葡萄籽原花青素對肺癌放射增敏作用的實驗研究

張小芳，趙健雄

（1.蘭州市第一人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州大學中西醫(yī)結合研究所，甘肅 蘭州 730050）

葡萄籽原花青素對肺癌放射增敏作用的實驗研究

張小芳1，趙健雄2

（1.蘭州市第一人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州大學中西醫(yī)結合研究所，甘肅 蘭州 730050）

目的 研究葡萄籽原花青素提取物對肺癌SPC-A-1細胞X射線放療的增敏作用。方法 應用MTT法和集落形成法研究葡萄籽原花青素放療增敏效應，單因素方差分析確定增敏劑量和增敏作用，單擊多靶模型曲線擬合計算增敏比及相關參數(shù)。結果 MTT法檢測結果表明，單獨應用葡萄籽原花青素對SPC-A-1細胞抑制作用較弱；細胞藥物處理后對X射線的敏感性增強，單因素方差分析表明藥物和X射線有協(xié)同作用（P＜0.05），藥物劑量為100μg/ml時表現(xiàn)出增敏效應。集落形成法結果表明，藥物劑量為100μg/ml對X射線增敏作用明顯，增敏比為2.56。結論 葡萄籽原花青素對肺癌SPC-A-1細胞有顯著的放療增敏作用。

葡萄籽原花青素；肺癌SPC-A-1細胞；實驗研究

原花青素（PC）是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素縮合而成的一大類酚類化合物，廣泛分布于植物界，許多食品和飲料中都含有豐富的原花青素。1970年，原花青素首次從葡萄籽中提取成功。原花青素有非常強大的抗氧化和清除自由基的能力。據(jù)報道，其在體內抗氧化能力是VE的50倍、VC的20倍；具有多種藥理作用，如抗炎、抗腫瘤、保護心血管系統(tǒng)、抗衰老等[1]。其中葡萄籽原花青素提取物（GSPE）為最早提取成功的原花青素，對其研究也最為廣泛，由于其安全（口服急性毒性LD50＞5 000 mg/kg，急性皮膚毒性2 000 mg/kg)、高效和高生物利用率等，使原花青素在食品、醫(yī)藥、化妝品等領域得到廣泛應用[2]。

據(jù)報道，原花青素對皮膚癌、口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、結腸癌等都有一定的預防或治療作用，但單獨應用療效并不理想?；诖?，我們研究了GSPE對于肺癌的放療增敏作用，為擴大GSPE的臨床應用和肺癌的放射增敏治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

GSPE：天津市尖峰天然產物研究開發(fā)有限公司產品；小牛血清:杭州四季青公司產品；RMPI-1640培養(yǎng)基干粉:GIBCO公司產品；噻唑藍（MTT）:SIGMA公司產品。

1.2 儀器

倒置相差顯微鏡:OLYMPUS IX70,OLYMPUS公司產品;BIO-RAD iMark自動酶標儀（日本）。1.3方法

1.3.1 MTT法檢測GSPE對X射線增敏作用 取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶消化，吹打均勻，計數(shù)，稀釋至5×104個/毫升，細胞懸液以每孔90 μl接種至96孔板，培養(yǎng)貼壁24h后加藥處理。實驗設陰性對照組、空白對照組、原花青素各劑量組、原花青素各劑量顏色對照組，每孔90 μl加藥，每個濃度設3個復孔。陰性對照組和空白對照組加pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后進行X射線照射。

照射參數(shù)：6MeV直線加速器下，在2.5Gy/min時以不同劑量X射線照射，源皮距為100cm。照射結束后繼續(xù)培養(yǎng)4d，取出每孔中加入MTT 10μl（5mg/ml），再培養(yǎng)4h后，吸去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜（DMSO）150μl，震蕩 10min，酶標儀單波長 490nm測定每孔吸光度值 (OD)。按下列公式計算抑制率（IR

1.3.2 集落形成法檢測GSPE對X射線照射后細胞增殖的抑制作用 取對數(shù)生長期的各組細胞，0.25%胰酶消化制備細胞懸液。60mm培養(yǎng)皿中分別按藥物劑量不同種入不同數(shù)量的細胞。細胞貼壁后，分別給予不同劑量藥物（0、25、100、200μg/ml）作用24h，再給予0、1、5、9Gy劑量X射線照射，每組3個復孔。照射后置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～10d。取出后倒去培養(yǎng)液，PBS漂洗2次，用醋酸甲醇固定，姬姆薩染色10min,在解剖鏡下計數(shù)直徑大于50mm（或含50個細胞以上）的細胞克隆。按以下公式計算存活分數(shù)：存活率=（某劑量的集落形成數(shù)/某劑量下種植的細胞數(shù)）×100%

1.4 統(tǒng)計方法

MTT法各組吸光度值差異采用單因素方差分析，SPSS 13.0統(tǒng)計軟件錄入數(shù)據(jù)。集落形成存活率分析采用單擊多靶模型曲線擬合，Graphpad Prism 5.0軟件錄入數(shù)據(jù)。

