冰結(jié)構(gòu)蛋白對濕面筋蛋白凍藏穩(wěn)定性的影響

李玲玲，賈春利，黃衛(wèi)寧,*，金亮秀，RAYAS-DUARTE Patricia

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.美國俄克拉荷馬州立大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品與食品研究中心，美國 俄克拉荷馬州 斯蒂爾沃特 74078-6055)

冰結(jié)構(gòu)蛋白對濕面筋蛋白凍藏穩(wěn)定性的影響

李玲玲1，賈春利1，黃衛(wèi)寧1,*，金亮秀1，RAYAS-DUARTE Patricia2

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.美國俄克拉荷馬州立大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品與食品研究中心，美國 俄克拉荷馬州 斯蒂爾沃特 74078-6055)

研究冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白(ISP)對濕面筋蛋白凍藏穩(wěn)定性的影響。采用差示掃描量熱儀、動態(tài)流變儀、掃描電子顯微鏡分別研究空白濕面筋蛋白(未添加ISP)和添加ISP的濕面筋蛋白凍藏不同時間后可凍結(jié)水含量、流變學(xué)特性及超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明：1)隨著凍藏時間延長，濕面筋蛋白可凍結(jié)水含量逐漸增大；凍藏時間相同時，添加ISP濕面筋蛋白的融化焓小于空白濕面筋蛋白。2)濕面筋蛋白的彈性模量、黏性模量和蠕變均隨凍藏時間的延長而降低；凍藏時間相同時，含ISP濕面筋蛋白的蠕變明顯小于空白濕面筋蛋白的相應(yīng)參數(shù)。3)濕面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)經(jīng)過凍藏后，不規(guī)則的孔洞更大，引入ISP后，冰晶形成的不規(guī)則孔洞相對于空白濕面筋蛋白更加細(xì)小和均勻。說明ISP能夠通過減少濕面筋蛋白體系中的可凍結(jié)水含量，抑制冰晶形成和重結(jié)晶，從而減小凍藏過程中濕面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)遭受的破壞。

冰結(jié)構(gòu)蛋白；濕面筋蛋白；可凍結(jié)水；動態(tài)流變學(xué)特性；微觀結(jié)構(gòu)

Abstract：To understand the effect of ice-structuring protein (ISP) from winter wheat on the stability of frozen hydrated gluten,the freezable water content, rheological properties and microstructure of hydrated gluten with and without added ISP frozen for 1, 2, 4, 7 weeks and 9 weeks were determined by differential scanning calorimetry (DSC), rheometer and scanning electron microscopy (SEM), respectively. The results showed that:1) the amount of freezable water in hydrated gluten increased with increasing frozen time, while the addition of ISP could prevent the increase in freezable water content that; 2) both theG＇ andG＇ of hydrated gluten decreased with increasing frozen storage time, while hydrated gluten containing ISP always had higherG＇andG＇ than its blank counterpart at the same frozen storage time points; and 3) less damage of gluten network caused by ice growth and recrystallization was observed for hydrated gluten containing ISP compared with control one at the same frozen storage time points. These results indicate that ISP can prevent hydrated gluten network from ice crystal damage.

Key words：ice-structuring protein；hydrated gluten；freezable water；dynamic rheological properties；microstructure中圖分類號：Q816 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1002-6630(2010)19-0025-04

小麥面筋蛋白是一種黃白色有彈性和延伸性的物質(zhì)，主要由麥醇溶蛋白和麥谷蛋白組成，面筋蛋白吸水后，蛋白分子逐漸水化，分子間相互作用形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[1-5]，賦予面團(tuán)持水性、面團(tuán)黏結(jié)性與黏彈性等流變學(xué)性質(zhì)[6-7]。冷凍是已被廣泛應(yīng)用的一種食品保存方法，但在冷凍貯藏過程中，因溫度波動而引起的重結(jié)晶現(xiàn)象可引起濕面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)物化性質(zhì)的改變，尤其可凍結(jié)水形成冰晶后體積增加，表現(xiàn)出異常的膨脹特性，使得蛋白質(zhì)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到擠壓而破壞。關(guān)于濕面筋蛋白凍融穩(wěn)定性方面的研究是冷凍面團(tuán)及其制品體系基礎(chǔ)研究的重要部分，具有實踐指導(dǎo)意義[8]。

