液中5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉的峰面積，將峰面積代入回歸方程，求出樣品中5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉的含量。

2 結果與討論

2.1 分離條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇 利用UV-2550型紫外可見分光光度計，測定了5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉在200～400nm處的吸收曲線，見圖1。5′-肌苷酸二鈉、5′-鳥苷二鈉的最大吸收波長分別為248、262nm，本實驗選用250nm作為檢測波長。

圖1 吸收曲線圖

2.1.2 緩沖體系的選擇 緩沖體系直接影響離子的遷移和分離。實驗考察了分離電壓為20kV，pH=9.5時，5′-肌苷酸二鈉、5′-鳥苷酸二鈉標準混合樣在硼酸緩沖系、磷酸緩沖系、磷酸二氫鈉-硼酸緩沖系、磷酸二氫鈉-硼酸-SDS緩沖系中的分離情況。結果顯示，在磷酸二氫鈉-硼酸緩沖系中分離效果相對理想，進一步考察了磷酸二氫鈉與硼酸濃度比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、2∶1時的電泳情況，結果顯示1∶1時的分離效果較好，固定磷酸二氫鈉與硼酸濃度比為1∶1。繼續(xù)考察了標準混合樣在5mmol·L-1磷酸二氫鈉-5mmol·L-1硼酸緩沖溶液、10mmol·L-1磷酸二氫鈉-10mmol·L-1硼酸緩沖溶液中的分離效果，見圖2。由圖2可知，5mmol·L-1磷酸二氫鈉-5mmol·L-1硼酸緩沖體系分離效果好，故選此體系為運行緩沖溶液。

圖2 緩沖體系濃度的影響

2.1.3 pH 的影響 分離電壓為20kV，采用5mmol· L-1磷酸二氫鈉-5mmol·L-1硼酸為緩沖溶液，考察了5′-肌苷酸二鈉、5′-鳥苷酸二鈉標準混合樣在pH為9.5、10.0、10.3、10.5條件下的分離情況，見圖3。由圖3可知，分離的最佳pH為10.3。

圖3 pH的影響

2.1.4 電壓的選擇 在 5mmol·L-1磷酸二氫鈉-5mmol·L-1硼酸緩沖溶液中，考察了電壓對樣品分離效果的影響，見圖4。由圖4可知，電壓為15kV時5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉得到了較好的基線分離。

2.1.5 乙醇濃度對測定的影響 采用5mmol·L-1磷酸二氫鈉-5mmol·L-1硼酸為緩沖溶液，pH10.3時，固定電壓為15kV，測定了IMP、GMP標準混合樣在含有5%、10%、15%乙醇溶液中的遷移時間。當乙醇濃度為5%時，可使5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉標準混合樣得到基線分離。

2.2 定性分析

在電泳條件下對待測雞精溶液進行分離，5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉能夠得到較好的分離。采用標準加入法，確定了待測組分的峰，電泳圖見圖5。結果顯示，前鋒為5′-鳥苷酸二鈉，后峰為5′-肌苷酸二鈉。

圖4 電壓的影響

圖5 樣品峰的確定

2.3 精密度實驗

按照實驗方法分別配制5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉標準溶液，按1.2.4測定5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉的峰面積，9次測定結果的相對標準偏差分別為3.64%和4.60%。

2.4 定量分析

在電泳條件下，測定5′-肌苷酸二鈉、5′-鳥苷酸二鈉系列標準溶液的峰面積，求出回歸方程分別為：5′-肌苷酸二鈉：A=-2.59×104+1.74×105C，r2= 0.9978；5′-鳥苷酸二鈉：A=-2.65×104+1.70×105C，r2=0.9977。

2.5 測定結果

按1.2.2方法對雞精進行處理后，在電泳條件下測定其峰面積，代入回歸方程計算其含量，結果見表1。

表1 定量分析結果（n=9）

2.6 回收率測定

對雞精1（200811074B）進行加標回收實驗，結果見表2。

表2 回收率實驗結果（n=9）

3 結論

在優(yōu)化條件下，樣品中的5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉在5min內可以得到較好的分離，且峰面積與濃度之間具有良好的線性關系。與液相色譜法、紫外分光光度法相比，本方法藥品用量少，操作簡單，適應于5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉的分離、檢測。

［1］崔桂友.呈味核苷酸及其在食品調味品中的應用［J］.中國調味品，2001（10）：25-29.

［2］黃亞光，黃水嫦，王煥章，等.雙波長分光光度法測定呈味核苷酸二鈉混合物的含量［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（7）：108-111.

［3］杜建中，楊春梅，李自信，等.雙波長比值光譜法測定5′-鳥苷酸鈉、5′-肌苷酸鈉、5′-尿苷酸鈉含量［J］.食品科學，2008，29（1）：225-227.

［4］汪慶旗，陳青俊，丁獻榮，等.高效液相法測定調味品中5′-鳥苷酸二鈉和5′-肌苷酸二鈉［J］.中國釀造，2007（7）：53-56.

［5］陳青川，牟世芬，侯小平.離子色譜法測定增味劑中的5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉［J］.色譜，1999，17（3）：290-292.

［6］鄧延倬，何金蘭.高效毛細管電泳［M］.北京科學出版社，1997.

Study on the determination of disodium 5′-inosinate，disodium 5′-guanylate by capillary electrophoresis

DU Jian-zhong1，ZENG Xiu-wen1，HUANG Shao-chun1，DING Ding2，3
（1.Development Center for Newmaterials Engineering and Technology in Universities of Guangdong，Zhanjiang Normal University，Zhanjiang 524048，China；2.Graduate School of Public Health，San Diego State University，San Diego 92123，USA；3.Department of Family and Preventivemedicine，University of California，San Diego 92037，USA）

This study established the method for directly determination and simultaneous separation of disodium 5′-inosinate，disodium 5′-guanylate using capillary electrophoresis.lt also examined the effects of factors such as voltage，the type，concentration and acidity of the running buffer on determination.The best separation was achieved in the running buffer of 5mmol·L-1NaH2PO4-5mmol·L-1H3BO（3with 5%percent alcohol）at pH= 10.3，and 15kV separation voltage，and with UV detection at 250nm.Disodium 5′-inosinate and disodium 5′-guanylate were completely separated and detected using the method within 5min.The concentration and peak area of disodium 5′-inosinate and disodium 5′-guanylate showed good linear relationships.

capillary electrophoresis；disodium 5′-inosinate；disodium 5′-guanylate

TS207

A

1002-0306（2010）12-0335-03

2009-12-10

杜建中（1956-），男，教授，主要從事分析化學教學及微量組分分析的研究。

湛江師范學院科學研究基金資助項目（L0514）。