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    乳酸菌蛋白代謝研究進(jìn)展

    2010-10-28 07:06:42白鳳翎張柏林趙宏飛
    食品科學(xué) 2010年19期
    關(guān)鍵詞:寡肽肽酶酪蛋白

    白鳳翎,張柏林,趙宏飛

    (1.渤海大學(xué)生物與食品科學(xué)學(xué)院,遼寧 錦州 121000;2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)

    乳酸菌蛋白代謝研究進(jìn)展

    白鳳翎1,張柏林2,趙宏飛2

    (1.渤海大學(xué)生物與食品科學(xué)學(xué)院,遼寧 錦州 121000;2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)

    由于乳酸菌缺乏各種生物合成途徑,不能合成生長(zhǎng)必需的一些氨基酸、維生素等物質(zhì),營(yíng)養(yǎng)要求也十分苛刻。乳酸菌擁有胞外蛋白酶,水解乳中酪蛋白形成寡肽和氨基酸,通過(guò)寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Opp、二肽和三肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)DtpP和DtpT將水解產(chǎn)物運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞,胞內(nèi)的各種肽酶裂解形成游離氨基酸供細(xì)胞合成代謝,滿足乳酸菌的生長(zhǎng)需要。乳酸菌蛋白代謝研究對(duì)提高乳酸菌的生長(zhǎng)水平、建立高密度培養(yǎng)體系以及促進(jìn)奶酪等乳制品發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)及其風(fēng)味前體物質(zhì)的形成研究具有重要意義。

    乳酸菌;蛋白質(zhì);代謝

    乳酸菌是一類革蘭氏陽(yáng)性球狀、球桿狀和桿狀細(xì)菌,能夠在厭氧或兼性厭氧條件下發(fā)酵己糖產(chǎn)生乳酸,形成與人類生活密切相關(guān)的發(fā)酵產(chǎn)品。由于乳酸菌屬于分類地位差異性很大的細(xì)菌類群,對(duì)乳酸菌生理代謝進(jìn)行研究開展比較緩慢。深入了解乳酸菌這一特殊類群細(xì)菌的生物學(xué)特征,對(duì)提高乳酸菌代謝水平、開發(fā)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品具有非常重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

    自然環(huán)境中乳酸菌能夠很好地利用棲息地中的物質(zhì)生長(zhǎng),與乳中乳酸菌能夠很好地適應(yīng)利用乳糖作為碳源和能源一樣,乳酸菌也很好地應(yīng)用酪蛋白作為氮源。乳酸菌不能同化無(wú)機(jī)氮源,因此,它們必須降解蛋白質(zhì)和多肽來(lái)滿足細(xì)胞合成代謝對(duì)氨基酸的需要。1974年Mckay等[1]首先證明了乳酸菌必須依靠自身蛋白水解系統(tǒng)降解乳中酪蛋白才能滿足其生長(zhǎng)的需要,他們研究發(fā)現(xiàn),乳酸乳球菌蛋白酶基因質(zhì)粒的治愈菌株不能在乳中進(jìn)行高密度生長(zhǎng),如果在乳中添加水解酪蛋白,則質(zhì)粒治愈菌株就會(huì)同正常菌株一樣生長(zhǎng)。

    乳中乳酸菌已經(jīng)進(jìn)化具有降解大分子酪蛋白為小分子片段的高效系統(tǒng),能夠滿足在乳中生長(zhǎng)對(duì)氨基酸的需要。該蛋白水解系統(tǒng)包括三組主要成分:第一組為將大分子酪蛋白水解成多肽的胞外蛋白酶;第二組是將多肽轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞的多個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體系中的一個(gè)系統(tǒng);第三組包含將轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞多肽進(jìn)一步水解形成自由氨基酸的多種肽酶(圖1),這些氨基酸最終進(jìn)行代謝或合成蛋白質(zhì)。本文對(duì)乳酸菌蛋白代謝的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,對(duì)深入了解掌握乳酸菌的蛋白代謝機(jī)制,提高乳酸菌的生長(zhǎng)水平和建立高密度培養(yǎng)體系具有借鑒作用。同時(shí),乳酸菌蛋白代謝研究也可為奶酪等乳制品發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)及其風(fēng)味前體物質(zhì)的形成方面提供理論基礎(chǔ)。

