反油酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

于化泓，李湘梅，劉 蓉，鄧澤元*，李 靜，范亞葦，胡蔣寧

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

反油酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

于化泓，李湘梅，劉 蓉，鄧澤元*，李 靜，范亞葦，胡蔣寧

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

目的：觀察反油酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖活力的影響。方法：采用50、100、200、400、600μmol/L等5個(gè)濃度的反油酸作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，以正常組為陰性對(duì)照組，NaOH組(200μmol/L)為陽(yáng)性對(duì)照組，MTT法和臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的毒性。結(jié)果顯示：反油酸組內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力明顯低于正常組，且高濃度組(400、600μmol/L)對(duì)細(xì)胞增殖抑制率明顯高于低濃度組(50μmol/L)；而NaOH組與正常組比較卻無(wú)明顯差異。此外，反油酸組活細(xì)胞率降低。結(jié)論：反油酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有明顯毒副作用，其生長(zhǎng)抑制率與反油酸濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)。

反油酸；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；MTT法

心血管疾病是在全世界死亡率和發(fā)病率較高的一種疾病?！?002年世界衛(wèi)生報(bào)告》指出，全球每年因心血管病死亡約1700萬(wàn)人[1]。在我國(guó)，肥胖和高血壓人口達(dá)2億6千萬(wàn)，每年有250萬(wàn)人死于心腦血管疾病，尤其是動(dòng)脈粥樣硬化。我國(guó)居民攝食油脂含量較高，遠(yuǎn)超過(guò)了營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦的水平。氫化油作為食品加工中常用的油脂，其中反式脂肪酸(TFA)的含量較高[2]。研究表明，反式脂肪酸對(duì)心血管疾病特別是動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生呈正相關(guān)[3]。目前有關(guān)反式脂肪酸的研究主要集中在其對(duì)血液成分的影響和對(duì)心血管疾病的關(guān)系。現(xiàn)有學(xué)者報(bào)道反式脂肪酸引起心血管疾病部分是因?yàn)槠鋾?huì)誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[4]。觀測(cè)研究與隨機(jī)對(duì)比臨床實(shí)驗(yàn)均表明TFA的攝入能引起內(nèi)皮功能障礙和系統(tǒng)炎癥，且這一影響遠(yuǎn)大于對(duì)血脂的影響，但具體機(jī)制還有待深入研究[5]。因此，從內(nèi)皮細(xì)胞這一新的角度深入認(rèn)識(shí)反式脂肪酸引起心血管疾病的發(fā)病機(jī)理，有利于更為透徹地了解心血管疾病，為我國(guó)心血管疾病的防治提供科學(xué)依據(jù)。本研究采用MTT法和臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)研究反油酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響，進(jìn)而了解其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 江西醫(yī)學(xué)院；反油酸標(biāo)準(zhǔn)品Sigma公司；初生牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM Invitrogen 公司；PBS 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、MTT、臺(tái)盼藍(lán) Solarbio公司；EDTA、重鉻酸鉀、硫酸、DMSO 天津大茂公司。

CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜、倒置顯微鏡、MK3型酶標(biāo)儀 賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)

用含10%初生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)[6]

1.2.2.1 不同密度細(xì)胞對(duì)反油酸作用反應(yīng)靈敏性的比較

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞為1×104、1.5 × l04、2 × 104、2.5 × 104、4 × 104個(gè) /mL 5個(gè)濃度，以100μL/孔接種于96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，種兩板，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)穩(wěn)定后，其中一板為正常組，另一板加入反油酸，濃度為20μmol/L，作用24h后，用MTT法于570nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值(OD570nm)。重復(fù)3次。計(jì)算內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。

抑制率/%= (1－實(shí)驗(yàn)組OD570nm/正常組OD570nm)×100

1.2.2.2 MTT法測(cè)定不同濃度反油酸對(duì)細(xì)胞活力的影響

將80%融合生長(zhǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以胰蛋白酶消化后以2.5×104個(gè)/ mL的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)液，換用含5%初生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，以9:1的比例加入不同濃度的反油酸母液，使其終濃度為50、100、200、400、600μmol/L，其中反油酸母液以0.1mol/L NaOH促溶，使NaOH在實(shí)驗(yàn)組中的濃度為200μmol/L，每組6個(gè)復(fù)孔，以正常組為陰性對(duì)照組，NaOH組(200μmol/L)為陽(yáng)性對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24、48h后，移出培養(yǎng)液，換入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液180μL/孔，并于每孔加入MTT(5g/L)20μL。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄原培養(yǎng)液，每孔中加入DMSO 150μL，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，并用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度值(OD570nm)，計(jì)算各濃度反油酸對(duì)細(xì)胞抑制率的影響。

1.2.3 臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)[7]

