棘孢木霉F2菌株對(duì)三七灰霉病的生物防治作用

蔣 妮， 白丹宇， 宋利沙， 陳乾平， 馮世鑫， 繆劍華

(廣西藥用植物園，廣西南寧 530023)

三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F.H. Chen]別稱田七，具有散瘀止血、消腫定痛等多種功效，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的中藥材，主產(chǎn)云南、廣西等地區(qū)[1-2]。三七性喜溫涼、陰濕的生長環(huán)境，易誘發(fā)根腐病、黑斑病、炭疽病、灰霉病等多種病害，給三七的栽培生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響[3]?；颐共∈侨咴耘噙^程中一種重要的病害，目前的防治方法主要以化學(xué)防治為主[4]，但長期大量使用農(nóng)藥容易造成病原菌產(chǎn)生抗藥性、藥材農(nóng)藥殘留過高、土壤環(huán)境污染等問題，而生物防治是一條控制植物病害、減少化學(xué)農(nóng)藥污染的有效途徑[5]。因此，筆者所在項(xiàng)目組開展了利用拮抗微生物防治三七病害的研究工作，從健康三七根際土壤中分離到拮抗木霉菌株——棘孢木霉菌株(標(biāo)注為F2)，并對(duì)三七黑斑病病菌、炭疽病病菌、根腐病病菌等進(jìn)行生長抑制試驗(yàn)，結(jié)果表明，棘孢木霉F2菌株對(duì)三七黑斑病病菌、炭疽病病菌、根腐病病菌的抑菌率較高，分別為88.67%、91.00%、75.76%[6]。在此基礎(chǔ)上，筆者所在項(xiàng)目組開展棘孢木霉F2菌株對(duì)三七另一個(gè)重要病害——灰霉病的生物防治研究工作，從菌體對(duì)病原菌菌絲生長、孢子萌發(fā)，以及菌體代謝產(chǎn)物對(duì)病害的預(yù)防和治療等多方面開展系統(tǒng)的研究，以期為后期開發(fā)及田間應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株來源

拮抗菌：棘孢木霉(Trichodermaasperellum)F2菌株，從健康三七植株根際土壤中分離得到；致病菌：三七灰霉病病原菌(BotrytiscinereaPers.ex Fr.)、羅漢果斑枯病病原菌(Stagonosporopsiscucurbitacearum)、苦玄參褐斑病病原菌(Alternariaporri)、艾納香條斑病病原菌(Phomaherbarum)、廣西莪術(shù)葉斑病病原菌(Phomopsislongicolla)、草豆蔻葉斑病病原菌(Nefusicoccumparvum)，共6種，均為廣西藥用植物園藥用植物病害研究課題組分離純化得到。

1.2 棘孢木霉F2菌株無菌發(fā)酵液的制備

將棘孢木霉F2菌株在PDA培養(yǎng)基(200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，15～20 g瓊脂，1 000 mL水，pH值自然)上活化后，挑取菌絲塊接入PDB培養(yǎng)基(在PDA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上去掉瓊脂)(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn))中，于25 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)10 d得發(fā)酵液，并經(jīng) 10 000 r/min 離心20 min，去除菌體，取上清液待用。

1.3 棘孢木霉F2菌株對(duì)6種藥用植物病原菌的抑制作用及與三七灰霉病病菌的生長競(jìng)爭(zhēng)作用

將棘孢木霉F2菌株及其他6種致病菌分別接種至PDA培養(yǎng)基，于25 ℃恒溫條件下活化培養(yǎng)7 d，用無菌打孔器分別在菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅，接種至同一PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，2個(gè)菌餅距離為5 cm，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以只接種病原菌的平板為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。培養(yǎng)7 d后，測(cè)量各處理的菌落直徑，并按照公式計(jì)算抑菌率。抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%。

用無菌打孔器分別在活化的棘孢木霉F2菌株及三七灰霉病病菌菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅，接種至同一PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，2個(gè)菌餅距離為5 cm，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以只接種灰霉病病菌的平板為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。每天觀察記錄處理及對(duì)照的菌落半徑，共觀察記錄10 d，根據(jù)結(jié)果繪制對(duì)峙培養(yǎng)曲線圖。

1.4 棘孢木霉F2發(fā)酵液對(duì)三七灰霉病病菌絲生長的影響

采用菌絲生長速率法測(cè)定：用50 ℃ PDA培養(yǎng)基將棘孢木霉F2菌株的發(fā)酵液原液分別稀釋5、10、20、40倍，充分混勻后倒入直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中制成帶藥平板，每個(gè)處理重復(fù)3次。以無菌水加入PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照。將培養(yǎng)好的直徑為5 mm的三七灰霉病病原菌接種至處理及對(duì)照的平板中央，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24、48、72、96、120 h后用直尺測(cè)量菌落直徑，按以下公式計(jì)算抑制率：菌絲生長抑制率=(對(duì)照菌落增長直徑-藥劑處理菌落增長直徑)/對(duì)照菌落增長直徑×100%。