    圖1 乳球菌的酪蛋白水解系統(tǒng)[1]Fig.1 Proteolytic system in Lactococci

    1 蛋白酶系統(tǒng)

    雖然人們認(rèn)為乳酸菌可能具有各種各樣的蛋白水解系統(tǒng),但是被廣泛研究的且大多數(shù)乳酸菌都擁有的是乳酸乳球菌的蛋白水解系統(tǒng)。對(duì)于乳酸乳球菌和其他乳中生長(zhǎng)的乳酸菌而言,酪蛋白是氨基酸態(tài)氮的主要來(lái)源,然而乳中非蛋白氮和自由氨基酸是有限的(<300mg/L),隨著乳酸菌生長(zhǎng)很快就被消耗掉。乳酸乳球菌屬于復(fù)合氨基酸自養(yǎng)型微生物,需要盡可能多的氨基酸,因此酪蛋白水解對(duì)其生長(zhǎng)是十分必要的。乳酸乳球菌擁有一個(gè)大的、沒(méi)有活性的蛋白酶原表達(dá)的與細(xì)胞膜結(jié)合的絲氨酸蛋白酶(PrtP)(>200kD)。如果對(duì)蛋白質(zhì)跨過(guò)細(xì)胞膜有直接作用的前導(dǎo)序列被除去的話,則剩余蛋白就被錨定在細(xì)胞壁上,然而,該蛋白酶原只有被成熟蛋白(PrtM)加工后才具有活性。PrtM可能是將PrtP自動(dòng)降解成小片段,導(dǎo)致酶對(duì)蛋白區(qū)的水解,形成成熟的分子質(zhì)量為180~190kD 的PrtP。

    不同的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株中擁有相類似的蛋白酶,然而它們的氨基酸序列具有小的差異。乳酸乳球菌中特殊的酪蛋白底物和PrtP水解產(chǎn)物不盡相同。例如,PⅢ型A群蛋白酶水解αs1-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白,而PⅠ型E群蛋白酶具有較強(qiáng)的水解β-酪蛋白活性,對(duì)αs1-酪蛋白和κ-酪蛋白水解能力較弱。進(jìn)一步而言,乳酸乳球菌中PrtP和PrtM系統(tǒng)的功能性差異較小。乳酸菌在乳中迅速生長(zhǎng)二者都是必需的,當(dāng)細(xì)胞在低含量肽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí),基因PrtP和PrtM被誘導(dǎo)表達(dá),而在肽豐富的培養(yǎng)基中則被抑制[2]。

    來(lái)自于PrtP對(duì)β-酪蛋白的水解作用有超過(guò)100多種酪蛋白水解產(chǎn)物,這些產(chǎn)物大多數(shù)是4到10個(gè)氨基酸殘基大片段的大分子寡肽(4~30 氨基酸),沒(méi)有形成游離氨基酸、二肽和三肽[2]。由PrtP形成首要的也是最豐富的寡肽是由β-酪蛋白的C端產(chǎn)生的,似乎最初的水解作用引起酪蛋白打開,導(dǎo)致其他的裂解片段暴露出來(lái)[3]。

    2 氨基酸和多肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

    雖然有學(xué)者認(rèn)為在多肽被轉(zhuǎn)運(yùn)前胞外蛋白酶一定參與降解多肽的過(guò)程,但到現(xiàn)在為止,由PrtP形成的多肽水解體系還沒(méi)有發(fā)現(xiàn),至少也沒(méi)發(fā)現(xiàn)多肽酶。相反,乳酸乳球菌和其他乳酸菌擁有各種各樣的氨基酸和多肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),能夠轉(zhuǎn)運(yùn)大小、極性和結(jié)構(gòu)不同的底物。這些轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有些是具有高特異性的,而有些的特異性相對(duì)較差,同時(shí)在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中也消耗能量。