將80%融合生長(zhǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以胰蛋白酶消化后以5×104個(gè)/mL的密度接種于100mL的培養(yǎng)瓶中，每瓶5mL，每個(gè)濃度重復(fù)3次。培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)液，分別加入含0、50、1 00、2 00、400、600 μmol/L的DMEM培養(yǎng)液(5%初生牛血清)，繼續(xù)培養(yǎng)48h。PBS沖洗細(xì)胞，0.25%的胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸液，并作適當(dāng)稀釋(106個(gè)/mL)。取5滴細(xì)胞懸液于小試管中，加入5滴0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液混勻。在3min中內(nèi)用血球計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞(死細(xì)胞呈藍(lán)色)，并計(jì)算活細(xì)胞率。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同密度細(xì)胞對(duì)反油酸反應(yīng)靈敏性的比較

不同密度內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)反油酸作用反應(yīng)靈敏性不同，其對(duì)細(xì)胞OD570nm的影響見(jiàn)表1。反油酸對(duì)細(xì)胞抑制率的大小與細(xì)胞接種密度存在一定關(guān)系，當(dāng)接種細(xì)胞密度為2.5×104個(gè)/ mL時(shí)，反油酸的抑制作用最強(qiáng)。因此這一濃度為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞毒理實(shí)驗(yàn)的較好濃度。

2.2 不同濃度和作用時(shí)間下反油酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響

由表2可見(jiàn)，反油酸組與正常組相比，OD570nm顯著減少(P＜0.05)，且各濃度組間，50與400、600μmol/L組存在明顯差異，而NaOH組與正常組無(wú)明顯差異。此外，反油酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率亦受時(shí)間的影響，在作用24h后，只有高濃度組的反油酸(400、600μmol/L)與NaOH組存在明顯差異，但當(dāng)作用時(shí)間增至48h時(shí)，反油酸組均與NaOH組存在顯著差異，且細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大?？梢?jiàn)反油酸在上述劑量范圍(50～600μmol/L)內(nèi)對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且與作用時(shí)間和濃度呈正相關(guān)。

表1 反油酸對(duì)不同密度細(xì)胞OD570nm的影響(±s)Table 1 Effect of oleic acid on OD values at 570 nm of different density HUVEC cell suspensions (±s)

表1 反油酸對(duì)不同密度細(xì)胞OD570nm的影響(±s)Table 1 Effect of oleic acid on OD values at 570 nm of different density HUVEC cell suspensions (±s)

注：*.與正常組比較， 差異顯著(P＜0.05)。

組別 OD570nm 1×104個(gè)/mL 1.5×104個(gè)/mL 2×104個(gè)/mL 2.5×104個(gè)/mL 4×104個(gè)/mL正常組 0.119±0.012 0.166±0.016 0.191±0.013 0.237±0.011 0.258±0.016反油酸組 0.098±0.010* 0.124±0.010* 0.141±0.017* 0.158±0.016* 0.215±0.019*

表2 不同濃度和不同作用時(shí)間下反油酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率±s)Table 2 Effect of oleic acid concentration and treatment time on the inhibition rate on HUVEC cell proliferation±s)

表2 不同濃度和不同作用時(shí)間下反油酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率±s)Table 2 Effect of oleic acid concentration and treatment time on the inhibition rate on HUVEC cell proliferation±s)

注：*.與正常組比較，差異顯著(P＜0.05)；★.與反油酸50μmol/L組比較，差異顯著(P＜0.05)；▲.與NaOH組比較，差異顯著(P＜0.05)。

組別 反油酸濃 OD570nm 抑制率/%度/(μmol/L) 24h 48h 24h 48h正常組 0 0.242±0.015 0.326±0.021 — —1組 50 0.217±0.012* 0.291±0.018*▲ 10.33 10.74 2組 100 0.213±0.007* 0.285±0.010*▲ 11.98 12.58 3組 200 0.213±0.011* 0.277±0.019*▲ 11.98 15.03 4組 400 0.208±0.009*★▲ 0.254±0.017*★▲ 14.05 22.09 5組 600 0.205±0.013*★▲ 0.228±0.016*★▲ 15.29 30.06 NaOH組 0 0.228±0.016 0.315±0.017 — —

2.3 臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)

臺(tái)盼藍(lán)染色后，發(fā)現(xiàn)反油酸組有藍(lán)染的死亡細(xì)胞，而正常組沒(méi)出現(xiàn)。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞，并計(jì)算活細(xì)胞率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 反油酸作用48h對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活細(xì)胞率的影響Fig.1 Effect of oleic acid concentration on viability of HUVEC cells after oleic acid treatment for 48 h

