黃芪內(nèi)生菌抑菌活性的研究

趙春杰，李國(guó)銀，呂耀龍，李云飛

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，內(nèi)蒙古包頭014109；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；3.內(nèi)蒙古蒙西高新技術(shù)集團(tuán)公司，內(nèi)蒙古烏海014014）

黃芪內(nèi)生菌抑菌活性的研究

趙春杰1，李國(guó)銀2，呂耀龍1，李云飛3

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，內(nèi)蒙古包頭014109；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；3.內(nèi)蒙古蒙西高新技術(shù)集團(tuán)公司，內(nèi)蒙古烏海014014）

為了研究藥用植物中內(nèi)生菌的抗菌活性，以黃芪內(nèi)生菌ZCJ2為材料，對(duì)其所產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的抗菌譜、溶解性及穩(wěn)定性等進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明，菌株ZCJ2產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)具有較廣的抑菌譜，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌都有較強(qiáng)的抑制作用?？咕镔|(zhì)為水溶性，但是在正丁醇、氯仿、丙酮中不溶解或微溶?？咕崛∥镌趐H3～12條件下抗菌活性穩(wěn)定，對(duì)熱處理、酸堿和紫外線處理具有非常好的穩(wěn)定性，這可為尋找天然抗菌物質(zhì)提供資源。

內(nèi)生菌，抑菌作用，活性物質(zhì)

抗生素的使用改變了細(xì)菌感染性疾病的治療與防治，通過(guò)抗生素有效地控制了許多嚴(yán)重的細(xì)菌感染，抗生素飼料添加劑也在提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度和飼料轉(zhuǎn)化率等方面做出了巨大貢獻(xiàn)。但是，隨著抗生素的不斷使用，其負(fù)面作用日益突出，抗生素可能導(dǎo)致的耐藥性及藥物殘留愈來(lái)愈引起人類的關(guān)注。要保障畜牧業(yè)的安全生產(chǎn)，推廣應(yīng)用安全的抗生素和合成藥物代替產(chǎn)品非常必要。植物內(nèi)生菌存在抑菌活性具有普遍性，目前已經(jīng)從植物內(nèi)生菌中分離篩選到多種抗菌活性物質(zhì)［1-5］。植物內(nèi)生菌和植物是經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的進(jìn)化形成的共生關(guān)系，據(jù)目前的研究報(bào)告顯示，研究過(guò)的植物中——尤其是藥用植物中分離得到的內(nèi)生菌均含有與宿主植物相同或相似的活性成分，這些物質(zhì)在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、畜牧及食品工業(yè)中具有重要的應(yīng)用潛力［6-7］。我們?cè)谇懊娴难芯恐?，已從黃芪植物中分離到了一株具有高抑菌活性的菌株ZCJ2，經(jīng)鑒定為Bacillus subtilius的變種。本文對(duì)該菌的產(chǎn)抗菌物質(zhì)的性質(zhì)作了進(jìn)一步的研究，為菌株ZCJ2所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 黃芪內(nèi)生菌ZCJ2由本實(shí)驗(yàn)室分離保藏；黃芪浸提液 稱取新鮮無(wú)病害黃芪100g，切碎后用研缽磨碎，加入1000mL蒸餾水，115℃滅菌25min，三層濾紙過(guò)濾，1000r/min離心5min，除去沉淀，制備成黃芪浸提液，用于配制培養(yǎng)基；MMM培養(yǎng)基 NaCl 20.0g、MgSO4·7H2O 7.0g、MgCl2·5H2O 5.3g、KCl 0.7g、CaCl21.25g、FeSO4·7H2O 0.025g、CuSO4·5H2O 0.005g、K2HPO40.075g、谷氨酸鈉2.0g、Tris base 6.1g、黃芪浸提液1000mL，pH調(diào)至7.4；BPY培養(yǎng)基 牛肉浸膏5.0g、蛋白胨10.0g、酵母膏5.0g、NaCl 5.0g、葡萄糖10.0g、加黃芪浸提液1000mL，pH為7.0～7.2；改進(jìn)的Landy培養(yǎng)基 葡萄糖10.0g、L-谷氨酸鈉5.0g、MgSO40.5g、KCl 0.5g、KH2PO41.0g、FeSO40.15mg、MnSO45.0mg、CuSO40.16mg、黃芪浸提液1000mL，pH為7.0～7.2。

表1 菌株ZCJ2產(chǎn)物的抗菌譜測(cè)定結(jié)果

表2 抗菌物質(zhì)在不同溶劑中的溶解性

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗菌物質(zhì)的制備與濃縮 以MMM培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)18～24h，按5%接入MMM培養(yǎng)基中，在30℃，160r/min，振蕩培養(yǎng)36h。按照文獻(xiàn)報(bào)道方法［8］將菌株ZCJ2的發(fā)酵液經(jīng)離心除菌后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃條件下濃縮，冷凍干燥。無(wú)菌雙蒸水溶解后進(jìn)行活性測(cè)定。