    如前所述,乳中氨基酸的濃度太低不能支持乳酸菌的生長(zhǎng)需要。乳酸乳球菌至少有10種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)子,大多數(shù)轉(zhuǎn)運(yùn)子具有結(jié)構(gòu)相似性,其底物具有特異性。如果培養(yǎng)基中含有足夠的游離氨基酸,這些轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)能夠使足夠的氨基酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),支持細(xì)胞生長(zhǎng)。然而,這暗示了轉(zhuǎn)運(yùn)子的首要功能是從細(xì)胞質(zhì)中分泌或流出過(guò)多的氨基酸來(lái)維持適當(dāng)?shù)募?xì)胞內(nèi)氨基酸池的比例[4]。如果多肽是氨基酸的必需、首要氮源的話,那么一些由細(xì)胞內(nèi)多肽產(chǎn)生的氨基酸可能積累比同化吸收快些,這些游離氨基酸能夠通過(guò)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)子以相反或流出的方向擴(kuò)散到細(xì)胞外降低它們的濃度差。如果氨基酸的流出是伴隨偶合離子的話(如質(zhì)子擴(kuò)散),則獲得質(zhì)子動(dòng)力(proton motive force,PMF)的增加值。氨基酸的擴(kuò)散提供能量甚至有可能驅(qū)動(dòng)多肽的吸收[4]。

    與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)子具有鮮明對(duì)比的是多肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),它們能夠很好地滿足乳酸菌在乳中生長(zhǎng)的需要。已經(jīng)確證有三組多肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),包括轉(zhuǎn)運(yùn)二肽和三肽的兩組DtpP和DtpT和轉(zhuǎn)運(yùn)寡肽的寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Opp。DtpT是一個(gè)含有463個(gè)氨基酸組成的依賴PMF轉(zhuǎn)運(yùn)大單體,與水溶性多肽具有親和力。已經(jīng)被獲得去掉dtpT基因的突變菌株不能表達(dá)DtpT和轉(zhuǎn)運(yùn)一些多肽。在化學(xué)限定培養(yǎng)基上dtpT基因缺陷菌株生長(zhǎng)很差。然而,這些突變菌株在乳中的生長(zhǎng)不受影響,表明DtpT 在乳中不是必需的。乳酸菌的另一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)二肽和三肽的DtpP轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是一種ATP依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),對(duì)水溶性多肽具有高度親和性,對(duì)乳球菌在乳中生長(zhǎng)也不是必需的[5]。

    乳酸菌中第3種也是最重要的是寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Opp。由于二肽和三肽都不是由酪蛋白釋放的,因此對(duì)乳酸菌在乳中生長(zhǎng)DtpP和DtpT都不是必需的,乳酸乳球菌依賴寡肽和Opp來(lái)滿足所有氨基酸的需要。實(shí)驗(yàn)證明不能表達(dá)編碼Opp系統(tǒng)的基因突變菌株不能轉(zhuǎn)運(yùn)多肽,也不能在乳中生長(zhǎng)[6-7]。盡管最初還不知道寡肽是由Opp轉(zhuǎn)運(yùn)的,乳酸乳球菌乳酸亞種中Opp系統(tǒng)的很多結(jié)構(gòu)和遺傳學(xué)特征已很好地被研究清楚[8]。Opp復(fù)合體屬于轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的ABC(ATP結(jié)合盒)家族,它含有5個(gè)亞基:包括兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)膜蛋白OppB和OppC,兩個(gè)ATP結(jié)合蛋白OppD和OppF和1個(gè)膜連接底物結(jié)合蛋白OppA。編碼Opp的5個(gè)基因形成oppDFBCA的操縱子,一個(gè)編碼肽酶PepO的基因緊接著也定位OppA 的下端,和Opp操縱子有共同轉(zhuǎn)錄區(qū)[7]。

