• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    雙重PCR方法檢測沙門氏菌和空腸彎曲菌

    2010-10-19 05:25:24唐善虎陳進(jìn)會岑璐伽
    食品科學(xué) 2010年22期
    關(guān)鍵詞:檢測方法

    陳 諾,唐善虎,*,陳進(jìn)會,岑璐伽,李 雪,龍 虎

    (1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川 成都 610041;2.東莞出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東 東莞 523072)

    雙重PCR方法檢測沙門氏菌和空腸彎曲菌

    陳 諾1,唐善虎1,*,陳進(jìn)會2,岑璐伽1,李 雪1,龍 虎1

    (1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川 成都 610041;2.東莞出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東 東莞 523072)

    為建立能夠同時檢測食品中沙門氏菌和空腸彎曲菌的雙重PCR方法。采用沙門氏菌鞭毛基因fimY和空腸彎曲菌馬尿酸酶基因hipO設(shè)計(jì)特異性引物,并對影響PCR擴(kuò)增的主要因素——引物濃度、退火溫度、Mg2+濃度因素進(jìn)行優(yōu)化,比較單一PCR和雙重PCR的檢測效果。結(jié)果表明:采用單一PCR法檢測沙門氏菌和空腸彎曲菌時,靈敏度分別可達(dá)到3.98pg和4.05pg;而采用雙重PCR檢測時,靈敏度較單一PCR法有所下降,沙門氏菌和空腸彎曲菌檢出限量分別為398pg和40.5pg。本研究建立的特異性強(qiáng)和靈敏度高的雙重PCR檢測方法,可為實(shí)現(xiàn)食品中沙門氏菌和空腸彎曲菌的同時檢測提供新方法。

    沙門氏菌;空腸彎曲菌;雙重PCR;檢測

    Abstract:A rapid assay for simultaneous detection ofSalmonella sppandCampylobacter jejuniin food was developed. The primers were designed based on thefimYgene ofSalmonellaspp andhipOgene ofCampylobacter jejuni. Annealing temperatures,Mg2+concentrations, and primer concentrations were optimized. The detection limit was 3.98 pg forSalmonellaspp and 4.05 pg forCampylobacter jejuniusing the single PCR method. However, the detection limit of the duplex PCR method was significantly higher, which was 398 pg, 40.5 pg forSalmonellaspp andCampylobacter jejuni, respectively. In this study, a duplex PCR with high specificity and sensitivity was developed and it would provide useful information for the simultaneous detection ofSalmonellaspp andCampylobacter jejuniin food.

    Key words:Salmonellaspp;Campylobacter jejuni;Duplex PCR;Detection

    沙門氏菌和空腸彎曲菌是常見的重要食源性致病菌,常污染肉、乳和禽等動物性食品。污染的食品引起腹瀉、嘔吐等急性腸胃炎癥狀,嚴(yán)重的可引起死亡[1]。此外,空腸彎曲菌的感染與人的格林-巴氏綜合癥等具有自身免疫特性的疾病有關(guān)[2]。

    對這兩種致病菌的檢測通常采取傳統(tǒng)的方法,先選擇性增菌,然后作生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定,大約需要3~14d獲得檢測結(jié)果。由于沙門氏菌血清型繁多、污染食品時數(shù)量少,并且易受食品成分及食品深加工等影響,若采用常規(guī)方法檢測沙門氏菌難度較大,容易出現(xiàn)錯檢和漏檢。而對空腸彎曲菌的檢測方法,普遍采用快速馬尿酸酶試驗(yàn)[3]。由于空腸彎曲菌分類復(fù)雜、生長條件苛刻、生化檢測不可靠,傳統(tǒng)方法都存在著不同程度的假陰性率、假陽性率現(xiàn)象[4]。采用多重PCR技術(shù)可以很好地解決這些問題,多重PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便和成本低等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于沙門氏菌和空腸彎曲菌的檢測。在沙門氏菌檢測時,采用的靶點(diǎn)主要有invA、fimA、stn、hilA等基因[5],而空腸彎曲菌檢測的基因主要有mapA、hipO和ceuE等基因[3],并且大多數(shù)研究主要針對單個菌進(jìn)行的,尚未見使用雙重PCR同時檢測食品中沙門氏菌和空腸彎曲菌的研究報(bào)道。因此,本研究以沙門氏菌保守的鞭毛基因fimY和空腸彎曲菌馬尿酸酶基因hipO為目的基因設(shè)計(jì)特異性引物,建立同時能夠檢測出沙門氏菌和空腸彎曲菌的雙重PCR方法,并通過優(yōu)化雙重PCR的條件提高雙重PCR檢測的靈敏度。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑與儀器

