苦參堿對心肌成纖維細胞增殖、膠原代謝及轉化生長因子-β1蛋白表達的影響

周艷芳，胡迎春，楊海鷺，徐 怡，歐陽靜萍

(1.廣東醫(yī)學院病理生理教研室，廣東 東莞 523808;2.武漢大學病理生理教研室，湖北 武漢 430071)

心肌成纖維細胞的異常增殖、過度合成和分泌大量的膠原蛋白是心肌纖維化形成的細胞學本質[1]。因此，深入研究間質重構與心肌成纖維細胞增殖、膠原合成的關系，尋找合適的藥物抑制間質重構，對于逆轉心肌纖維化、提高心血管功能具有重要的理論意義和臨床價值。筆者采用容量負荷因子醛固酮誘導體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌成纖維細胞增殖及膠原合成，觀察苦參堿對心肌成纖維細胞增殖及膠原合成的影響并探討轉化生長因子-β1(TGF-β1)蛋白在苦參堿抗心肌纖維化中的作用機制，為臨床使用有效藥物預防和逆轉心肌纖維化提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Bio-Rad 450型酶標儀(美國伯樂Bio-Rad公司);UV 1601分光光度計(日本島津);PCR儀(華美生物工程公司);DY-8A型電泳儀(上海西巴斯生物技術開發(fā)公司);DMBRI倒置相差熒光顯微鏡(德國LEICA);FACSort型流式細胞儀(美國Becton-Dickinson公司)。DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);新生小牛血清(Gibco公司);醛固酮(Sigma公司);胰蛋白酶(Difco);小鼠抗波形蛋白單克隆抗體(Biogenes公司);TGF-β1單抗(Biogenes公司);FITC-羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司);羥脯氨酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司)。其他常用生化試劑均為國產分析純。

1.2 差速貼壁法體外培養(yǎng)心肌成纖維細胞

取日齡1～3d的Wistar大鼠，在無菌條件下開胸取出心臟，置4℃ 0.01%磷酸鹽緩沖液中，剪取心室肌至1mm3大小的碎塊，棄去0.01%磷酸鹽緩沖液，加入0.125%胰蛋白酶8～10mL反復消化10min，直至組織塊消失，分別收集每次消化懸液，離心棄上清液，加入含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，置37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中。根據(jù)心肌細胞和成纖維細胞貼壁時間的不同，采用差速貼壁1～1.5h，棄上清液，獲得心肌成纖維細胞。待細胞長滿瓶壁后用0.25%胰酶消化傳代。抗波形蛋白單克隆抗體免疫細胞化學染色對鑒定為所需的心肌成纖維細胞純度達98%。試驗采用2～3代的成纖維細胞。各組處理因素作用24h后，光學倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀況。

1.3 試驗分組

對照組:不加任何處理因素;醛固酮組:培養(yǎng)液中加入醛固酮1.0×10-7mol/L;醛固酮+不同濃度苦參堿組:培養(yǎng)液中同時加入1.0×10-7mol/L的醛固酮和濃度分別為0.125，0.25，0.5mmol/L的苦參堿。將上述各組依次標記為A，B，C，D，E組。

1.4 測定指標

加處理因素24h后，在已培養(yǎng)細胞的96孔板每孔中加入0.5%MTT10μL，置37℃下4h后，棄上清液，加入100μL二甲基亞砜(DMSO)振蕩15min，置酶標儀上測光密度 (OD)值，測定波長為490nm。

用流式細胞儀雙標法測定細胞周期及TGF-β1蛋白表達。處理因素作用24h后收集細胞，加70%冷乙醇4℃過夜。離心，磷酸鹽緩沖液沖洗，加入一抗4℃孵育過夜，用磷酸鹽緩沖液沖洗，加入異硫氰酸熒光束(FITC)標記的二抗37℃孵育30min。RNA酶200μL37℃水浴30min。碘化丙啶暗處冰浴30min。

用免疫熒光細胞化學染色法檢測TGF-β1蛋白表達。處理因素作用24h后，磷酸鹽緩沖液沖洗，純甲醇固定10min，1%TritonX-100室溫孵育20min。正常山羊血清室溫封閉10min;滴加一抗置濕盒4℃過夜;磷酸鹽緩沖液洗3次;滴加FITC標記二抗，置37℃濕盒中1h，磷酸鹽緩沖液洗3次，每次5min;觀察，照相。

取各組細胞上清液0.5mL，加無水乙醇1.2mL，旋渦混勻器充分混勻2次，每次2min，3500r/min離心10min，取上清液約1.5mL，烘干，加0.5mL雙蒸水復溶，制成稀釋1倍的檢測液，加試劑一、二、三(具體操作按羥脯氨酸檢測試劑盒說明書)混勻，65℃水浴15min，冷卻后在酶標儀上測 OD值，測定波長為550nm，光徑1cm，雙蒸水調零，比色。按照下式計算羥脯氨酸含量。

羥脯氨酸=(測定管吸光度-空白管吸光度)/(標準管吸光度-空白管吸光度)×標準管濃度(5μg/mL)×稀釋倍數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)以均值±標準差(X±s)表示，使用SPSS統(tǒng)計軟件分析，組間比較采用 t檢驗和方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡下心肌成纖維細胞生長形態(tài)的改變

對照組細胞較大，胞漿豐富，呈梭形，細胞間連接豐富;醛固酮組細胞增生活躍，呈編織狀，胞體增大，細胞生長密集。與醛固酮組比較，加入不同濃度苦參堿后，細胞生長受到不同程度的抑制，體積縮小，細胞數(shù)目明顯減少，且隨苦參堿濃度增大，生長抑制更加明顯，部分細胞變圓，透光度減低(圖1)。

