正交試驗優(yōu)選風(fēng)濕Ⅱ號合劑提取工藝

朱海濤，管群，陳黎，袁勝浩，杜士明（.鄖陽醫(yī)學(xué)院附屬太和醫(yī)院，十堰市44000；.鄖陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，十堰市44000）

正交試驗優(yōu)選風(fēng)濕Ⅱ號合劑提取工藝

朱海濤1＊，管群2，陳黎1，袁勝浩1，杜士明1（1.鄖陽醫(yī)學(xué)院附屬太和醫(yī)院，十堰市442000；2.鄖陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，十堰市442000）

目的：優(yōu)選風(fēng)濕Ⅱ號合劑最佳提取工藝。方法：采用煎煮、微波提取、超聲提取3種方法提取藥材，以綠原酸與哈巴俄苷含量、浸膏得率為評價指標(biāo)，篩選出最佳提取方法，再采用正交試驗優(yōu)選出最佳提取工藝。結(jié)果：最佳提取方法為煎煮法；最佳提取工藝為12倍加水量，不浸泡，煎煮3次，每次1 h。結(jié)論：該提取工藝設(shè)計合理、結(jié)果可靠，可為研制風(fēng)濕Ⅱ號合劑提供理論基礎(chǔ)。

風(fēng)濕Ⅱ號合劑；提取工藝；綠原酸；哈巴俄苷；正交試驗

“風(fēng)濕Ⅱ號”為鄖陽醫(yī)學(xué)院附屬太和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科使用多年的驗方，處方中主要組成為忍冬藤、玄參、全蝎、烏梢蛇、土鱉蟲等13味藥材。全方具有祛風(fēng)止痛、活血行氣、清熱解毒、疏風(fēng)通絡(luò)之功效。臨床多以煎劑給藥，療效確切，副作用小。但煎劑攜帶、使用不便，將其改劑型為合劑，更容易被患者接受。本研究以綠原酸與哈巴俄苷含量、浸膏得率為考察指標(biāo)，采用煎煮、微波提取、超聲提取3種方法，確定最佳提取方法，然后采用正交試驗法優(yōu)選風(fēng)濕Ⅱ號合劑最佳提取工藝條件。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate3000型高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、紫外檢測器、Chromeleon軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國戴安公司）；FA 2004型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；CQX25-06型超聲波清洗器（功率250 W，頻率25 kHz，上海必能信超聲有限公司）；PJ17F-F（Q）型美的微波爐（功率700 W，順德市美的微波爐制造有限公司）；TDL-5A型臺式低速離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；DZTW型電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；HH系列電熱恒溫水浴鍋；8KFG01型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（湖北省黃石市醫(yī)療器械廠）。

1.2 試藥

藥材來自鄖陽醫(yī)學(xué)院附屬太和醫(yī)院中藥房，經(jīng)筆者鑒定符合2005年版《中國藥典》[1]標(biāo)準(zhǔn)（試驗前各藥材分別烘干粉碎過1號篩）；綠原酸對照品（批號：110753-200413）、哈巴俄苷對照品（批號：111730-200604）均由中國藥品生物制品檢定所提供；水為重蒸餾水，乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分的測定

2.1.1 綠原酸含量測定（1）色譜條件[1]：色譜柱為Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90），柱溫為30℃，流速為1 mL·min-1，檢測波長為327 nm。（2）對照品溶液的制備：精密稱取綠原酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.242 mg的溶液，搖勻，即得。（3）供試品溶液的制備：從定容至500 mL的提取液中精密量取20 mL，置蒸發(fā)皿中，在水浴上（70℃）蒸干，加適量甲醇超聲提取30 min，過濾，濾液置25 mL容量瓶中定容，搖勻，濾過（0.45 μm），取續(xù)濾液，即得。（4）線性關(guān)系考察：精密吸取上述對照品溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，采用二倍稀釋法，依次稀釋5個濃度，分別取不同濃度對照品溶液各10 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測定峰面積。以綠原酸濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y＝451.59X＋0.8696（r＝0.9999）。結(jié)果表明，綠原酸在0.242～0.0075 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。（5）精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液10 μL，按上述色譜條件測定6次。結(jié)果，RSD＝0.98%（n＝6），表明儀器精密度良好。（6）穩(wěn)定性試驗：將供試品溶液于室溫下放置，分別在0、2、4、6、8、10 h時各取10 μL，按上述色譜條件測定。結(jié)果，RSD＝1.57%（n＝6），表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。（7）加樣回收率試驗：精密吸取已知綠原酸濃度的同一提取液6份各20.0 mL，分別精密加入綠原酸對照品溶液（0.242 mg·mL-1）2.0 mL，按“2.1.1（3）”項下方法制備供試品溶液，并按上述色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，平均加樣回收率為98.35%，RSD＝2.04%（n＝6）。（8）含量測定：精密吸取供試品溶液10 μL，注入色譜儀中，按上述色譜條件測定，計算綠原酸含量。