2006年，我國衛(wèi)生部公布冰結(jié)構(gòu)蛋白(ice-structur-ing protein，ISP)即抗凍蛋白是可用于冷凍食品中的新型食品添加劑[9]，可以被多種生物如魚類，植物及昆蟲所合成，以保證它們在低溫下可以生存[10]。ISP有3種主要功能：熱滯活性、修飾冰晶及抑制重結(jié)晶[11-12]。周美玲[13]及潘振興[14]在國內(nèi)率先對ISP在冷凍面團(tuán)體系中的應(yīng)用研究進(jìn)行了報道。關(guān)于ISP在冷凍面團(tuán)及其食品體系中的研究正在成為烘焙與發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域的熱點課題之一。

本實驗采用差示掃描量熱儀研究凍藏時間對濕面筋蛋白中可凍結(jié)水含量的影響；用動態(tài)流變儀研究冷凍濕面筋蛋白的黏彈性模量隨凍藏時間的變化；采用掃描電子顯微鏡觀察不同凍藏時間下冷凍濕面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而分析濕面筋蛋白中冰-水相平衡的變化及冰結(jié)構(gòu)蛋白影響濕面筋蛋白凍藏穩(wěn)定性的作用機制，為冷凍面制品的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

冰結(jié)構(gòu)蛋白(ISP) 加拿大弗蘭伯勒生物冰技術(shù)有限公司；面筋蛋白 山東瑞祥淀粉有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pyris 1差示量熱掃描儀 英國Perkin-Elmer公司；SX-40掃描電子顯微鏡 日本明石公司；冷凍干燥機美國Abconco公司；AR1000動態(tài)流變儀 英國TA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

稱取一定量的小麥面筋蛋白粉與蒸餾水，按質(zhì)量比1:1的比例混合均勻，將制得的濕面筋蛋白用保鮮膜包裹，放在常溫下穩(wěn)定1h，然后切成圓片，用保鮮膜包裹放在－18℃冰箱中。

1.3.2 可凍結(jié)水含量測定

用銦和錫校準(zhǔn)差示掃描量熱儀。用剃刀從冷凍濕面筋蛋白圓片中心部位取10～15mg，密封在小鋁盒中，放入DSC，空氣作參比。在－15℃和5℃各保持5min，從－15℃升溫到5℃，升溫速度為1℃/min。記錄可凍結(jié)水的焓變(ΔH)。

1.3.3 動態(tài)流變學(xué)實驗

測定條件：直徑20mm、偏角1°椎板，溫度25℃，頻率范圍0.01～100rad/s，應(yīng)變量10%，測定貯能模量G′及損耗模量G′隨頻率(0.01～100rad/s)的變化。

1.3.4 冷凍濕面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)觀察

取冷凍濕面筋蛋白樣品在30℃解凍2h后進(jìn)行冷凍干燥。樣品先用2.5%戊二醛固定，0.1mol/L磷酸緩沖液漂洗，再用1%四氧化二鋨固定，0.1mol/L磷酸緩沖液沖洗，用30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度洗脫。用醋酸異戊酯置換出乙醇后，采用臨界點干燥法進(jìn)行干燥，經(jīng)離子濺射噴金后，置于掃描電子顯微鏡下觀察樣品結(jié)構(gòu)。加速電壓為5kV。

2 結(jié)果與分析

2.1 可凍結(jié)水含量研究

面筋蛋白質(zhì)中水分子主要以結(jié)合水、可凍結(jié)結(jié)合水和自由水3種狀態(tài)存在[15]。所謂的可凍結(jié)水主要由自由水和可凍結(jié)結(jié)合水組成；所謂的非凍結(jié)水主要由結(jié)合水和另一部分松散的結(jié)合水組成。凍藏過程中，冰晶是破壞面筋蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要因素之一，而可凍結(jié)水含量決定了面團(tuán)在凍藏過程中冰晶的形成量，可凍結(jié)水越少，面筋的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)保持的越完整?？蓛鼋Y(jié)水(冰)的含量可以通過計算DSC曲線峰值下的面積所測得的熔化焓值ΔH來反映[16-17]。圖1即為本實驗測定的典型冷凍濕面筋蛋白的DSC曲線。

圖1 典型冷凍濕面筋蛋白的DSC曲線Fig.1 Typical DSC spectra of frozen gluten with and without added ISP

由圖1可以看出，冷凍面團(tuán)的冰晶融化溫度范圍大致介于－7～2℃之間，這與宋國勝[18]得到的結(jié)果基本一致。

圖2 濕面筋蛋白中的冰的融化焓Fig.2 Change in ice melting enthalpy in hydrated gluten with and without added ISP during frozen storage