2 結果

2.1 MTT法檢測GSPE增敏殺傷作用

檢測不同藥物濃度在不同劑量X射線照射下的增敏作用，抑制率結果見表1。對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，結果表明，X射線和GSPE均可顯著影響腫瘤細胞的存活率，并且二者之間存在協(xié)同關系，有顯著性差異（P＜0.01），但對細胞殺傷的作用不同。為進一步分析二者之間的相關性，固定其中一個因素水平即藥物劑量，研究各劑量藥物的增敏作用。結果表明，在藥物劑量小于25μg/ml時，藥物對腫瘤細胞沒有殺傷作用，藥物劑量也無增敏作用；藥物劑量為50μg/ml時，藥物對腫瘤細胞無殺傷作用，但有增敏作用；藥物劑量為100μg/ml時，藥物對腫瘤細胞有殺傷作用，同時也有增敏作用；藥物劑量大于200μg/ml時，藥物對腫瘤細胞的殺傷作用強于X射線，表現(xiàn)為協(xié)同作用。所以藥物劑量50～100μg/ml可以認為是GSPE的有效增敏濃度。

2.2 集落形成法研究藥物和X射線對肺癌細胞的增殖抑制作用腫瘤細胞具有無限增殖的潛力，但以藥物干預或X射線照射后會使部分未立即死亡細胞在繼續(xù)分裂數(shù)代后停止增殖。集落形成法觀察細胞的增殖抑制作用結果見表2。以“多靶單擊模型”進行曲線擬合，“多靶單擊模型”方程：SF=1-（1-e-D/D0）N,Dq=D0lnN，其中SF為存活分數(shù)，D為放射劑量（Gy），D0代表平均致死量，Dq代表準域劑量，N為外推數(shù)，結果見表3。

3 討論

表1 MTT法檢測GSPE合用X射線對SPC-A-1細胞的抑制率（±s）

表1 MTT法檢測GSPE合用X射線對SPC-A-1細胞的抑制率（±s）

藥物劑量（μg/ml）X射線劑量（Gy）0 1 3 5 7 9 12.5 25 50 100 200 400 800 0.00±0.35 4.51±0.05 7.57±1.22 24.31±7.53 44.58±2.27 51.57±0.51 55.18±1.24 0.00±2.46 3.32±4.69 14.10±1.26 37.37±2.71 44.68±1.61 54.75±1.77 57.93±2.33 0.00±2.07 2.29±3.80 10.66±2.32 40.48±2.35 53.46±1.73 67.50±1.33 68.42±0.18 0.00±3.44 5.46±1.09 13.76±9.98 35.35±6.02 58.04±1.25 68.41±1.31 71.25±0.03 4.50± 6.22 11.36± 0.79 21.82±11.30 45.09± 3.91 77.47± 0.14 86.29± 2.73 87.90± 1.07 17.36±0.26 25.06±0.05 41.38±1.05 56.55±2.20 75.50±0.31 83.01±0.16 83.05±0.63

表2 集落形成法測定藥物和X射線對肺癌細胞的抑制率

表3 100μg/mlGSPE劑量增敏曲線分析

惡性腫瘤是危害人類生命和健康的一種嚴重疾病，其防治已成為世界性的保健與醫(yī)學問題。其中癌癥的放射治療方法越來越受到人們的重視，同時放射治療也是肺癌的主要治療手段。但放射治療不可避免地存在放射抗拒，也是影響放療治療劑量的主要因素之一。20世紀60年代初，開展了對放射增敏劑的研究，能夠對乏氧細胞有特定的細胞毒性作用，而對有氧的正常組織無毒性，我國自主研發(fā)的新藥甘氨雙唑鈉對鼻咽癌、食管癌均有較好療效，安全性較高，但部分Ⅱ期臨床試驗結果并不令人滿意，抑制腫瘤的總有效率與單用放療無顯著性差異，同時能否降低放射劑量值得商榷。因此，減輕和預防放射性肺損傷的發(fā)生，對提高患者的生活質量和預后具有重要意義。近年來的研究顯示，原花青素不僅可抑制皮膚癌、口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、結腸癌等多種腫瘤細胞的生長，誘導多種腫瘤細胞凋亡[3]，而且可以拮抗化療藥物對正常細胞的毒性作用[4]。有學者研究發(fā)現(xiàn)，原花青素對肺癌有治療作用，對肺癌細胞和大鼠多臟器癌癥模型的肺癌均有較好的治療和預防作用，因此，本實驗設計研究GSPE的放療增敏作用。實驗結果表明，GSPE對肺癌SPC-A-1細胞有較好的放療增敏作用，增敏劑量在50～100μg/ml之間，低于該劑量增敏效果不顯著。在增敏劑量下對單獨X射線照射和藥物作用后X射線照射細胞存活分數(shù)進行曲線擬合，結果表明，GSPE對X射線有顯著的增敏作用，藥物作用后D0值降低，表明細胞對X射線敏感性增加；Dq代表準域劑量，它反映肩區(qū)的大小，表明細胞亞致死損傷修復能力。藥物作用后，Dq變小，說明細胞修復亞致死損傷的能力變弱；N值減小則細胞在低劑量區(qū)時對亞致死損傷的耐受性降低，增敏比為2.56。本實驗為GSPE改善肺癌放療抵抗的臨床應用提供了依據(jù)。但是GSPE對肺癌SPC-A-1細胞的增敏機理尚不明確，有待進一步研究。

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R979.1

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1671-1246（2010）05-0091-02