2.1.2 哈巴俄苷含量測定（1）色譜條件[1]：色譜柱為Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-1%醋酸溶液（B）（梯度洗脫：0～20 min，流動相A從20%→50%；流動相B從80%→50%），柱溫為30℃，流速為1 mL·min-1，檢測波長為278 nm。（2）對照品溶液的制備：精密稱取哈巴俄苷對照品適量，加30%甲醇制成每1 mL含0.108 mg的溶液，搖勻，即得。（3）供試品溶液的制備：按“2.1.1（3）”項下方法制備。（4）線性關(guān)系考察：精密量取上述對照品溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，采用二倍稀釋法，依次稀釋5個濃度，分別取不同濃度對照品溶液各10 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測定峰面積。以哈巴俄苷濃度（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y＝396.39X+ 0.0568（r＝0.9999）。結(jié)果表明，哈巴俄苷在0.1080～0.0034 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。（5）精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液10 μL，按上述色譜條件測定6次。結(jié)果，RSD＝1.07%（n＝6），表明儀器精密度良好。（6）穩(wěn)定性試驗：將供試品溶液于室溫下放置，分別在0、2、4、6、8、10 h時各取10 μL，按上述色譜條件測定。結(jié)果，RSD＝1.41%（n＝6），表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。（7）加樣回收率試驗：精密吸取已知哈巴俄苷濃度的同一提取液6份各20.0 mL，分別精密加入哈巴俄苷對照品溶液（0.1080 mg·mL-1）1.0 mL，按“2.1.1（3）”項下方法制備供試品溶液，并按上述色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，平均加樣回收率為98.86%，RSD＝1.84%（n＝6）。（8）含量測定：精密吸取供試品溶液10 μL，注入色譜儀中，按上述色譜條件測定，計算哈巴俄苷含量。

2.1.3 浸膏得率的測定從定容至500 mL的提取液中分別精密量取20 mL，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴上蒸干后在烘箱中（105℃）干燥至恒重，稍冷后于干燥器內(nèi)冷卻0.5 h，取出，精密稱重，計算浸膏得率。

2.2 不同提取方法比較

2.2.1 處方忍冬藤30 g、玄參20 g、全蝎5 g、烏梢蛇10 g、土鱉蟲10 g等13味藥材。

2.2.2 提取方法（1）煎煮法：稱取處方量1/3藥材粉末3份，分別加入12倍量水，浸泡0.5 h，煎煮2 h，濾過，共煎煮3次，合并濾液，濾液濃縮至400 mL，5000 r·min-1離心15 min，取上清液定容至500 mL。（2）超聲提取法：稱取處方量1/3藥材粉末3份，加入12倍量水，浸泡0.5 h，超聲提取1 h，濾過，共提取3次，合并濾液，其余步驟同“2.2.2（1）”項。（3）微波提取法：稱取處方量1/3藥材粉末3份，加入12倍量水，浸泡0.5 h，置微波爐中提?。ㄖ械突穑?次，每次30 min，濾過，合并3次濾液，其余步驟同“2.2.2（1）”項。（4）結(jié)果及分析：采用煎煮法、超聲提取法、微波提取法對藥材進(jìn)行提取得到的提取液，分別按“2.1.1”、“2.1.2”和“2.1.3”項下方法測定提取液中綠原酸和哈巴俄苷含量以及浸膏得率。3種不同提取方法的比較結(jié)果見表1。由表1可知，煎煮法得到的綠原酸和哈巴俄苷含量以及浸膏得率均比超聲提取法和微波提取法高，所以風(fēng)濕Ⅱ號合劑的提取方法選擇煎煮法。

表13 種不同提取方法的比較（n＝3）Tab 1Comparison of 3 kinds of extraction methods（n＝3）

2.3 提取工藝的優(yōu)選

2.3.1 正交設(shè)計根據(jù)文獻(xiàn)資料[2，3]，選擇加水量（A）、浸泡時間（B）、煎煮時間（C）、煎煮次數(shù)（D）為考察因素，每個因素取3個水平，以綠原酸與哈巴俄苷含量、浸膏得率為考察指標(biāo)，選用L9（34）正交表對這4個因素進(jìn)行綜合考察，以篩選煎煮法提取風(fēng)濕Ⅱ號合劑的最佳工藝條件。因素水平見表2；正交試驗結(jié)果見表3；方差分析結(jié)果見表4（注：綜合評分值＝（綠原酸含量/最大綠原酸含量）×100×0.4+（哈巴俄苷含量/最大哈巴俄苷含量）×100×0.4+（浸膏得率/最大浸膏得率）×100×0.2[4]）。