用DSC測定冷凍濕面筋蛋白中可凍結(jié)水(冰)的含量。濕面筋蛋白中冰的融化焓隨凍藏時間的變化如圖2所示。隨凍藏時間的延長，濕面筋蛋白樣品融化焓值均呈增大趨勢，即表明冷凍濕面筋蛋白中可凍結(jié)水量增加?？瞻讟悠吩趦霾貢r間為1周時，冰的融化焓為88.5J/g，比Kontogiorgos等[19]得出的值要小些，這可能是因為面筋蛋白的來源以及面筋和水的比例不一致造成的。凍藏2周后，融化焓值為96J/g，增加了8.4%，而當(dāng)凍藏時間達(dá)到9周時，融化焓達(dá)到112.5J/g，與第1周相比，焓值增加了27.1%。開始時水分的遷移和可凍結(jié)水的增加，可能是因為在較低溫度下濕面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞；當(dāng)凍藏時間為9周時，可凍結(jié)水焓值又有所增加，這可能是因為在長時間凍藏過程中，冰晶的重結(jié)晶效應(yīng)導(dǎo)致濕面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞程度增加，使得水分從網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中離析出來，可凍結(jié)水量增加[20]。

加入冰結(jié)構(gòu)蛋白后，凍藏1周冰的融化焓為83.4J/g，比空白樣品降低了4.9%，而凍藏9周融化焓達(dá)到103.3J/g，比空白樣品降低了8.9%，總的看來，加入ISP后，隨著凍藏時間的增加，冰的融化焓仍是增加的，但是在凍藏時間相同時，含ISP的面筋蛋白冰融化焓值要明顯小于空白樣品，這是因為冰結(jié)構(gòu)蛋白在范德華力、疏水相互作用和氫鍵作用下吸附到面筋蛋白體系中冰核表面，抑制冰核生長即抑制重結(jié)晶，減小了冰晶對濕面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞，從而減少了從網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中離析出的水分。

2.2 流變學(xué)特性變化

運用動態(tài)流變儀對樣品進(jìn)行頻率掃描，研究其彈性模量和黏性模量的變化，即對樣品施加相同的應(yīng)力，研究振蕩頻率對彈性模量和黏性模量的影響。此方法可以在不破壞樣品結(jié)構(gòu)的情況下，直接獲得與樣品的彈性和黏性行為相關(guān)的信息。

圖3 凍藏濕面筋蛋白彈性模量和黏性模量隨頻率的變化Fig.3 Changes inG＇ andG＇＇of hydrated gluten frozen for different weeks with frequency

凍藏時間不同時，濕面筋蛋白彈性模量和黏性模量與頻率之間的關(guān)系如圖3所示。在頻率為 0.1～100rad/s的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描時，濕面筋蛋白的彈性模量和黏性模量均是逐漸增加的，并且后者較前者增加更顯著。其中G′始終大于G′′，因此面筋-水體系仍為黏彈性體系，這與先前報道的一致[21-22]。彈性模量和黏性模量均隨凍藏時間的延長而減小，而前者的減小幅度較大。這些變化可能是由于在低溫條件下，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變或形成的冰晶對面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞而引起的。考慮到小麥面筋中的麥谷蛋白主要提供彈性，而麥膠蛋白主要為面筋提供黏性[21,23]，隨著凍藏時間的延長，G′變化較大，這也說明，在凍藏過程中，形成的冰晶可以更大程度上引起麥谷蛋白的斷裂，進(jìn)而使得彈性模量變化較為顯著。

蠕變是指把一定大小的應(yīng)力施加于黏彈性體時，物體形變(應(yīng)變)隨時間延長而逐漸增加的現(xiàn)象。25℃時，空白面筋蛋白及添加ISP的濕面筋蛋白在不同凍藏時間時的蠕變特性見圖4。

圖4 ISP對凍藏濕面筋蛋白蠕變的影響Fig.4 Effect of added ISP on creep curves of hydrated gluten frozen for different weeks

蠕變曲線分為3個主要的階段：1)瞬時彈性形變：在施加應(yīng)力的-瞬間體系所發(fā)生的瞬時形變，在此階段，如果應(yīng)力除去，體系的形變會立即恢復(fù)；2)延遲彈性形變：緊接著體系的彈性形變開始緩慢增加；3)平衡形變：此時體系的彈性和黏性達(dá)到平衡，形變速率恒定。蠕變實驗中，凍藏4周后面筋蛋白的形變明顯增加，這表明面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞。當(dāng)加入ISP時，面筋體系的形變量明顯減小，表明加入ISP有效的保護(hù)了賦予面筋彈性的組分，即麥谷蛋白。Singh等[24]提出麥谷蛋白大聚體之間的纏繞產(chǎn)生的阻力抵抗變形和減慢滑移速率，纏繞點的數(shù)目決定于蛋白大聚體的長度和相對分子質(zhì)量大小。因凍藏過程中形成的大冰晶可以破壞面筋蛋白之間的纏繞點，進(jìn)而使得面筋蛋白的抗變形能力變差，引入ISP后，因其可以吸附到冰晶表面，有效抑制冰晶的生長和重結(jié)晶，減少對面筋蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，可以提高其抗變形能力。

