巴戟天藥材高效液相色譜指紋圖譜初步研究*

程學仁，羅文匯，孫冬梅，崔景朝

(廣東省中醫(yī)研究所，廣東 廣州 510095)

2005年版《中國藥典(一部)》中收載的巴戟天為茜草科植物巴戟天 Morinda officinalis How的干燥根。近代巴戟天的主流商品產(chǎn)于廣東的高要、德興及廣西蒼梧等地，《藥物出產(chǎn)辨》中謂產(chǎn)于以上地區(qū)的巴戟天可視為晚近藥用巴戟天的“新興品種”[1]。近幾年，指紋圖譜技術被用于中藥的質(zhì)量控制，其優(yōu)點是在大多數(shù)中藥有效成分尚不明確的情況下，能全面反映中藥復雜的化學成分和相對比例，有效地表征中藥質(zhì)量。筆者按照國家藥品監(jiān)督管理局《關于“中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)”的通知》要求[2]，參照相關文獻[3-6]，采用高效液相色譜法對巴戟天藥材進行了指紋圖譜研究，報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國惠普公司);二極管陣列檢測器;電子分析天平(Sartorius)。巴戟天對照藥材(編號為S1，中國藥品生物制品檢定所，批號為121163-200402);巴戟天藥材采自中國廣東、廣西、江西等地和越南，經(jīng)本所范宋玲主任中藥師鑒定為茜草科植物巴戟天 Morinda officinalis How，藥用部分為根，樣品來源詳見表1。液相用甲醇為進口色譜純，水為注射用水;提取用水為反滲透水;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1 巴戟天藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:甲醇-0.1%磷酸溶液系統(tǒng)，梯度洗脫，0～5 min甲醇50%，5～17 min甲醇 50% ～58%，35～55 min，甲醇 58% ～80%;柱溫:40℃;流速:0.8 mL/min;檢測波長:250 nm。

2.2 溶液制備

取巴戟天藥材約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷60 mL，回流3 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇使溶解并定容至2 mL，用0.45μm微孔濾膜濾過，搖勻，即得供試品溶液。取巴戟天對照藥材約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷60 mL，同法制成對照藥材溶液。

2.3 方法學考察

精密度試驗:取對照藥材溶液連續(xù)進樣6次，測定色譜指紋圖譜。計算得圖譜的相似度均大于0.98，各共有峰面積的 RSD小于0.60%，結(jié)果表明進樣的精密度良好。

重復性試驗:取4號樣品，按2.2項下制備方法制備供試品溶液，進樣，測定色譜指紋圖譜。計算得圖譜的相似度均大于0.97，各共有峰面積的 RSD小于0.75%，結(jié)果表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗:取4號樣品制備的供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時進樣，測定色譜指紋圖譜。計算得圖譜的相似度均大于0.96，各共有峰面積的 RSD小于1.43%，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 HPLC指紋圖譜分析與評價

圖譜制備:詳細比較10批巴戟天藥材的液相色譜圖，確定12個特征峰構(gòu)成巴戟天的指紋圖譜，各特征峰峰號及保留時間見表2。代表性指紋圖譜見圖1。

表2 10批巴戟天藥材指紋圖譜共有峰及保留時間

圖1 巴戟天藥材指紋圖譜共有峰

共有峰相似性評價:根據(jù)巴戟天藥材的高效液相色譜指紋圖譜確定共有峰23個，并對共有峰的相對峰面積比值進行考察。由于HPLC峰的絕對遷移時間變化較大，所以采用相對遷移時間對色譜峰進行鑒別。經(jīng)多次試驗，選擇5號峰作為參比內(nèi)標較為合適。相對遷移時間 αi=ti/ts，ti為樣品峰的遷移時間，ts為內(nèi)標峰的遷移時間。相對遷移時間 αi從小到大排列，相對遷移時間 αi下面列出了相對峰面積 βi。相對峰面積 βi=Ai/As，Ai為樣品峰面積，As內(nèi)標峰面積。結(jié)果見表3。可見，共有峰相對保留時間的 RSD小于1.94%;10批樣共有峰總面積占總峰面積的94.38%，非共有峰總面積均小于總峰面積的10%。

指紋圖譜相似度計算:采用《中國藥典》指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(A版)，對10批巴戟天藥材進行相似度評價。將10批藥材指紋圖譜導入相似度評價軟件，設定匹配模板，進行譜峰自動匹配，生成對照指紋圖譜，進行相似度評價。由表4可見，藥材與對照藥材圖譜的相似度(以平均數(shù)計算和以中位數(shù)計算)均大于0.9，表明10批藥材與對照藥材指紋圖譜相似度良好。

表3 巴戟天藥材高效液相色譜指紋圖譜的共有峰相對保留時間的相對峰面積(βi，n=4)

表4 10批巴戟天藥材相似度計算結(jié)果

3 討論

采用正交設計法對巴戟天的最佳提取條件進行篩選，其中對提取溶劑(甲醇、乙醇、乙酸乙酯和三氯甲烷)、提取時間、提取次數(shù)進行考察，采用HPLC進行測定，在綜合考慮峰面積較大、峰個數(shù)較多等幾個方面的因素后，確定2.2項中的提取條件為最佳提取條件。采用二極管陣列檢測器對指紋圖譜的檢測波長進行選擇，比較了不同波長下的色譜圖，基于峰面積較大、峰個數(shù)較多、分離度較好、峰形較好、基線較平穩(wěn)等多方面的考慮，最后選擇250nm作為最佳檢測波長。對巴戟天供試品溶液進行了甲醇-水和乙腈-水流動相系統(tǒng)考察，經(jīng)過分離效果的反復摸索，發(fā)現(xiàn)甲醇-水系統(tǒng)基線較乙腈-水系統(tǒng)平直，流動相中加入磷酸后改善了色譜峰的峰形和分離度。本研究建立的巴戟天藥材指紋圖譜方法具有很好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性，相似度計算在宏觀上能總體反映出巴戟天的化學特征，為規(guī)范巴戟天藥材的質(zhì)量提供了依據(jù)。在本研究中，雖然收集了10個巴戟天藥材，采用HPLC法作為獲得化學數(shù)據(jù)的手段，進行了巴戟天的指紋圖譜研究，但所獲得的信息也只能從一個側(cè)面反映巴戟天藥材的質(zhì)量。為了獲得更全面的分類信息，使巴戟天藥材質(zhì)量的評價方法更為完善，還需要收集更多的樣品進行比較分析。

[1]唐肖洪.巴戟天的研究進展[J].中國現(xiàn)代中藥，2006，8(11):29-30，33.

[2]國家藥品監(jiān)督管理局.中藥注射液指紋圖譜研究的技術要求(暫行)[J]. 中成藥，2000，22(10):671-675.

[3]屠鵬飛.高效液相色譜法制定中藥材和中藥注射劑特征指紋圖譜的探討[J]. 中成藥，2000，22(7):516.

[4]仰鐵錘，徐吉銀，梁英嬌，等.HPLC測定巴戟天中的水晶蘭苷[J].華西藥學雜志，2008，23(6):695-696.

[5]梁英嬌，徐吉銀，丁 平.巴戟天不同部位及混偽品中水晶蘭苷的含量測定[J]，中藥新藥與臨床藥理，2008，19(1):48-50.

[6]洪筱坤，王智華.中藥數(shù)字化色譜指紋圖譜[M].上海:上海科學技術出版社，2003:108.