    沙門氏菌C79-13、46株沙門氏菌初步分離菌株、空腸彎曲菌ATCC33560、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922由本實(shí)驗(yàn)室保存,沙門氏菌、志賀氏菌由本實(shí)驗(yàn)室分離保存,單核細(xì)胞增生性李斯特菌由東莞出入境檢驗(yàn)檢疫局惠贈。沙門氏菌、空腸彎曲菌培養(yǎng)基配制及增菌參考國標(biāo)GB/T 4789.4—2008[6]和GB/T 4789.9—2008[7],其余菌株均接種營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)18h備用。

    TaqDNA聚合酶(5U/μL)、10×PCR Buffer(Mg2+free)、MgCl2(25mmol/L)、dNTP Mixture(各 2.5mmol/L)、100bp DNA ladder Marker 大連寶生物工程有限公司;GOLD-VIEWTM染料和瓊脂糖 上海賽百盛基因技術(shù)有限公司。

    PCR擴(kuò)增儀 Eppendorf公司;核酸蛋白檢測儀Beckman公司;改良Skirrow氏瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 模板DNA制備

    取沙門氏菌LB增菌液進(jìn)行10倍倍比稀釋,取10-4~10-7四個稀釋度菌液涂板,37℃培養(yǎng)24h后平板計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)原始菌液濃度。取空腸彎曲菌布氏肉湯培養(yǎng)液,稀釋同沙門氏菌稀釋,涂改良Skirrow氏血平板,42℃微需氧條件下培養(yǎng)24h后,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。原始菌液中沙門氏菌濃度為1.27×107CFU/mL、空腸彎曲菌濃度為2.12×106CFU/mL。參考黃金林等[8]報(bào)道的方法提取細(xì)菌基因組D NA,并利用核酸蛋白測定儀測定沙門氏菌DNA質(zhì)量濃度為39.81μg/mL、空腸彎曲菌的質(zhì)量濃度為 40.50μg/mL。

    1.2.2 引物設(shè)計(jì)

    根據(jù)沙門氏菌fimY基因、空腸彎曲菌hipO基因序列,用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

    表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物Table 1 Primer sequences and amplified products

    1.2.3 單基因PCR擴(kuò)增及特異性分析

    對沙門氏菌C79-13、空腸彎曲菌ATCC33560菌株的基因組DNA分別進(jìn)行單基因擴(kuò)增。擴(kuò)增體系[9]為:10×PCR Buffer 2.5μL、Mg2+1.5mmol/L、dNTP Mixture 200μmol/L,上下游引物各0.4μmol/L、TaqDNA聚合酶1U、模板DNA 1μL,加滅菌去離子水至25μL。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s共35個循環(huán),最后72℃ 5min。取6μL PCR產(chǎn)物經(jīng)GOLD-VIEWTM染色,于100V電壓下進(jìn)行30g/L瓊脂糖凝膠電泳40min檢測。

    1.2.4 雙重PCR擴(kuò)增體系

    擴(kuò)增體系為:10×PCR Buffer 2.5μL、Mg2+1.5mmol/L、dNTP Mixture 200μmol/L,兩對上下游引物各0.4μmol/L、TaqDNA聚合酶1U、兩種模板DNA各1μL,加滅菌去離子水補(bǔ)齊25μL,擴(kuò)增條件同1.2.3節(jié)。

    1.2.5 雙重PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化

    分別對影響PCR擴(kuò)增的主要條件引物濃度、退火溫度、Mg2+濃度。確定最佳PCR反應(yīng)體系。

    1.2.6 雙重PCR特異性與靈敏度分析

    取沙門氏菌、空腸彎曲菌、志賀氏菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、用優(yōu)化好的雙重PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將已經(jīng)測定濃度的沙門氏菌、空腸彎曲菌DNA模板分別作100~10-7梯度稀釋,取不同稀釋度的模板進(jìn)行單基因PCR擴(kuò)增,取相同稀釋度的不同模板混合,對不同梯度混合模板用優(yōu)化好的擴(kuò)增條件進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單基因PCR特異性分析