2.3 微觀結(jié)構(gòu)研究

圖5分別是空白濕面筋蛋白和添加ISP的濕面筋蛋白凍藏1、4、9周后的掃描電鏡顯微照片，圖5A說明空白樣品凍藏1周，便有粒徑小的不規(guī)則空洞出現(xiàn)，說明此時已經(jīng)有冰晶形成，隨著凍藏時間的延長，面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的空洞逐漸變大，可以看到游離的淀粉顆粒存在。由圖5C可以看出空白樣品凍藏9周后，面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的空洞較大，說明重結(jié)晶形成的大冰晶對網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞程度較深。

圖5a為凍藏1周后含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% ISP的濕面筋蛋白，與空白濕蛋白面筋蛋白(圖5A)相比，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中雖然也有空洞出現(xiàn)，但空洞粒徑更小且均勻。凍藏4周后，即使加入ISP，面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的空洞不可避免的變大，面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞，但是遭受破壞的程度明顯小于未加ISP的(圖5b)。當(dāng)凍藏時間延長到9周時，添加ISP在一定程度上降低了濕面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭受破壞(圖5c)。這些結(jié)果說明引入ISP可以顯著抑制凍藏對濕面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞。

冰晶形成以及重結(jié)晶效應(yīng)所產(chǎn)生的大冰晶對面筋網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生機械損傷是面筋網(wǎng)絡(luò)在凍藏過程中受到破壞的最主要原因之一。因ISP可以抑制冰晶形成和重結(jié)晶，使得冷凍濕面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部和外部的可凍結(jié)水能夠形成相對較小且均勻的冰晶，降低對濕面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞程度，從而提高冷凍面制品的品質(zhì)。

圖5 凍藏濕面筋蛋白SEM圖(×600)Fig.5 SEM photographs of hydrated gluten with and without added ISP after different weeks of frozen storage (×600)

3 結(jié) 論

本實驗研究了冰結(jié)構(gòu)蛋白(ISP)對小麥濕面筋蛋白可凍結(jié)水含量、流變學(xué)性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)的影響，得到以下主要結(jié)論：隨凍藏時間的延長，冰晶破壞了面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可凍結(jié)水含量增加，ISP可減少冷凍濕面筋蛋白中可凍結(jié)水的含量，維持凍藏過程中面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的完整性；從流變學(xué)實驗中可以看出，小麥濕面筋蛋白的G′和G′′隨凍藏時間的延長而降低，在蠕變實驗中，小麥濕面筋蛋白的形變隨凍藏時間的延長而增加，添加ISP后可以顯著減小其形變；SEM實驗表明，空白樣品凍藏1周，便有粒徑小的不規(guī)則空洞出現(xiàn)，隨著凍藏時間的延長，面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的空洞逐漸變大。添加ISP后可以抑制凍藏過程對濕面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞。

綜上所述，冰結(jié)構(gòu)蛋白對于提高濕面筋蛋白凍藏穩(wěn)定性有很好的效果，本實驗為ISP作為一種新型的添加劑，在冷凍面團(tuán)及冷凍面制品中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)研究信息。

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Effect of Ice-structuring Protein on the Stability of Frozen Hydrated Gluten

LI Ling-ling1，JIA Chun-li1，HUANG Wei-ning1,*，KIM Yangsoo1，RAYAS-DUARTE Patricia2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, College of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2. Food and Agricultural Products Research Center, Oklahoma State University, Stillwater OK 74078-6055, USA)

2009-12-15

國家自然科學(xué)基金項目(31071595)；美國農(nóng)業(yè)部國際交流與合作項目[A-(86269)]；加拿大農(nóng)業(yè)部國際交流與合作項目(CCSIC-Food-00107)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(燕麥)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項目(nycytz-14)

李玲玲(1983—)，女，碩士研究生，研究方向為谷物與烘焙科學(xué)、功能配料與食品添加劑。E-mail：lilingling1216@163.com

*通信作者：黃衛(wèi)寧(1963—)，男，教授，博士，研究方向為烘焙與發(fā)酵技術(shù)、谷物食品化學(xué)。E-mail：wnhuang@jiangnan.edu.cn