    雖然Opp系統(tǒng)可以轉(zhuǎn)運(yùn)多種多樣的寡肽,在PrtP從β-酪蛋白釋放出100多種多肽中,只有10~14種多肽作為Opp的底物。所有這些寡肽含有4~11個(gè)氨基酸殘基[3],進(jìn)一步分析它們含有高水平的纈氨酸、脯氨酸和谷氨酸,中等水平的丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸和絲氨酸。十分重要的是這些寡肽提供除了組氨酸以外的所有必需氨基酸供乳球菌在乳中生長(zhǎng)需要。

    3 肽 酶

    蛋白質(zhì)代謝的第三步即最后一步是Opp積聚的多肽水解成片段。來(lái)自乳酸乳桿菌和乳酸乳球菌20多種不同的肽酶的生化和遺傳學(xué)特征已經(jīng)研究清楚(表1)。內(nèi)肽酶(裂解中間多肽鍵)和外肽酶(裂解末端肽鍵)廣泛分布,后者中氨基肽酶已經(jīng)報(bào)道,然而C端肽酶還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。一般情況下,需要內(nèi)肽酶、氨基肽酶、二肽酶和三肽酶的共同協(xié)調(diào)作用才能完全利用由Opp系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞積聚的多肽。盡管有相當(dāng)多的討論,基于遺傳學(xué)和生理學(xué)的見(jiàn)證(信號(hào)肽的缺乏和錨定序列以及免疫標(biāo)定實(shí)驗(yàn)等)更容易接受的是這些肽酶是細(xì)胞內(nèi)酶。乳酸菌肽酶的底物大小、特性和其他一些特征已經(jīng)引起人們的濃厚興趣,這不僅是因?yàn)殡拿干韺W(xué)的重要性,而且在奶酪制造和成熟等方面肽酶發(fā)揮著非常重要的作用。

    表1 乳酸菌的肽酶Table 1 Previously reported LAB-derived peptidases and their characteristics

    3.1 內(nèi)肽酶

    幾種內(nèi)肽酶包括乳酸乳球菌中PepF、PepO[9]和瑞士乳桿菌中的PepE、PepG、PepO[10]已經(jīng)被報(bào)道。大多數(shù)內(nèi)肽酶是含有典型鋅結(jié)合序列的金屬酶,可以對(duì)各種大小的多肽進(jìn)行水解。更有趣的是一些內(nèi)肽酶如PepF在pH7.5~9.0范圍內(nèi)具有最佳活性,在奶酪成熟的pH值范圍(<6.0)活性很低。因此,這些肽酶在細(xì)胞生理學(xué)和奶酪成熟中的作用很小。此外,乳中多肽酶突變菌株不受影響[9,11]。

    3.2 二肽酶和三肽酶

    來(lái)自培養(yǎng)基中積累或細(xì)胞內(nèi)寡肽水解的二肽和三肽被二肽酶和三肽酶進(jìn)一步水解成游離氨基酸。幾種二、三肽酶已經(jīng)被純化,基因已被克隆[11]。盡管這些酶有各種各樣自身的生物化學(xué)和物理學(xué)特性,但它們都是基于底物的特性而發(fā)揮作用。一些二肽酶和三肽酶具有非常重要的功能。幾種二肽酶屬于脯氨酰氨基酸二肽酶或氨酰基脯氨酸二肽酶,水解N端或C端具有脯氨酸的肽。例如,乳酸乳球菌中的PepQ和瑞士乳桿菌中的PepR分別裂解X ↓ Pro和Pro ↓ X 的二肽[12-13]。另一些水解含脯氨酸二肽和三肽的肽酶也被報(bào)道[14]。乳酸乳桿菌中三肽酶水解三肽PepT具有特征性[15]。