    采用沙門氏菌鞭毛基因fimY和空腸彎曲菌基因hipO設(shè)計(jì)引物,通過在線BLAST程序[10-11]驗(yàn)證兩對引物特異性。用設(shè)計(jì)的引物分別對沙門氏菌、空腸彎曲菌進(jìn)行單基因PCR擴(kuò)增,以46株沙門氏菌分離株與常見食源性致病菌單核細(xì)胞增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸桿菌等為供試菌株做特異性試驗(yàn)。結(jié)果顯示46株沙門氏菌均出現(xiàn)423bp擴(kuò)增條帶,其它菌株均無特異性擴(kuò)增條帶。

    2.2 雙重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

    將兩種DNA模板混合,分別使用不同濃度的單對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,確定一個合適的引物濃度范圍,再采用不同引物濃度組合進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增,結(jié)合擴(kuò)增效果和引物用量,確定最佳引物濃度組合為沙門氏菌0.6μmol/L和空腸彎曲菌為0.4μmol/L,結(jié)果見圖1。按退火溫度一般低于Tm值3~5℃優(yōu)化原則[12],選擇46.2、47.1、48.4、50.1、52、53.1、55.8、57.6、59、60、60.8℃ 11個不同溫度進(jìn)行多重PCR退火溫度優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)50.1~59℃間退火溫度的條帶最為理想,考慮到退火溫度較高可能降低擴(kuò)增效率,取52℃作為退火溫度,結(jié)果見圖2。在其他最佳條件下,選擇Mg2+濃度為0.5~3.0mmol/L,以0.5mmol/L為梯度調(diào)整Mg2+濃度,根據(jù)結(jié)果,再在1.0~3.0mmol/L之間,以0.2mmol/L為梯度調(diào)整Mg2+濃度,確定最佳Mg2+濃度為2.0mmol/L,結(jié)果見圖3。

    圖1 雙重PCR不同引物濃度組合電泳圖Fig.1 Various primer concentrations and electrophoretic bands from duplex PCR

    圖2 雙重PCR不同退火溫度電泳圖Fig.2 Various annealing temperatures and electrophoretic bands from duplex PCR

    圖3 雙重PCR不同Mg2+濃度電泳圖Fig.3 Various Mg2+concentrations and electrophoretic bands from duplex PCR

    2.3 雙重PCR特異性與敏感性分析

    單一PCR和雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖4。單一PCR只出現(xiàn)單一目的條帶,混合模板PCR出現(xiàn)兩條目的條帶,片段大小與設(shè)計(jì)相符,擴(kuò)增結(jié)果均無非特異性擴(kuò)增與引物二聚體出現(xiàn)。單一PCR擴(kuò)增沙門氏菌靈敏度可以達(dá)到3.98pg,空腸彎曲菌的靈敏度可達(dá)到4.05pg。比較單一PCR擴(kuò)增結(jié)果與雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖5~7),表明雙重PCR擴(kuò)增靈敏度較單一PCR擴(kuò)增低。在雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果中,沙門氏菌靈敏度降低兩個數(shù)量級,為398pg,空腸彎曲菌減少一個數(shù)量級,為40.5pg。

    圖4 雙重PCR特異性結(jié)果Fig.4 Electrophoresis test for the specificity of duplex PCR

    圖5 沙門氏菌單基因PCR靈敏度結(jié)果Fig.5 Test for the sensitivity of PCR forSalmonellaspp

    圖6 空腸彎曲菌單基因PCR靈敏度結(jié)果Fig.6 Test for the sensitivity ofCampylobacter jejuni

    圖7 雙重PCR靈敏度結(jié)果Fig.7 Test for the sensitivity of duplex PCR

    3 討 論

    隨著食品衛(wèi)生要求的不斷提高,快速檢測食品微生物在食品安全中的重要性愈加明顯。沙門氏菌和空腸彎曲菌是世界范圍內(nèi)食品污染的主要病原菌之一[13]。如何快速檢測食品中沙門氏菌和空腸彎曲菌,縮短檢測時間,提高檢測靈敏度,減少錯檢、漏檢是食品病原微生物檢測的重點(diǎn)。用于沙門氏菌檢測最常見的靶基因有編碼吸附上皮細(xì)胞的蛋白基因invA[14]和腸毒素基因stn[15]等,而常用于空腸彎曲菌檢測靶基因有mapA、ceuE、flaA等[3]。對于單個基因的PCR方法已有較多報(bào)道[16-17],而采用多重PCR對這兩種菌進(jìn)行檢測的報(bào)道較少[3,18]。本實(shí)驗(yàn)采用的是高度保守的fimY基因和hipO基因設(shè)計(jì)特異性引物,建立了一個快速、同時檢測沙門氏菌和空腸彎曲菌的雙重PCR方法。