由圖1可知，各組隨反油酸濃度的增加細(xì)胞存活率降低，各濃度反油酸組與正常組有顯著差異，低濃度反油酸組(50μmol/L)與高濃度組(400、600μmol/L)有明顯差異(P＜0.05)。當(dāng)反油酸濃度增至600μmol/L時(shí)，活細(xì)胞率降至72.6%，死亡細(xì)胞數(shù)明顯增加?？梢?jiàn)，反油酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有明顯的損傷作用，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。

3 討 論

在日常生活中，人們攝食的反式脂肪酸大部分來(lái)源于部分氫化植物油，但研究表明反式脂肪酸對(duì)人體健康具有不良影響，特別是對(duì)心血管健康的威脅[8]。TFA對(duì)心血管疾病的不良作用研究大多集中在脂質(zhì)效應(yīng)[9]，近年發(fā)現(xiàn)TFA還引起非脂質(zhì)損傷，如促進(jìn)炎癥反應(yīng)的進(jìn)程[10]、加重胰島素抑制[11]、引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷[12]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)TFA的攝入增加了腫瘤壞死因子(TNF)的活性，在調(diào)整所引起的異常血脂的水平后，這一影響只減少了25%?？梢?jiàn)，TFA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響比血脂要重要的多[13]。本研究亦發(fā)現(xiàn)反油酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞正常增殖具有明顯的抑制作用，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用越明顯，當(dāng)反油酸濃度在50μmol/和600μmol/L之間時(shí)，抑制作用與藥物濃度亦呈正相關(guān)，反油酸濃度達(dá)到600μmol/L時(shí)，抑制率可達(dá)到30%(作用48h)。此外，反油酸能明顯增加內(nèi)皮細(xì)胞死亡的數(shù)目，這些均表明TFA對(duì)其具有明顯的毒副作用，能引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)。血管內(nèi)皮細(xì)胞是所有心血管風(fēng)險(xiǎn)因子共同的靶點(diǎn)，Esper等[14]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞能釋放很多具有雙向功能的分子，以抵消血管內(nèi)各種物理和化學(xué)刺激，維持體內(nèi)平衡。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，會(huì)失去維持細(xì)胞平衡的能力，導(dǎo)致各種脂質(zhì)和白細(xì)胞侵入內(nèi)皮，激發(fā)炎癥反應(yīng)，形成脂質(zhì)條紋，進(jìn)而發(fā)展成動(dòng)脈斑塊。而在這一過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增加是脂質(zhì)侵入最早的病理變化[15]。在Kummerow等[16]的研究中，發(fā)現(xiàn)反油酸能引起內(nèi)皮細(xì)胞膜的紊亂。此外，內(nèi)皮功能障礙可致血管收縮異常，血小板黏附、聚集、血栓形成及平滑肌細(xì)胞(VSMC) 增殖，因此血管內(nèi)皮功能障礙對(duì)冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)生、發(fā)展起著始動(dòng)和促進(jìn)作用[17]。因此TFA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響應(yīng)引起足夠重視，但其具體影響機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

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Effect of Oleic Acid on Proliferation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells

YU Hua-hong，LI Xiang-mei，LIU Rong，DENG Ze-yuan*，LI Jing，F(xiàn)AN Ya-wei，HU Jiang-ning
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Objective: To observe the effect of oleic acid on the proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).Methods: HUVECs were treated with oleic acid at concentrations of 50, 100, 200, 400μ mol/L and 600 μ mol/L (in combination with NaOH at a final concentration of 200 μmol/L), respectively. The normal group receiving no treatment was served as the negative control, and the groups treated with NaOH at 200μmol/L alone were used as the positive control. MTT assay and trypan blue exclusion tests were used to evaluate the toxicity of oleic acid on cells. Results: Compared with the normal group, oleic acid significantly inhibited the proliferation of HUVECs. In addition, compared with the group treated with oleic acid at a low concentration (50μ mol/L), an obvious strong inhibition effect on cell proliferation was observed in groups treated with oleic acid at high concentrations (400 μmol/L and 600 μmol/L). However, no significant difference was observed between the positive control and the normal group. Moreover, the amount of viable cells in oleic acid-treated groups was obviously reduced.Conclusion: Oleic acid has obvious side effect on HUVECs in a concentration- and time-dependent manner.

oleic acid；human umbilical vein endothelial cells；MTT assay

O547

A

1002-6630(2010)19-0372-03

2010-06-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30972482)；江西省學(xué)術(shù)帶頭人計(jì)劃項(xiàng)目(2008DD00900)；教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目(20070403002)；江西省青年科學(xué)基金項(xiàng)目(2008GQY0023)

于化泓(1964—)，女，博士研究生，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與人體健康。E-mail：yhh917@163.com

鄧澤元(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)橹舅峒疤烊划a(chǎn)物與人體健康。E-mail：dengzy28@yahoo.com.cn