1.5 棘孢木霉F2發(fā)酵液對(duì)三七灰霉病孢子萌發(fā)的影響

采用懸滴法測(cè)定：將三七灰霉病病菌培養(yǎng)一定時(shí)間后使其產(chǎn)孢，加無菌水配制成10倍物鏡下每個(gè)視野50～60個(gè)孢子的孢子懸浮液。用孢子懸浮液將棘孢木霉F2菌株的發(fā)酵液原液分別稀釋5、10、20、40倍，以孢子懸浮液加入無菌水作為對(duì)照(分別記為CK1、CK2、CK3、CK4)，用載玻片懸滴法于 25 ℃ 恒溫條件下培養(yǎng)72 h后鏡檢孢子萌發(fā)的情況，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。每個(gè)處理3次重復(fù)。孢子萌發(fā)抑制率=(對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率)/對(duì)照孢子萌發(fā)率×100%。

1.6 棘孢木霉F2發(fā)酵液對(duì)三七灰霉病的防治試驗(yàn)

1.6.1 棘孢木霉F2發(fā)酵液對(duì)離體三七葉片灰霉病的防治作用 用無菌水將棘孢木霉F2菌株的發(fā)酵液分別稀釋5、10、15、20、40倍，將健康的三七葉片分別浸泡到稀釋的發(fā)酵液中，15 min后取出，自然晾干后立即接種直徑為3 mm的灰霉病病菌菌餅，置于培養(yǎng)皿中早晚保濕，25 ℃條件下培養(yǎng)7 d，第8天調(diào)查病斑直徑，每個(gè)處理10張葉片，重復(fù)3次。

1.6.2 棘孢木霉F2菌株無菌發(fā)酵液對(duì)盆栽三七灰霉病的預(yù)防作用 取健康的2年生盆栽三七植株，1株/盆，試驗(yàn)處理30盆，對(duì)照30盆，共60盆。定植30 d后，使用清水稀釋5倍的棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液進(jìn)行防治試驗(yàn)，具體方法：澆灌根部和噴灑葉片同時(shí)進(jìn)行，用100 mL/株棘孢木霉F2菌株發(fā)酵稀釋液灌根，10 d 1次，連續(xù)5次；20 mL/株棘孢木霉F2菌株發(fā)酵稀釋液噴灑葉片正反面，5 d 1次，連續(xù)10次。施用棘孢木霉F2菌株發(fā)酵稀釋液結(jié)束后接種灰霉病病菌，設(shè)計(jì)2個(gè)接種時(shí)間，結(jié)束后立即接種病原菌(處理1，15盆)，結(jié)束7 d后接種病原菌(處理2，15盆)，每株三七隨機(jī)取3張葉片分別接種直徑為3 mm的灰霉病病菌菌餅。以相同劑量的清水灌根及噴曬葉片作為對(duì)照(分別記為對(duì)照1、對(duì)照2)，對(duì)照病原菌的接種時(shí)間、接種量、重復(fù)次數(shù)與試驗(yàn)處理相同。接種完成后置于25 ℃人工氣候室中保濕培養(yǎng)7、15 d后調(diào)查病斑大小，計(jì)算相對(duì)防效。

1.6.3 棘孢木霉F2菌株無菌發(fā)酵液對(duì)盆栽三七灰霉病的防治作用 取健康的2年生盆栽三七植株，1株/盆，試驗(yàn)處理30盆，對(duì)照30盆，共60盆。定植30 d后，每株三七隨機(jī)取3張葉片，分別接種1個(gè)直徑為3 mm的灰霉病病菌菌餅，置于25 ℃人工氣候室中保濕培養(yǎng)7 d發(fā)病后調(diào)查病斑大小，隨后噴霧棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液稀釋5倍，20 mL/株連續(xù)噴10次，每次間隔5 d，以噴施相同劑量的清水最為對(duì)照，用藥結(jié)束5 d后調(diào)查葉片病斑大小，計(jì)算相對(duì)防效。

上述試驗(yàn)除盆栽試驗(yàn)是在廣西藥用植物園科研大棚中進(jìn)行外，其他試驗(yàn)均是在廣西藥用植物園植病研究室進(jìn)行，試驗(yàn)時(shí)間為2016年12月至2017年10月。

2 結(jié)果與分析

2.1 棘孢木霉F2菌株對(duì)6種藥用植物病原菌的抑制效果及與三七灰霉病病菌的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系