    實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的特異性引物用沙門氏菌和空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)株、46株沙門氏菌分離株以及金黃色葡萄球菌等其余的9株菌進(jìn)行特異性檢測。受試的46株沙門氏菌均能擴(kuò)出目的條帶,而金黃色葡萄球菌等其余的9株菌無特異性擴(kuò)增條帶,說明試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物有較高的種間特異性和屬間特異性。實(shí)驗(yàn)對影響PCR反應(yīng)的退火溫度、引物濃度和Mg2+濃度主要因素進(jìn)行優(yōu)化,獲得最佳反應(yīng)體系。在本研究中,發(fā)現(xiàn)單一PCR的靈敏度與報(bào)道[18]一致,實(shí)驗(yàn)建立的雙重PCR檢測方法檢出沙門氏菌和空腸彎曲菌的靈敏分別達(dá)到398pg和40.5pg,較單一PCR靈敏度低,但比凌霞等[12]報(bào)道的三重PCR檢測空腸彎曲菌靈敏度有所提高。在本實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)致雙重PCR靈敏度降低的可能原因是各對引物擴(kuò)增時存在對底物以及Taq酶等的競爭,降低了擴(kuò)增產(chǎn)量[19]。本研究基于沙門氏菌fimY基因和空腸彎曲菌的hipO基因建立了特異性強(qiáng)、靈敏度高的雙重PCR檢測方法,該方法在食品沙門氏菌和空腸彎曲菌的檢測中的具有一定的指導(dǎo)意義。

    [1] 何國慶, 賈英民. 食品微生物[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 2002.

    [2] Mc CARTHY N, GIESECKE J. Incidence of Guillain Barre Syndrome following infection withCampylobacter jejuni[J]. Am J Epidemiol,2001, 153(6):610-614.

    [3] 吳高林, 喬昕, 袁寶君. 空腸彎曲菌多重PCR快速檢測方法建立的研究[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2007, 34(2):98-99.

    [4] STEPHEN L W O, JORDAN P J. Evaluation of 11 PCR assays for species-level identification ofCampylobacter jejuniandCampylobacter coli[J]. Clin Microbiol, 2003, 41:330-336.

    [5] 向雪菲, 劉斌, 張利達(dá), 等. 食品中沙門氏菌分子檢測靶點(diǎn)的篩選與評價[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2008, 48(7):941-946.

    [6] GB/T 4789.4—2008 食品微生物檢驗(yàn):沙門氏菌檢驗(yàn)[S].

    [7] GB/T 4789.9—2008 食品微生物檢驗(yàn):空腸彎曲菌檢驗(yàn)[S].

    [8] 黃金林, 焦新安, 文其乙, 等. 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測沙門氏菌[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 23(3):5-11.

    [9] 魏群. 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京:高等教育出版社, 2005.

    [10] NCBI. [EB/OL]. [2010-06-10]. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ctg_time=1287639280&job_key=JSID_01_28371_130.14.22.21_9000.

    [11] NCBI. [EB/OL]. [2010-06-10]. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ctg_time=1287640027&job_key=JSID_01_30069_130.14.24.201_9000&Check+Status=Check.

    [12] 凌霞, 沙丹, 肖勇, 等. 空腸彎曲菌、單增李斯特菌和大腸桿菌O157多重PCR分子檢測研究[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué), 2009, 24(2):101-105.

    [13] 胡哲, 王振國, 劉金華, 等. 利用PCR技術(shù)檢測雞肉產(chǎn)品中的空腸彎曲桿菌[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 27(6):671-674.