表2 因素水平Tab 2Factors and level

表3 正交試驗結(jié)果Tab 3Results of orthogonal test

由表2、表3、表4可知，各因素作用主次順序為D＞A＞C＞B。結(jié)果表明，因素D（煎煮次數(shù)）為主要影響因素，差異有極顯著性（P＜0.01）；因素A（加水量）為次要影響因素，差異有顯著性（P＜0.05）；因素B、C對試驗結(jié)果均無顯著影響（P＞0.05）。由于B、C 2項各水平間差異無顯著性，因素3水平間結(jié)果差異極小，考慮到實際生產(chǎn)中能源消耗、節(jié)約時間等因素，最終確定提取工藝為A3B1C1D3，即12倍加水量，不浸泡，煎煮3次，每次1 h。

2.3.2 驗證試驗取處方量1/3的藥材3份，按照優(yōu)化的條件進(jìn)行工藝驗證試驗。結(jié)果，綠原酸含量為0.0292 mg·mL-1，哈巴俄苷含量為0.0116 mg·mL-1，浸膏得率為31.14%，平均綜合評分為99.99（n＝3），RSD＝2.3%，表明正交設(shè)計篩選出的工藝穩(wěn)定可行。

表4 方差分析結(jié)果Tab 4Results of variance analysis

3 討論

風(fēng)濕Ⅱ號合劑為復(fù)方制劑，原煎劑用水煎煮，為保證臨床療效，選擇水為提取溶劑。根據(jù)文獻(xiàn)資料[4，5]，動物藥材全蝎以乙醇為溶劑可提取出更多的有效成分，但預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)動物藥材乙醇提取液與其它藥材水提液混合后有沉淀產(chǎn)生，影響合劑的質(zhì)量，因此選擇水作為全方的提取溶劑。

處方中忍冬藤具清熱解毒、疏風(fēng)通絡(luò)的功效，玄參具涼血滋陰、瀉火解毒的功效，分別為君藥和臣藥，其分別含有的化學(xué)成分綠原酸和哈巴俄苷均為有效成分之一，故以綠原酸、哈巴俄苷含量為評價指標(biāo)；又因處方中其它藥材味數(shù)較多，有效成分暫不十分明確，故試驗還將浸膏得率作為評價指標(biāo)之一。

用多指標(biāo)正交試驗進(jìn)行工藝優(yōu)選時，首先要解決指標(biāo)間量綱不一致和指標(biāo)間的矛盾問題。然后針對指標(biāo)間的重要性差異給出各指標(biāo)權(quán)重，綜合評分后再進(jìn)行統(tǒng)計分析。應(yīng)用多指標(biāo)綜合評分法時，設(shè)置指標(biāo)的權(quán)重，需根據(jù)具體情況具體分析。本試驗中綠原酸、哈巴俄苷為有效成分，將其權(quán)重系數(shù)都設(shè)為0.4，而浸膏得率的大小對療效的影響沒有前兩者重要，所以將其權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.2。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：76、133.

[2]梅全喜，曾聰彥，黃偉群.復(fù)方土牛膝顆粒的水提工藝優(yōu)選及質(zhì)量控制方法研究[J].中國藥房，2007，18（27）：2107.

[3]張濤，曾聰彥，梅全喜，等.正交試驗優(yōu)選四黃膏提取工藝[J].中國藥房，2008，19（12）：908.

[4]李麗，周軍，張瑩，等.多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)化痛風(fēng)寧顆粒提取工藝[J].中成藥，2007，29（2）：281.

[5]鄒龍，郭建生，桂卉，等.全蝎鎮(zhèn)痛成分的提取工藝研究[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，24（2）：19.

Optimization of the Extraction Technology of FengshiⅡMixture by Orthogonal Experiment

ZHU Hai-tao，CHEN Li，YUAN Sheng-hao，DU Shi-ming（Taihe Hospital of Yunyang Medical College，Shiyan 442000，China）
GUAN Qun（Dept.of Pharmacy，Yunyang Medical College，Shiyan 442000，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of FengshiⅡmixture.METHODS：Decoction，microwave extraction and ultrasonic extraction were applied.The extraction method was optimized with content of chlorogenic acid and harpagoside，the yield of extraction as index.The extraction technology was optimized by orthogonal experiment.RESULTS：Decoction is the optimal extraction method，and the optimal extraction technology was as follows：10-fold water，no marinating，extracting for 3 times and for 1 hour.CONCLUSION：The extraction technology is reasonable and reliable，which provide theory basis for the preparation of FengshiⅡmixture.

FengshiⅡmixture；Extraction technology；Chlorogenic acid；Harpagoside；Orthogonal experiment

R283；R97

A

1001-0408（2010）19-1754-03

2009-06-25

2009-11-27）