超聲波對酶法水解絲素作用的研究

李利軍，吳啟濤，楊 峰，黃永春，李彥青，趙小進

（廣西工學(xué)院生物與化學(xué)工程系，廣西柳州545006）

超聲波對酶法水解絲素作用的研究

李利軍，吳啟濤，楊 峰，黃永春，李彥青，趙小進

（廣西工學(xué)院生物與化學(xué)工程系，廣西柳州545006）

以廢蠶絲的再生絲素液為原料，研究了有無超聲作用、底物濃度、時間、溫度、pH、加酶量等因素對堿性蛋白酶水解制備絲素肽的影響。結(jié)果表明，超聲輔助酶解再生絲素液制備絲素肽最佳工藝為：底物濃度4.0%、酶濃度為4.0%、反應(yīng)溫度為45℃、反應(yīng)時間為40min、pH為10.0、超聲功率為200W。與水浴酶解相比，超聲作用沒有改變回收率與水解溫度、pH、底物濃度、加酶量等因素的變化關(guān)系；但超聲作用可提高回收率，縮短反應(yīng)時間。

廢蠶絲素，超聲，酶解，絲素肽

將家蠶廢絲水解成具有水溶性的絲素肽，是家蠶蠶絲開發(fā)應(yīng)用的重要途徑之一［1-2］，目前，該類產(chǎn)品已被應(yīng)用在功能食品、高檔化妝品和醫(yī)用生物材料等領(lǐng)域［3-4］。制備絲素肽或混合氨基酸的傳統(tǒng)工藝是將蠶絲通過脫膠處理后再被酸、堿及酶降解而成［5］。一般采用酸水解法，但酸水解易使部分氨基酸破壞，水解難以控制。利用酶促反應(yīng)進行蛋白質(zhì)水解，組成的氨基酸都不會被破壞，且反應(yīng)條件溫和、效率高、專一性強、酶解程度容易控制。已有報道利用肌動蛋白酶水解絲素，主要生成低聚肽和氨基酸［6］。還有學(xué)者研究了純胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶對絲素的作用，據(jù)報道絲素的非結(jié)晶區(qū)被水解，而結(jié)晶區(qū)未能被水解，產(chǎn)生沉淀（60%～90%，因酶的純度不同而有差異）［7］。倪莉等［8］研究了Alcalase堿性蛋白酶酶解可溶性絲素粉末的最佳工藝條件，并對絲素的酶解產(chǎn)物進行凝膠過濾色譜（SEC）的分析。由于聲強超過一定值時，超聲波可改變傳聲媒質(zhì)的狀態(tài)、性質(zhì)及結(jié)構(gòu)［9］，盡管對不同酶、底物作用效果不盡一致，其作用機理尚不清楚，但是它能提高許多化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度，改善目的產(chǎn)物的選擇性，這些都引起了許多學(xué)者的關(guān)注［10］。本研究在鹽溶脫膠絲素制備再生絲素液的基礎(chǔ)上，采用堿性蛋白酶在超聲波輔助下水解制備絲素肽，并與水浴水解優(yōu)化條件加以比較。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

家蠶廢絲（汰頭） 由柳州市匯利豐繭絲有限責(zé)任公司提供；堿性蛋白酶（20萬u/g）、中性蛋白酶（20萬u/g）、木瓜蛋白酶（80萬u/g） 南寧龐博生物工程有限公司生產(chǎn)；苦味酸胭脂紅指示劑［9］取0.4g苦味酸溶于100mL水，0.5g胭脂紅溶于100mL熱水，二者等體積混合；雙縮脲試劑［11］1.5g五水硫酸銅加入6g酒石酸鉀鈉溶于500mL水中，攪拌加入300mL 10%的氫氧化鈉溶液，稀釋至1000mL。

電子天平 0.0001g，AdventurerTM made for OHAUS corp.；HK-1D型恒溫水槽 南京物化智能設(shè)備有限責(zé)任公司；電熱恒溫干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；超聲波藥品處理機 濟寧金百特工程機械有限公司；酸度計 PHS-25 Precision pH/mV Meter；截留范圍8000～14000D、φ34mm透析袋 上海源葉生物科技有限公司進口分裝；離心機 常州國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 再生絲素液的配制 將廢蠶絲先用40℃溫水浸泡30min，再浸漬于煮沸的0.5%碳酸鈉溶液（浴比1∶30）中脫膠［12］1.5h，然后取出洗凈、干燥，并用苦味酸胭脂紅指示劑檢驗脫膠是否完全。用40%CaCl2溶液煮沸攪拌直至溶解，溶液為黃棕色。將溶解的絲素置于截留范圍8000～14000Dφ34mm透析袋中，分別以自來水、蒸餾水流動透析2d，直至透析液電導(dǎo)率小于1×10-5Ω-1，可認(rèn)為絲素液總小分子已被處理掉，稱之為再生絲素液，取樣烘干測其濃度，即含固量。一般濃度在4%～6%（W/V，相當(dāng)于40～60mg/ mL）左右，臨用前稀釋。