由表1可知，通過平板對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)，棘孢木霉F2菌株對(duì)供試的6種藥用植物病原菌均有較強(qiáng)的抑制作用，其中對(duì)三七灰霉病、艾納香條斑病、苦玄參褐斑病、廣西莪術(shù)葉斑病的病原菌的抑制率分別達(dá)100.00%、98.55%、98.00%、98.00%；對(duì)草豆蔻葉斑病病菌、羅漢果斑枯病病原菌的抑制率分別為94.46%、92.38%。在試驗(yàn)過程中觀察發(fā)現(xiàn)，與病原菌同時(shí)培養(yǎng)的木霉菌菌絲生長較快，能迅速占領(lǐng)生長空間，將病原菌包圍，使其生長受到抑制，說明棘孢木霉F2菌株與病原菌之間存在生長競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。由圖1可知，對(duì)峙培養(yǎng)第5天，灰霉菌和棘孢木霉F2菌株的菌落半徑分別為20、30 mm，此時(shí)兩菌交界；對(duì)峙培養(yǎng)第6天，棘孢木霉F2菌株繼續(xù)生長擴(kuò)展，并逐漸將灰霉菌菌落包圍，灰霉菌菌落停止生長并逐漸萎縮；培養(yǎng)至第10天，灰霉菌菌落半徑縮至2 mm，最后棘孢木霉F2菌株全部將灰霉菌覆蓋，灰霉菌落完全萎縮。

表1 棘孢木霉F2菌株對(duì)6種藥用植物病原菌菌絲的抑制效果

注：同列數(shù)據(jù)后小寫英文字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

2.2 棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液對(duì)三七灰霉病菌絲生長的影響

由表2可知，棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液稀釋5、10、20、40倍對(duì)三七灰霉病菌絲均有不同程度的抑制作用，培養(yǎng) 24～72 h 內(nèi)，隨著作用時(shí)間延長，抑制率隨之升高，并在培養(yǎng) 96 h 后，各處理對(duì)病原菌的抑制率達(dá)到最大值，并在120 h內(nèi)保持不變。棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液稀釋5倍，作用96 h，對(duì)三七灰霉病菌絲的生長抑制率可達(dá)92.6%；稀釋10倍，作用 96 h，抑制率可達(dá)88.8%；稀釋20倍，隨著濃度的降低，作用96 h后抑制率降低為75.4%；稀釋40倍，作用96 h后，抑制率降低至為65.2%。結(jié)果表明，較高濃度(稀釋5～10倍)的棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液對(duì)三七灰霉病菌絲具有較強(qiáng)抑制作用。

表2 棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液對(duì)三七灰霉病病菌絲生長的抑制作用

2.3 棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液對(duì)三七灰霉病孢子萌發(fā)的影響

由表3可知，棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液稀釋5、10、20、40倍對(duì)三七灰霉病孢子的萌發(fā)均有一定的抑制作用，其中稀釋5倍，處理72 h后孢子萌發(fā)抑制率為82.6%，效果最佳，而稀釋至40倍，孢子萌發(fā)抑制率為34.5%，效果最弱。在試驗(yàn)過程中還觀察到，有部分孢子雖然萌發(fā)，但出現(xiàn)畸形現(xiàn)象，后續(xù)也難進(jìn)一步發(fā)育。

表3 棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液對(duì)三七灰霉病孢子萌發(fā)的抑制效果

2.4 棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液對(duì)離體三七葉片灰霉病的防治作用

由表4可知，棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液對(duì)離體三七葉片灰霉病有一定的防治效果，其中發(fā)酵液稀釋5、10倍時(shí)，防治效果較好，相對(duì)防效分別為74.0%、70.3%，顯著高于其他3個(gè)處理濃度。而隨著濃度的降低防效也隨之降低，當(dāng)發(fā)酵液稀釋至40倍時(shí)，相對(duì)防效<50%。

表4 棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液對(duì)離體三七葉片灰霉病的防治效果

2.5 棘孢木霉F2菌株無菌發(fā)酵液對(duì)盆栽三七灰霉病的防治

2.5.1 棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液對(duì)三七灰霉病的預(yù)防作用 三七灰霉病發(fā)病前通過用棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液灌根并結(jié)合葉面噴施進(jìn)行預(yù)防試驗(yàn)，由表5可知，病害的發(fā)生得到較好的抑制。處理1，接種病原菌7、15 d后相對(duì)防效為分別為83.4%、81.7%；處理2，接種病原菌7、15 d后相對(duì)防效為分別為80.3%、78.9%。處理1是在預(yù)防措施結(jié)束后立即接種病原菌，處理2是在預(yù)防措施結(jié)束7 d后才接種病原菌，從相對(duì)防效試驗(yàn)結(jié)果來看，二者差異并不顯著?？梢姡吣久笷2菌株發(fā)酵液對(duì)三七灰霉病的預(yù)防作用具有一定的持效性，在使用7 d后還能維持較好的防效；另一方面，還有可能是對(duì)健康三七提前灌根及葉片噴施棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液，可誘導(dǎo)三七植株對(duì)灰霉病產(chǎn)生抗性，因此即使是停止使用一段時(shí)間，對(duì)灰霉病病菌的侵染仍具有較好的抑制作用。