    [14] RAHN K, GRANDIS S A, CLARKE R C. Amplification of aninvAgene sequence ofSalmonella typhimuriumby polymerase chainreaction as a specific method of detection ofSalmonella[J]. Molecular and Cellular Probes, 1992, 6(4):271-279.

    [15] DINJUS U, HANEL I, BAUERFEIND R, et al. Detection of the induction ofSalmonellaenterotoxin gene expression by contact with epithelial cells with RT-PCR[J]. FEMS Microbiol Lett, 1997, 146(2):175-179.

    [16] 李鑫, 劉騫. 食源性沙門氏菌快速檢測技術(shù)[J]. 肉類研究, 2008(10):67-70.

    [17] 侯建軍, 郝永清, 朱建國, 等. 空腸彎曲桿菌分子生物學(xué)檢測方法研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2007, 34(11):87-90.

    [18] 何蕊, 黃金林, 許海燕, 等. 彎曲菌多重PCR檢測方法的建立及其初步應(yīng)用[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 28(1):5-8.

    [19] 邵碧英, 陳彬, 湯敏英, 等. 沙門氏菌多重PCR檢測方法的建立[J].食品科學(xué), 2007, 28(10):489-492.

    Development of a Duplex PCR for Detection ofSalmonellaspp andCampylobacter jejuniin Food

    CHEN Nuo1,TANG Shan-hu1,*,CHEN Jin-hui2,CEN Lu-jia1,LI Xue1,LONG Hu1
    (1. College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China;2. Dongguan Inspection and Quarantine Bureau, Dongguan 523072, China)

    S855.11

    A

    1002-6630(2010)22-0403-04

    2010-07-06

    西南民族大學(xué)研究基金項(xiàng)目

    陳諾(1984—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail:cn2003910@163.com

    *通信作者:唐善虎(1964—),男,教授,博士,研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與食品安全。E-mail:stang01@126.com