1.2.2 抗菌活性的測(cè)定 參照細(xì)菌素Nisin的抗菌活性檢測(cè)方法［9］。以大腸桿菌作為指示菌，將待測(cè)樣品，用0.45μm細(xì)菌濾器過(guò)濾，采用牛津杯平板擴(kuò)散法，37℃培養(yǎng)24h，用游標(biāo)卡尺測(cè)其抑菌圈的直徑（diameter of antibiotic circle，DAC），以抑菌圈的直徑表示抗菌物質(zhì)的抗菌活性［10］。

1.2.3 抗菌譜的測(cè)定 指示菌選用了16株，包括5株革蘭氏陽(yáng)性菌、3株革蘭氏陰性菌和8株真菌。采用管碟法測(cè)定對(duì)16株不同的細(xì)菌和真菌的抗菌活性，細(xì)菌于各自適合的溫度培養(yǎng)24h，真菌于30℃培養(yǎng)48h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑并記錄抑菌結(jié)果，以抑菌圈的直徑表示發(fā)酵液的抗菌活性，所有實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)［11］。

1.2.4 溶解性實(shí)驗(yàn) 將抗菌物質(zhì)的粉末，分別按相同量加入水、甲醇、乙醇、正丁醇、氯仿、丙酮等充分振搖后靜置1h，10000×g離心15min，以純水為對(duì)照，取上清液在225nm波長(zhǎng)測(cè)定各自的OD值。

1.2.5 抗菌物質(zhì)對(duì)熱的穩(wěn)定性研究 將抗菌提取物于60、80、100、121℃處理30min后，10000×g離心15min，取上清液測(cè)抗菌活性。以未經(jīng)熱處理的提取物為對(duì)照，并以對(duì)照的抑菌活性為100%計(jì)算各處理抗菌活性的殘存率。

1.2.6 抗菌物質(zhì)對(duì)酸堿的穩(wěn)定性研究 將抗菌提取物按一定比例添加于pH為1～14的無(wú)菌水中，于室溫保持5h后，10000×g離心15min，取上清液用牛津杯法以大腸桿菌為代表菌株測(cè)定抑菌圈大小，比較酸堿對(duì)抗菌活性的影響。

1.2.7 抗菌物質(zhì)對(duì)紫外線的穩(wěn)定性研究 將制備好的抗菌物質(zhì)溶液5份，加入無(wú)菌平皿中，鋪成約5mm薄層，無(wú)菌條件下用40W紫外燈分別照射1、6、12、24h。制備指示菌平板，采用牛津杯法以大腸桿菌為代表菌株測(cè)抑菌活性，以未照射過(guò)的上清液為對(duì)照，觀察并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌譜的測(cè)定

采用管碟法測(cè)定對(duì)16株不同菌的抗菌活性，由抑菌圈結(jié)果（見(jiàn)表1）可知，發(fā)酵上清液對(duì)除枯草芽孢桿菌以外的4株革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌圈直徑均超過(guò)了15mm，抑制作用強(qiáng)；對(duì)3株革蘭氏陰性菌的抑菌效果，除交替假單胞菌的抑菌圈略小于15mm外其余的抑菌圈也均超過(guò)15mm，抑制作用強(qiáng)；8株真菌均能不同程度地受到抑制，抑菌圈直徑在15～29mm之間。由此可知，菌株ZCJ2產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對(duì)16株不同種類的供試菌株具有明顯的抑制作用，具有較廣范圍的抑菌譜。

2.2 抗菌物質(zhì)的溶解性

溶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2，菌株ZCJ2產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在水中溶解性良好，在純甲醇中有少量不溶，純乙醇中僅有部分溶解，而在正丁醇、氯仿、丙酮中不溶解或微溶?？咕镔|(zhì)在水中溶解性良好有利于抗菌物質(zhì)在飼料中的應(yīng)用。

2.3 抗菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

在抗菌物質(zhì)在實(shí)際應(yīng)用中，要受到溫度的影響，如果抗菌物質(zhì)溫度穩(wěn)定性差，則很難在實(shí)際中得到廣泛應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）可知，菌株ZCJ2所產(chǎn)抗菌物質(zhì)在80℃以下處理30min，抗菌物質(zhì)的抗菌活性幾乎不變；100℃處理30min時(shí)也僅有約2%的損失率；121℃處理30min，抗菌活性損失11.08%；因此可知，抗菌提取物對(duì)熱處理具有非常好的穩(wěn)定性。

圖1 溫度對(duì)抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性的影響

2.4 酸堿對(duì)抗菌物質(zhì)的影響

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)圖2）來(lái)看，在pH3～12條件下抗菌物質(zhì)的抗菌活性比較穩(wěn)定，在1＜pH＜3和12＜pH＜14時(shí)抗菌活性有所損失。