1.2.2 酶母液的配制 用電子分析天平準(zhǔn)確稱量所需酶制劑2.000g，溶于25mL中性緩沖液中，臨用前配制80g/L酶母液。

1.2.3 單因素酶解實驗 取40mL一定濃度的上述再生絲素液，加入相應(yīng)緩沖液混合，微調(diào)至需要的pH。水浴中恒溫10min，以達到反應(yīng)溫度，同時將恒溫5min酶母液加入上述混合物中，混勻酶解，并開始計時，酶解過程中用0.5mol/L NaOH和鹽酸維持酶解pH恒定。到預(yù)定時間，迅速煮沸酶解液15min滅活蛋白酶。冷卻后，4000r/min 10min離心分離，將上清液和沉淀分別收取，待測。定容上清液到同一體積，測定不同條件下產(chǎn)品的回收率和吸光度。同時按上述工藝在超聲波輔助作用下考察絲素酶解情況。

1.2.4 雙縮脲反應(yīng)及吸光度的測定 水解液中多肽含量通過雙縮脲反應(yīng)比色來衡量。吸光度越大，水解液中多肽含量越大。取水解脫色樣液1mL，加入4mL雙縮脲試劑，充分混勻，靜置30min后，用722型分光光度計在波長540nm處，以1mL蒸餾水加4mL雙縮脲試劑做空白對照，測定吸光值。

1.2.5 產(chǎn)品回收率的測定 準(zhǔn)確量取水解液總體積，記為V0，取體積V1倒入烘干至恒重的培養(yǎng)皿中（記皿重為M1），加熱干燥至恒重，記培養(yǎng)皿與干物質(zhì)總質(zhì)量M2，M為進行水解的脫膠絲質(zhì)量，g。用下式計算回收率：

回收率（%）=（M2-M1）/M×V0×V1×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 不同超聲頻率對絲素液水解的影響

如表1所示，取40mL 4%的再生絲素液，酶用量4.0%，在45℃分別用頻率為26、48、69kHz超聲在200W作用下水解40min，維持水解過程 pH恒為10.0。實驗結(jié)果顯示，在同一功率水解再生液前提下，超聲頻率為26kHz時回收率最高，達到77%以上，吸光度變化不大。

表1 超聲波在同一功率的不同頻率對絲素液水解影響

2.2 不同超聲功率對絲素液水解的影響

取40mL 4%的絲素液，保持pH為10.0，酶用量4.0%，40℃用頻率為26kHz超聲依次在110、175、200、245和290W水解40min。實驗結(jié)果見表2，酶解液雙縮脲顯色反應(yīng)均顯紫紅色，證明存在絲素肽。同樣方式處理的酶解液在540nm處吸光度先增后減，說明超聲輔助酶解絲素存在最佳功率，回收率在200W時達到較大的69%以上，故可以認(rèn)為最佳超聲功率為200W。

表2 26kHz超聲波的不同功率對絲素液水解的影響

2.3 不同酶濃度對絲素水解的影響

取40mL 5%的再生絲素液，加酶母液，并調(diào)pH為8.0，在55℃搖床中水浴酶解5h，調(diào)節(jié)酶濃度依次為2%、3%、4%、5%和6%（w/v）。其它條件不變，保持pH為10.0，40℃用頻率為26kHz超聲在200W作用下依次水解30min。實驗結(jié)果如圖1、圖2所示，水浴酶解回收率最高達65.71%時，酶濃度為5%，超聲輔助酶解最佳加酶量為5%。

圖1 酶濃度對回收率的影響

2.4 不同pH對絲素水解的影響

取40mL底物濃度為5%的再生絲素液，加5%的酶母液（即取80g/L酶母液1.25mL加入到待酶解溶液中），并在55℃搖床中水浴酶解5h，調(diào)節(jié)pH為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。其它條件不變，保持酶用量5.0%，40℃用頻率為26kHz超聲波在200W作用下超聲水解40min。實驗結(jié)果如圖3、圖4所示，酶解回收率和吸光度都高時，水浴酶解和超聲輔助酶解的pH均為10.0。

2.5 不同底物濃度對絲素水解的影響

如圖5，對40mL再生絲素液，調(diào)節(jié)濃度依次為2%、3%、4%、5%和6%，加5%酶母液，并調(diào)pH為10.0，在55℃搖床水浴酶解5h。結(jié)果顯示，底物濃度為5%時，水浴酶解回收率達到60%以上，吸光度為0.438。其他條件不變，控制底物濃度為2.0%、4.0%、6.0%、8.0%和10.0%，酶用量5.0%，40℃用頻率為26kHz超聲波在200W作用下超聲水解40min，實驗結(jié)果見圖6，4.0%的底物濃度使回收率和吸光度較大。