    猜你喜歡
    檢測方法
    “不等式”檢測題
    “一元一次不等式”檢測題
    “一元一次不等式組”檢測題
    “幾何圖形”檢測題
    “角”檢測題
    學(xué)習(xí)方法
    可能是方法不對
    小波變換在PCB缺陷檢測中的應(yīng)用
    用對方法才能瘦
    Coco薇(2016年2期)2016-03-22 02:42:52
    四大方法 教你不再“坐以待病”!
    Coco薇(2015年1期)2015-08-13 02:47:34
    国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产精品久久久久久久电影| 人妻久久中文字幕网| 69人妻影院| 久久久久久国产a免费观看| 此物有八面人人有两片| 久久久久久九九精品二区国产| 国内精品一区二区在线观看| 欧美+日韩+精品| 美女被艹到高潮喷水动态| 久久久久久久久中文| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产精品一二三区在线看| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产私拍福利视频在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 日本与韩国留学比较| 看片在线看免费视频| 色av中文字幕| 午夜老司机福利剧场| 久久精品影院6| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 男女那种视频在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 长腿黑丝高跟| 欧美高清成人免费视频www| 成人午夜高清在线视频| 久久人人精品亚洲av| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲av.av天堂| 国产探花极品一区二区| 国产真实乱freesex| www.色视频.com| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 91av网一区二区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日本黄色视频三级网站网址| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产片特级美女逼逼视频| 午夜福利在线观看吧| 色综合站精品国产| 久久久久久久午夜电影| 99九九线精品视频在线观看视频| 91久久精品国产一区二区三区| 草草在线视频免费看| 国产精品,欧美在线| 日韩精品有码人妻一区| 成人特级av手机在线观看| 舔av片在线| 久久久久久久午夜电影| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲av一区综合| 99在线人妻在线中文字幕| av免费在线看不卡| 精品国产三级普通话版| 亚洲精品日韩av片在线观看| av在线观看视频网站免费| av天堂中文字幕网| 国产毛片a区久久久久| 国产精品亚洲美女久久久| 内射极品少妇av片p| 亚洲国产精品合色在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美日韩在线观看h| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 我要看日韩黄色一级片| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 日本熟妇午夜| 国产美女午夜福利| 午夜a级毛片| 18+在线观看网站| 性插视频无遮挡在线免费观看| av天堂在线播放| 国产探花极品一区二区| 在线播放无遮挡| 亚洲精品久久国产高清桃花| 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品电影一区二区三区| 日本-黄色视频高清免费观看| 高清毛片免费看| 欧美激情在线99| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 91在线精品国自产拍蜜月| 一个人免费在线观看电影| 日韩强制内射视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久久久色成人| 国产69精品久久久久777片| 九九爱精品视频在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 色尼玛亚洲综合影院| 日韩欧美国产在线观看| 在线播放无遮挡| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 又黄又爽又免费观看的视频| 黄色配什么色好看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 内地一区二区视频在线| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 欧美最黄视频在线播放免费| 午夜日韩欧美国产| 免费看日本二区| 国产色爽女视频免费观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 中文资源天堂在线| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久中文看片网| 精品午夜福利在线看| 岛国在线免费视频观看| 国产亚洲精品久久久com| 国产真实乱freesex| 精品午夜福利视频在线观看一区| 天堂影院成人在线观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 大香蕉久久网| 女同久久另类99精品国产91| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品福利在线免费观看| 嫩草影视91久久| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国内精品久久久久精免费| 久久久欧美国产精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 国产精品久久久久久久电影| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 成人一区二区视频在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 中文字幕av在线有码专区| 国产精品国产高清国产av| 欧美最新免费一区二区三区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲av五月六月丁香网| 国产高清不卡午夜福利| 国产成人精品久久久久久| 一区二区三区高清视频在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 高清毛片免费看| aaaaa片日本免费| 国产乱人偷精品视频| 亚洲av一区综合| 久久久久久大精品| 97在线视频观看| 久久精品影院6| 九色成人免费人妻av| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲av五月六月丁香网| 国产成人一区二区在线| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 在线免费观看的www视频| 久久久精品94久久精品| 亚洲av一区综合| 久久久久九九精品影院| 亚洲va在线va天堂va国产| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久久久精品国产欧美久久久| 麻豆av噜噜一区二区三区| 三级毛片av免费| 久99久视频精品免费| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲国产欧美人成| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 中文字幕久久专区| 特大巨黑吊av在线直播| 91精品国产九色| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产色婷婷99| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲色图av天堂| 国产精品国产高清国产av| 婷婷精品国产亚洲av| 久久鲁丝午夜福利片| 