圖1 各組心肌成纖維細胞生長形態(tài)(×200)

2.2 各組細胞增殖情況

A組MTT-OD值為0.2104±0.0221，B組為0.3696±0.0304，C組為0.3328±0.0304，D組為0.2718±0.0252，E組為0.1974±0.0152?？梢?，與對照組比較，醛固酮組MTT-OD值明顯升高，提示醛固酮能明顯促進心肌成纖維細胞增殖(P＜0.01)。加入不同濃度的苦參堿后，MTT-OD值顯著低于醛固酮組，且呈劑量依賴性，與醛固酮組比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。

2.3 FCM分析心肌成纖維細胞的細胞周期改變

苦參堿對細胞周期的影響見表1和圖2。加入醛固酮后，G0/G1期細胞百分比下降，S期、G2/M期細胞百分比升高(P＜0.05)，提示醛固酮促進了細胞由G0期向S期的轉化。與醛固酮組比較，加入苦參堿后，G0/G1期細胞百分比升高，S期、G2/M期細胞百分比下降(P＜0.01)，表明細胞由G0期向S期的轉化受到抑制。

2.4 苦參堿對心肌成纖維細胞羥脯氨酸含量的影響

羥脯氨酸含量可表示膠原合成情況，通過測定，羥脯氨酸含量A組為0.0445±0.0025，B組為0.0635±0.0045，C組為0.0385±0.0045，D 組為 0.0375±0.0005，E 組為 0.0225±0.0105?？梢姡┕掏M細胞上清液中的羥脯氨酸含量明顯高于對照組(P＜0.05)，表明醛固酮可顯著提高心肌成纖維細胞的膠原分泌總量。與醛固酮組比較，苦參堿組細胞上清液中的羥脯氨酸含量都明顯減少(P＜0.01)，并隨著濃度的增高，羥脯氨酸含量減少更明顯，呈劑量依賴效應。

表1 各組心肌成纖維細胞的細胞周期分布(%)

圖2 FCM分析各組心肌成纖維細胞的細胞周期改變

圖3 細胞免疫熒光染色法檢測TGF-β1蛋白表達(×400)

2.5 TGF－β1表達情況

采用細胞免疫熒光染色法，TGF-β1蛋白陽性信號染色呈綠色熒光，位于胞漿(圖3)。醛固酮組的TGF-β1蛋白表達較對照組顯著增加(P＜0.01)，且表達量隨苦參堿劑量的增大而降低。流式細胞儀雙標法的測定結果與細胞免疫熒光染色法一致(表2)。

表2 苦參堿對心肌成纖維細胞TGF-β1蛋白表達的影響

3 討論

苦參為豆科槐屬植物，主要成分為苦參堿、氧化苦參堿等多種生物堿類，以及苦參醇、苦參丁醇等多種黃酮類?？鄥⒅械纳飰A成分能夠抑制和逆轉早期肝纖維化病變，并已取得了確切的臨床療效?？鄥A可拮抗血小板衍生生長因子和血管緊張素Ⅱ的作用而抑制心肌成纖維細胞、皮膚成纖維細胞、血管平滑肌增殖[2-3]，還可通過調節(jié)多種與增殖、周期和凋亡相關基因的表達來抑制腫瘤細胞增殖或誘導分化與凋亡[4-6]。

本課題組既往的體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿能劑量依賴性地抑制壓力負荷因子血管緊張素Ⅱ誘導的離體心肌成纖維細胞的增殖，且與周期蛋白P27蛋白表達增強有關[7]。這提示苦參堿能抑制心肌間質纖維化，具有一定的抗心室重構作用。此外，高紅宇等[8]發(fā)現(xiàn)，苦參素可下調TGF-β1和Ⅰ型膠原的表達，抑制腎小管上皮細胞轉分化及肌成纖維細胞的活化與增殖，作用途徑可能是通過下調Smad3的表達，干預Smad3介導的細胞內信號轉導，最終減輕腎間質纖維化。但苦參堿對容量負荷醛固酮誘導的心肌成纖維細胞增殖及膠原代謝影響如何，TGF-β1在其中的作用還未見報道。

本試驗結果顯示，經醛固酮誘導心肌成纖維細胞增殖及膠原合成，苦參堿進行干預后，MTT-OD值、S期細胞百分比、羥脯氨酸含量均顯著低于醛固酮組(P＜0.01)。表明苦參堿具有很強的抑制容量負荷醛固酮誘導的心肌成纖維細胞增殖和膠原合成作用，并與濃度呈劑量效應關系，即具良好的抗心肌纖維化作用。

心臟中的TGF-β1主要由心肌細胞和心肌成纖維細胞產生，可促進多種基質成分合成，是多種生長因子誘導的心肌細胞及心肌成纖維細胞增殖的信號通路中的一個重要環(huán)節(jié)。TGF-β1作為成纖維細胞的強趨化因子，還可直接刺激其細胞外基質蛋白合成，促進心肌纖維化過程[9]。TGF-β1介導的信號通路主要有TGF-β1/Smad信號通路和非Smad信號通路。非Smad信號通路可活化Erk、JNK MAPK及RhoA，而TGF-β1/Smad信號通路是TGF-β促細胞增殖或分化的主要通路。本試驗結果顯示，苦參堿的抗纖維化作用可能與其下調TGF-β1蛋白表達有關。但具體的信號轉導通路機制尚需進一步的研究。

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