圖3 酶解pH對回收率的影響

圖4 酶解pH對肽含量的影響

圖5 底物濃度對水浴酶解效果的影響

圖6 底物濃度對超聲輔助酶解的影響

2.6 不同酶解時間對絲素酶解的影響

40mL 5%的再生絲素液，加5%的酶母液，并調(diào)pH為10.0，在55℃搖床水浴酶解，反應(yīng)時間依次為1、2、3、4和5h，結(jié)果見圖7，酶解液吸光度隨時間延長而降低，回收率逐漸升高，在2h時二者能同時出現(xiàn)相對較大值，故較好的酶解時間為2h。同樣，在其他條件不變，40℃用頻率為26kHz超聲在200W作用下依次水解20、30、40和50min，由圖8所示，超聲40min，回收率達最大，為57.49%，此時吸光度相對較大，為0.498，所以，超聲輔助酶解較好反應(yīng)時間為40min。

2.7 不同反應(yīng)溫度對絲素酶解的影響

如圖9所示，取40mL 5%的再生絲素液，加5%的酶母液，并調(diào)pH為10.0，在恒溫水槽中水浴酶解2h，改變反應(yīng)溫度為40、45、50、55和60℃，水浴水解的回收率和吸光度較大時都在45℃處；其它條件不變，用頻率為26kHz超聲在200W作用下分別在30、40、45和50℃酶解40min，酶解回收率和吸光度都高時，反應(yīng)溫度也為45℃，見圖10。

圖7 反應(yīng)時間對水浴酶解的影響

圖8 反應(yīng)時間對超聲輔助酶解的影響

圖9 不同溫度對水浴酶解效果的影響

圖10 不同溫度對超聲輔助酶解的影響

2.8 酶解絲素最優(yōu)條件驗證

由單因素實驗得到水浴酶解再生絲素液較優(yōu)方案為絲素液5%，45℃，pH為10.0，酶濃度為5%，處理120min，平行7次實驗，求平均值，得到回收率為66.8%，540nm處吸光度為0.473；按超聲輔助酶解絲素液優(yōu)化方案為4%的絲素液，45℃，pH為10.0，酶濃度為4.0%，用26kHz頻率超聲在200W作用下處理40min，平行7次實驗，酶解液平均回收率為77.87%，540nm處吸光度為0.558。

3 結(jié)論

3.1 與水浴酶解相比，超聲作用沒有改變回收率與水解溫度、pH、底物濃度、加酶量之間關(guān)系曲線的變化趨勢，也沒改變堿性蛋白酶水解絲素再生液最佳反應(yīng)溫度和最佳pH，但使回收率和絲肽含量增加10%以上。

3.2 同一功率不同頻率超聲波對堿性蛋白酶水解再生絲素液作用不同，26kHz低頻率超聲利于酶解；不同功率的超聲波對酶解絲素蛋白作用也不同，其中200W功率超聲對酶解影響最大。

3.3 再生絲素液經(jīng)堿性蛋白酶酶解制備絲素肽最佳工藝為：底物濃度4.0%、酶濃度為4.0%、反應(yīng)溫度為45℃、反應(yīng)時間40min、pH為10.0、超聲功率為200W。

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Study on the effect of ultrasound on fibroin hydrolyzed by protein enzymes

LI Li-jun，WU Qi-tao，YANG Feng，HUANG Yong-chun，LI Yan-qing，ZHAO Xiao-jin
（Dept.of Biochemical Engineering，Guangxi University of Technology，Liuzhou 545006，China）

Taking regenerated solution of waste silk fibroin as material，the effects of the application of ultrasound，reactant concentration，time，temperature，pH and enzyme concentration on silk peptide hydrolyzed by alkaline protein enzyme and silk amino acid mixture were investigated by using single factor experiment.The optimal parameters were：reactant concentration 4.0%，enzyme concentration 4.0%，extraction temperature 45℃，reaction time 40min，pH 10.0，ultrasound power 200W.Compared with water bath hydrolyzing，ultrasound-assisted reaction is more effective with advantages in short reaction period and improving response rate.Though it cannot change the relationship among the recovery rate and reactant or enzyme concentration，temperature，pH，it can increase recovery rate and shorten time.

waste silk fibroin；ultrasound；enzyme hydrolysis；silk peptide

TS209

B

1002-0306（2010）12-0276-04

2009-12-25

李利軍（1966-），男，博士，研究方向：應(yīng)用化學(xué)。