精品不卡国产一区二区三区| 小说图片视频综合网站| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 天天一区二区日本电影三级| 午夜日韩欧美国产| 亚洲性久久影院| 日韩成人伦理影院| 赤兔流量卡办理| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产av麻豆久久久久久久| 日韩欧美在线乱码| 亚洲美女搞黄在线观看 | 亚洲专区国产一区二区| 日韩精品中文字幕看吧| 久久久久国产网址| 亚洲av二区三区四区| 黄色配什么色好看| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 国产 一区精品| 国产视频一区二区在线看| 网址你懂的国产日韩在线| 美女被艹到高潮喷水动态| 看免费成人av毛片| 国语自产精品视频在线第100页| 国产精品亚洲一级av第二区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产 一区精品| 看非洲黑人一级黄片| 午夜a级毛片| 最新中文字幕久久久久| 久久久久久久久久黄片| 黑人高潮一二区| 十八禁网站免费在线| 亚洲av一区综合| 色播亚洲综合网| 国产精品嫩草影院av在线观看| 一进一出抽搐动态| 国产日本99.免费观看| 99久国产av精品| 成人亚洲精品av一区二区| 成人美女网站在线观看视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产在视频线在精品| 日本一本二区三区精品| 黄色欧美视频在线观看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产 一区 欧美 日韩| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲av不卡在线观看| 天堂影院成人在线观看| 成人精品一区二区免费| 国产亚洲精品av在线| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 成人亚洲欧美一区二区av| 少妇高潮的动态图| 在线播放无遮挡| 成年版毛片免费区| 婷婷亚洲欧美| 国产精品综合久久久久久久免费| 无遮挡黄片免费观看| 欧美bdsm另类| 久久中文看片网| 欧美一区二区亚洲| 国产黄a三级三级三级人| 欧美性感艳星| 日本a在线网址| 麻豆成人午夜福利视频| 日韩欧美精品免费久久| 日韩欧美免费精品| 高清毛片免费观看视频网站| 午夜福利在线观看吧| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲久久久久久中文字幕| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久久久久九九精品二区国产| 午夜a级毛片| 黑人高潮一二区| 超碰av人人做人人爽久久| 春色校园在线视频观看| 午夜爱爱视频在线播放| 特大巨黑吊av在线直播| 天堂网av新在线| 欧美+日韩+精品| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲精品亚洲一区二区| www日本黄色视频网| 丰满人妻一区二区三区视频av| 中文字幕熟女人妻在线| 国内揄拍国产精品人妻在线| 十八禁网站免费在线| 欧美性感艳星| 免费看美女性在线毛片视频| 丝袜美腿在线中文| 99在线视频只有这里精品首页| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 中出人妻视频一区二区| av黄色大香蕉| 一本精品99久久精品77| 99热精品在线国产| 91狼人影院| 波野结衣二区三区在线| 精品久久久久久久末码| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品人妻熟女av久视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 成人一区二区视频在线观看| 国产探花极品一区二区| 国产午夜福利久久久久久| 久久久久久九九精品二区国产| 一级a爱片免费观看的视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 在线观看一区二区三区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲av一区综合| 在线看三级毛片| av黄色大香蕉| 特级一级黄色大片| 在线天堂最新版资源| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| eeuss影院久久| 欧美性感艳星| 国模一区二区三区四区视频| 国产美女午夜福利| 如何舔出高潮| 免费黄网站久久成人精品| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 免费电影在线观看免费观看| 天美传媒精品一区二区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲久久久久久中文字幕| 天堂网av新在线| 91狼人影院| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲国产高清在线一区二区三| 2021天堂中文幕一二区在线观| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 少妇的逼好多水| av视频在线观看入口| 插阴视频在线观看视频| 一本久久中文字幕| 99热这里只有是精品在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 久久久国产成人精品二区| 真实男女啪啪啪动态图| 成人永久免费在线观看视频| 久久久久久九九精品二区国产| 99久久中文字幕三级久久日本| 日本a在线网址| 午夜老司机福利剧场| 国产中年淑女户外野战色| 国产乱人偷精品视频| 亚洲成av人片在线播放无| 中文资源天堂在线| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 国内精品一区二区在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 色哟哟哟哟哟哟| av天堂在线播放| 亚洲18禁久久av| 麻豆国产av国片精品| av黄色大香蕉| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲成人精品中文字幕电影| 九九热线精品视视频播放| 日韩高清综合在线| 精品欧美国产一区二区三| 精品久久久久久久久久免费视频| 99riav亚洲国产免费| 午夜精品国产一区二区电影 | 可以在线观看的亚洲视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 99热这里只有是精品50| 看十八女毛片水多多多| 亚洲成人中文字幕在线播放| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 夜夜夜夜夜久久久久| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲av.av天堂| 中国美女看黄片| 亚洲人成网站在线播| 久久人妻av系列| 国产熟女欧美一区二区| 亚州av有码| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲久久久久久中文字幕| 看黄色毛片网站| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 丰满乱子伦码专区| 麻豆成人午夜福利视频| 国内精品久久久久精免费| 久久亚洲国产成人精品v| 九九在线视频观看精品| 身体一侧抽搐| 欧美一级a爱片免费观看看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 成人三级黄色视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 成年版毛片免费区| 免费av观看视频| 12—13女人毛片做爰片一| 亚州av有码| 一级毛片我不卡| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美精品国产亚洲| 99久久精品国产国产毛片| 午夜久久久久精精品| 中文资源天堂在线| 蜜臀久久99精品久久宅男| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲国产色片| 