    3.3 氨基肽酶

    氨基肽酶廣泛存在于乳酸菌中,它是水解N端肽鍵釋放N端氨基酸的酶[16]。以酶的特征對(duì)氨基肽酶進(jìn)行分類,一般的或特異性較差的氨基肽酶PepN和PepC水解2~12個(gè)氨基酸的寡肽,一般很少有水解含脯氨酸二肽的活性,這些酶很好地存在于乳酸乳桿菌和乳酸乳球菌中。

    因?yàn)棣?酪蛋白富含脯氨酸,很多PrtP寡肽產(chǎn)物含有脯氨酸。如前所述,含脯氨酸多肽通常對(duì)一般的肽酶是特異性較差的底物,相反特異性較強(qiáng)的如PepA、PepX、PepP、PepR和PepI等能夠水解這些含脯氨酸多肽。像其他肽酶一樣,氨基肽酶因底物的大小和特性不同而多種多樣。例如,乳酸乳球菌中PepP的底物是具有X-Pro-Pro-(X)n序列4~10個(gè)氨基酸的寡肽[17]。相反,乳酸乳球菌中PepX水解相似的寡肽之外,還能水解二肽和一些不含脯氨酸的多肽[18]。一般的和特異性強(qiáng)的氨基肽酶對(duì)奶酪生產(chǎn)都特別重要,因?yàn)樵S多多肽不進(jìn)行降解的話就具有苦味。

    4 結(jié) 語(yǔ)

    由于乳酸菌缺乏必要的生物代謝途徑,不能合成生長(zhǎng)所必需的氨基酸和維生素等生長(zhǎng)因子,乳酸菌必須從培養(yǎng)基中獲得這些生物活性物質(zhì)才能滿足其快速生長(zhǎng)需要。乳酸菌依靠胞外蛋白酶水解乳中酪蛋白形成寡肽和氨基酸,這些水解產(chǎn)物通過(guò)寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Opp、二肽和三肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)DtpP和DtpT運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞,最后由細(xì)胞內(nèi)的各種肽酶裂解形成游離氨基酸供細(xì)胞合成代謝。由此可以表明乳酸菌在自然生長(zhǎng)環(huán)境中已經(jīng)形成了一整套完善的蛋白代謝系統(tǒng),這是生物與環(huán)境相互作用的結(jié)果。

    近年來(lái)對(duì)乳酸菌蛋白代謝機(jī)制的進(jìn)一步研究主要集中在分子生物學(xué)調(diào)控方面[19-20],通過(guò)深入研究可從基因水平掌握乳酸菌的蛋白代謝機(jī)制。從而利用代謝調(diào)控手段提高乳酸菌的生長(zhǎng)數(shù)量和代謝水平,推動(dòng)乳酸菌研究的迅速發(fā)展,獲得高水平的發(fā)酵產(chǎn)品。

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    Progress in Protein Metabolism of Lactic Acid Bacteria

    BAI Feng-ling1,ZHANG Bo-lin2,ZHAO Hong-fei2
    (1. College of Biotechnology and Food Science, Bohai University, Jinzhou 121000, China;2. College of Biological Science and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

    Due to the lack of various biosynthetic pathways, lactic acid bacteria (LAB) are nutritionally fastidious and unable to synthesize some essential amino acids and vitamins. LAB possess extracellular proteinase and this enzyme hydrolyzes dairy casein into oligopeptides and amino acids, which can be transported into cells by the oligopeptide transport system (Opp) and the di-tripeptide transport systems (DtpT and DtpP), followed by the hydrolysis of intracellular oligopeptides by endogenous peptidases into free amino acids supporting the synthesis and metabolism of LAB cells during their growth. Hence, studies of protein metabolism in lactic acid bacteria have great significance for improving LAB growth, establishing high-density culture systems and promoting the formation of flavor compounds and their precursors during the fermentation of cheese and other dairy products.

    lactic acid bacteria;protein;metabolism

    Q936

    A

    1002-6630(2010)19-0381-04

    2010-06-28

    國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z344;2008AA10Z335);遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2008S005)

    白鳳翎(1964—),男,教授,博士,研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)與食品生物技術(shù)。E-mail:baifling@yahoo.com.cn

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