圖2 pH對(duì)抗菌物質(zhì)抗菌活性的影響

2.5 紫外線對(duì)抗菌物質(zhì)的影響

抗菌物質(zhì)經(jīng)不同時(shí)間紫外線照射后，抑菌能力沒(méi)有發(fā)生明顯的變化（見(jiàn)圖3）。抑菌圈直徑大小顯示抗菌物質(zhì)在紫外線照射0、1、6、12、24h后，對(duì)大腸桿菌的抗菌效果與對(duì)照沒(méi)有顯著的差異。可見(jiàn)，抗菌物質(zhì)的抗菌活性經(jīng)紫外線照射后保持較好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

在嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件情況下，利用抑菌圈非常真實(shí)直觀地反映出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出準(zhǔn)確的相關(guān)結(jié)論。ZCJ2菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)有較廣范圍的抑菌譜，它對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌都有較強(qiáng)的抑制作用。

抗菌物質(zhì)為水溶性，但是在異戊醇、三氯甲烷中不溶解。對(duì)菌株ZCJ2所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，所設(shè)置的溫度和pH范圍大、紫外線照射時(shí)間長(zhǎng)，因此了解到抗菌提取物在pH 3～12條件下抗菌活性穩(wěn)定，對(duì)熱處理、酸堿和紫外線處理具有非常好的穩(wěn)定性。這樣對(duì)抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行研究比較全面細(xì)致，也表明該抗菌物質(zhì)具有較好的應(yīng)用潛力。目前，對(duì)于Bacillus subtilis產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的報(bào)道多為抗菌脂肽，本實(shí)驗(yàn)研究所獲得的抗菌物質(zhì)的性質(zhì)也和報(bào)道的抗菌脂肽的性質(zhì)相符合，因此，初步推斷菌株ZCJ2所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)為抗菌脂肽。

圖3 紫外線對(duì)抗菌物質(zhì)抗菌活性的影響

［1］HilterL U.Neuereerfahrungen undlproblemedufdem gebietder bodenbakteriologie und unter besondererberu cksichtigung der grundungung und brache［J］.Arb Dtsch Land Wirt Ges，1904，98：59-78.

［2］Strobel G A.Rainforest endophytes and bioactive products［J］.Crit Rev Biotechnol，2002，22（4）：315-310.

［3］李萌，張海濤，等.蔬菜內(nèi)生菌的分離及其生防功能初探［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003（5）：60-66.

［4］Strobel GA.Endophytes as sources of bioactive products［J］. Microbes Infect，2003，5（6）：535-544.

［5］戴傳超，余伯陽(yáng)，等.大戟內(nèi)生菌的抑菌活性及其宿主相關(guān)性研究［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，16（7）：1290-1294.

［6］Poulev A，O’Neal JM，Logendra S.Elicitation，a new window into plant chemodiversity and phytochemical drug discovery［J］.J Med Chem，2003，5，46（12）：2542-2547.

［7］鄒文欣，譚仁祥.植物內(nèi)生菌研究新進(jìn)展［J］.植物學(xué)報(bào)，2001，43（9）：881-892.

［8］Ongena M，Jacques P，Touré Y，et al.Involvement of fengycin -type lipopeptides in the multifaceted biocontrol potential of Bacillus subtilis［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2005，69：29-38.

［9］伊守亮，肖林，顧振華，等.管碟法測(cè)定Nisin效價(jià)［J］.無(wú)錫輕工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，23：41-45.

［10］馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，2001：211-214.

［11］孫力軍，陸兆新，陳磊，等.銀花內(nèi)生菌EJH-1抗菌作用發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面法優(yōu)化［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，29（3）：108-113.

Study on antimicrobial substance of endophytes from Milkvetch

ZHAO Chun-jie1，LI Guo-yin2，LV Yao-long1，LI Yun-fei3
（1.Department of Food Science and Engineering，Agriculture University Occupation Technical College of Inner Mongolia，Baotou 014109，China；2.College of Food Science and Engineering，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018，China；3.Inner Mongolia Melic-Sea High-Tech Group Company，Wuhai 014014，China）

To study antibacterial activity of endophytes from medicinal plants，the antibacterial spectrum，solubility and stability of antibacterial active material strained form Milkvetch antimicrobial endophytes ZCJ2 were studied systematically.Results showed that the antibacterial matter produced from strain ZCJ2 had broad antibiogram and strongly inhibited Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria，and that the material was diffluent in the water and dissoluble or slightly soluble in butanol，chloroform，acetone，and that the material kept steady antibacterial activity in the condition pH 3～12，and it had good stability to heat and acid-base and ultraviolet treatment，which could be resources for nature antimicrobial products.

endophytes；bacteriostasis；active substances

TS201.1

A

1002-0306（2010）12-0118-03

2010-04-14

趙春杰（1978-），女，講師，教研室主任，主要從事微生物與生物技術(shù)方面的研究。