表5 棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液對(duì)盆栽三七灰霉病的預(yù)防效果

2.5.2 棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液對(duì)盆栽三七灰霉病的防治作用 由表6可知，盆栽三七灰霉病發(fā)生后，噴施棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液可以起到一定的防治作用，相對(duì)防效為52.6%，但明顯低于預(yù)防的效果。可見，棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液對(duì)三七灰霉病的防治應(yīng)采用預(yù)防措施，即在病害發(fā)生前，可以通過灌根并結(jié)合葉片噴施進(jìn)行預(yù)防，可起到較好的防治作用。

表6 棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液對(duì)盆栽三七灰霉病的治療效果

3 結(jié)論與討論

木霉屬真菌是迄今為止用于防治植物病害的生防菌中研究、利用最多的植物病原拮抗真菌，常見的拮抗植物病原菌的木霉屬真菌有哈茨木霉、綠色木霉、鉤狀木霉、長枝木霉、康氏木霉、綠粘帚霉等[7]。棘孢木霉(T.asperellum)是2005年才在我國有記錄的木霉菌菌種[8]，雖然研究剛起步，但多項(xiàng)研究表明棘孢木霉是重要的生物防治菌，通過競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用、抗生作用、誘導(dǎo)植物抗病性、促進(jìn)植物生長、協(xié)同拮抗等機(jī)制防治植物病害[9]。

競(jìng)爭(zhēng)作用是生防菌發(fā)揮作用的重要機(jī)制之一，Chen等認(rèn)為當(dāng)一種生防菌能夠與病原菌或其他微生物有效競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位點(diǎn)和營養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，它才能夠在根際微生態(tài)區(qū)系中占有相當(dāng)?shù)谋壤?，這也是其能否在田間取得理想防效的關(guān)鍵[10]。本試驗(yàn)中供試的生防菌——棘孢木霉F2菌株是從健康的三七根系土壤中分離篩選獲得。對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，棘孢木霉F2菌株與三七灰霉病病菌等6種藥用植物病原菌共同培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的空間競(jìng)爭(zhēng)力，能夠?qū)⒉≡杆俑采w，競(jìng)爭(zhēng)到有限的營養(yǎng)，從而抑制了病原菌的生長。棘孢木霉F2菌株對(duì)三七灰霉病病菌更是表現(xiàn)出極強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)性，抑制率達(dá)100.00%，極具生防潛力。

木霉屬中很多種真菌均能夠分泌出抗菌物質(zhì)，從而抑制其他生物的生長[11]。本研究結(jié)果表明，棘孢木霉F2菌株的發(fā)酵液能夠較好地抑制三七灰霉病病原菌菌絲的生長以及病原孢子的萌發(fā)；對(duì)離體三七葉片灰霉病的防效可達(dá)74.00%?？梢?，棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液中可能含有對(duì)三七灰霉病病原菌菌絲及孢子有抑制活性的代謝產(chǎn)物，可進(jìn)一步研究開發(fā)。

木霉屬真菌還有一個(gè)重要的抗病機(jī)制，能誘導(dǎo)植物抗病[12]。魏林等用哈茨木霉T2-16菌株的發(fā)酵代謝產(chǎn)物對(duì)豇豆種子進(jìn)行浸泡處理，結(jié)果降低了豇豆枯萎病的發(fā)病率，使豇豆對(duì)枯萎病產(chǎn)生了抗性[13]。盆栽防治試驗(yàn)結(jié)果表明，在發(fā)病前連續(xù)一段時(shí)間內(nèi)采用棘孢木霉F2菌株發(fā)酵液灌根并結(jié)合葉片噴施，對(duì)三七灰霉病的相對(duì)防效可達(dá)83.4%；而在病害發(fā)生后才使用，相對(duì)防效為52.6%?？梢娂吣久笷2菌株發(fā)酵液對(duì)三七灰霉病的預(yù)防作用要強(qiáng)于治療作用。綜合上述木霉屬真菌誘導(dǎo)抗性的研究結(jié)果，分析其原因之一有可能是棘孢木霉F2發(fā)酵液可以誘導(dǎo)三七植株對(duì)灰霉病產(chǎn)生抗性，還須進(jìn)一步研究論證。