啦啦啦韩国在线观看视频| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲av美国av| 在现免费观看毛片| 男女那种视频在线观看| 成年版毛片免费区| 一级a爱片免费观看的视频| 国产黄色小视频在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 免费观看精品视频网站| 永久网站在线| 色吧在线观看| 免费观看的影片在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日本成人三级电影网站| 久久99热这里只有精品18| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲无线观看免费| av在线观看视频网站免费| 免费大片18禁| 桃色一区二区三区在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 一级毛片aaaaaa免费看小| 午夜福利高清视频| 亚洲av成人av| 最后的刺客免费高清国语| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲欧美精品自产自拍| av免费在线看不卡| 69av精品久久久久久| 国产精品久久久久久久久免| 黄色配什么色好看| 免费看a级黄色片| 乱人视频在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 黄色配什么色好看| 日韩欧美精品v在线| 一区二区三区四区激情视频 | 床上黄色一级片| 日韩高清综合在线| 观看免费一级毛片| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 啦啦啦韩国在线观看视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 91久久精品国产一区二区三区| 婷婷色综合大香蕉| 天美传媒精品一区二区| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产高潮美女av| 日日干狠狠操夜夜爽| 老司机午夜福利在线观看视频| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 国产高清激情床上av| 亚洲高清免费不卡视频| 级片在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产精品乱码一区二三区的特点| 99久久精品热视频| 99久国产av精品国产电影| 日本在线视频免费播放| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 九色成人免费人妻av| 在线观看午夜福利视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 精品不卡国产一区二区三区| 日韩三级伦理在线观看| 热99re8久久精品国产| 精品一区二区三区av网在线观看| 免费观看在线日韩| a级毛片免费高清观看在线播放| 99热6这里只有精品| 国产成人freesex在线 | 高清日韩中文字幕在线| 国产精品女同一区二区软件| 嫩草影院入口| 成年免费大片在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 欧美潮喷喷水| 国产高清不卡午夜福利| av中文乱码字幕在线| 长腿黑丝高跟| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 成人av一区二区三区在线看| 亚洲av.av天堂| 最后的刺客免费高清国语| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产一区二区三区av在线 | 亚洲欧美日韩高清专用| 一级黄片播放器| 国产探花在线观看一区二区| 国产精品不卡视频一区二区| 麻豆久久精品国产亚洲av| a级毛片a级免费在线| 国产美女午夜福利| 天天一区二区日本电影三级| 久久久久久伊人网av| 成人av在线播放网站| 亚洲无线观看免费| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲精品国产av成人精品 | 日韩欧美 国产精品| 日韩欧美免费精品| 老女人水多毛片| 久久人人精品亚洲av| 成人无遮挡网站| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 成人精品一区二区免费| 久久国产乱子免费精品| 毛片女人毛片| 搞女人的毛片| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 丝袜美腿在线中文| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 免费在线观看影片大全网站| 日日干狠狠操夜夜爽| 欧美成人免费av一区二区三区| 我的老师免费观看完整版| 欧美精品国产亚洲| 男人狂女人下面高潮的视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲最大成人手机在线| 在线播放无遮挡| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久久久九九精品影院| 亚洲成av人片在线播放无| 婷婷六月久久综合丁香| 人妻少妇偷人精品九色| 91狼人影院| 一进一出好大好爽视频| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 可以在线观看的亚洲视频| 尾随美女入室| 久久这里只有精品中国| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 人人妻人人看人人澡| 久久这里只有精品中国| 亚洲国产精品成人久久小说 | 国产精品一及| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲成av人片在线播放无| 我的女老师完整版在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美+日韩+精品| 久久精品国产清高在天天线| 97热精品久久久久久| 亚洲在线自拍视频| 国产精品福利在线免费观看| 精品免费久久久久久久清纯| 高清毛片免费看| 日韩av不卡免费在线播放| 一个人观看的视频www高清免费观看| 成年av动漫网址| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 色哟哟·www| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 久久热精品热| 亚洲精品国产av成人精品 | 欧美三级亚洲精品| 日日撸夜夜添| 99久久成人亚洲精品观看| 日韩欧美 国产精品| 亚洲av免费高清在线观看| 国产亚洲精品av在线| 国产高清视频在线观看网站| 能在线免费观看的黄片| 黄色日韩在线| 国产男人的电影天堂91| 国产精品一二三区在线看| 国产精品99久久久久久久久| 日本精品一区二区三区蜜桃| 午夜老司机福利剧场| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 午夜精品在线福利| 国产精品国产高清国产av| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 三级经典国产精品| 国产精品av视频在线免费观看| 国产成人a∨麻豆精品| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 在线国产一区二区在线| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 干丝袜人妻中文字幕| av在线天堂中文字幕| 天堂影院成人在线观看| 亚洲自拍偷在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 日本熟妇午夜| а√天堂www在线а√下载| 亚洲欧美日韩东京热| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产伦一二天堂av在线观看| 日本a在线网址| 欧美激情国产日韩精品一区| av在线播放精品| 黄色日韩在线| 美女cb高潮喷水在线观看| 免费观看在线日韩| 国产淫片久久久久久久久| 国内精品美女久久久久久| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 男女视频在线观看网站免费|