快速溶劑萃取法提取水芹中總黃酮工藝研究

唐巧玉，周毅峰

(1.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

快速溶劑萃取法提取水芹中總黃酮工藝研究

唐巧玉1，周毅峰2

(1.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

為提高水芹中黃酮的提取效率，以黃酮得率為考察指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)研究總黃酮快速萃取的工藝條件。結(jié)果表明：乙醇為最佳提取溶劑，總黃酮快速萃取的條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度100℃、每次提取時(shí)間5min、提取次數(shù)為3次，黃酮得率為3.64%?？焖佥腿」に嚥粌H能縮短提取時(shí)間，還能提高水芹中黃酮的提取率。

水芹；黃酮；快速萃取

Abstract：In order to improve the extraction efficiency, the extraction processing of total flavonoids fromOenanthe javanicawas optimized by single factor and orthogonal experiments based on the extraction rate of total flavonoids as an evaluation index.Results indicated that the optimal extraction processing parameters were ethanol concentration of 60%, extraction temperature of 100 ℃, extraction time of 5 min and repeated extraction number of 3. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of total flavonoids was 3.64%. This accelerated solvent extraction method has the advantages of shortening extraction time and improving extraction rate of total flavonoids.

Key words：Oenanthe javanica；flavonoids；accelerated solvent extraction

水芹為傘形科水芹屬植物水芹(Oenanthe javanica)的全草，又名水英、野芹菜等[1]。其營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多種人體內(nèi)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有良好的食用價(jià)值[2]。同時(shí)，水芹在臨床中對(duì)高血壓病、高脂血癥、心腦血管疾病、乙型肝炎具有防治作用[3-5]。目前，黃酮的提取主要采用醇、水等溶劑進(jìn)行常壓提取[6]、超聲波輔助提取[7]、復(fù)合酶法提取[8]等方法，快速溶劑萃取法是一種在提高溫度和壓力的條件下，用有機(jī)溶劑萃取的方法，與索氏提取相比，快速溶劑萃取有機(jī)溶劑用量少、快速。本實(shí)驗(yàn)選用有機(jī)溶劑采用快速溶劑萃取法[9-10]提取水芹中的總黃酮，結(jié)合正交設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)方法，研究水芹黃酮快速萃取的條件，旨在提高水芹中黃酮的提取效率。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

原料為市購(gòu)水芹，80℃烘干，粉碎過(guò)60目篩，用石油醚索氏提取至提取液基本無(wú)色并棄去，余下的水芹固體粉末揮發(fā)干備用。

石油醚、無(wú)水乙醇(均為分析純) 天津市北科化學(xué)品有限責(zé)任公司；硝酸鋁、亞硝酸鈉(均為分析純) 上海振興化工一廠；蘆丁(生化試劑) 陜西西安羅森伯科技有限公司。

ASE300快速萃取儀 美國(guó)戴安公司；AL204型電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市新航儀器廠；S53/54紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海棱譜儀器儀表有限公司；DL-6MB低速大容量冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙科威實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮含量的測(cè)定

以蘆丁為標(biāo)樣，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測(cè)定水芹中的總黃酮含量[11-12]。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：C=－0.08614+98.1205A，式中：C為蘆丁質(zhì)量濃度/(μg/mL)，A為吸光度，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。

1.2.2 快速萃取溶劑的選擇及對(duì)照實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取1.1節(jié)處理得到的水芹粉末樣品1g，分別以甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿為溶劑，在1.52MPa條件下，90℃快速萃取10min。用溶劑快速?zèng)_洗樣品，氮?dú)獯祾呤占刻崛∫?，測(cè)定總黃酮含量，篩選出最佳萃取溶劑。

分別稱(chēng)取水芹樣品1g，以提取溫度90℃，提取時(shí)間2 h，分別利用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿為溶劑，料液比1:50(g/mL)為提取條件進(jìn)行常壓回流提取，以此與快速萃取結(jié)果進(jìn)行比較。

1.2.3 總黃酮快速提取條件選擇

先以提取溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，然后根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取適當(dāng)條件范圍進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化總黃酮提取條件。

1.2.4 黃酮得率的表示方法

黃酮得率為提取出來(lái)的水芹干粉中黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即100g水芹所含黃酮的質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

在中性或弱堿性及亞硝酸鈉存在條件下，黃酮類(lèi)化合物與鋁鹽生成螯合物，加入氫氧化鈉溶液后顯紅橙色[13]。如圖1所示，從蘆丁和水芹黃酮分別在相應(yīng)的反應(yīng)體系中生成的絡(luò)合物的吸收光譜可以看出，兩者的最大吸收波長(zhǎng)都在510nm，因此可以用蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定水芹中黃酮類(lèi)化合物的含量。

圖1 蘆丁和水芹菜黃酮反應(yīng)絡(luò)合物吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of chelated rutin andOenanthe javanicaflavonoid

2.2 提取溶劑對(duì)黃酮得率的影響

表1 不同溶劑對(duì)提取效果的影響Table 1 Effects of different solvents on extraction rate of total flavonoids fromOenanthe javanica %

從表1可以看出，乙醇和甲醇對(duì)水芹黃酮的提取效果明顯好于其他溶劑，以60%乙醇作為溶劑提取水芹中黃酮得率最高。同時(shí)，回流提取2h和快速萃取10min的黃酮得率相比，快速萃取還要高于回流提取。所以本實(shí)驗(yàn)選用乙醇為提取溶劑進(jìn)行水芹中黃酮類(lèi)物質(zhì)快速提取條件的研究。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

取樣品1g左右，分別加入體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液，在100℃條件下快速萃取法提取5min，測(cè)定提取液黃酮含量，并計(jì)算得率。如圖2所示，黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高而升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%后，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加卻減小，說(shuō)明60%的乙醇對(duì)水芹黃酮類(lèi)化合物的溶解性最好，這與水芹中黃酮的極性有關(guān)，故以下試驗(yàn)均采用60%的乙醇溶液進(jìn)行提取。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids fromOenanthe javanica

2.3.2 提取溫度的選擇

圖3 提取溫度對(duì)黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids fromOenanthe javanica

取樣品1g，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，分別于80、90、100、110、120℃用快速萃取法提取5min，測(cè)定提取液黃酮含量，并計(jì)算得率。如圖3所示，黃酮得率隨溫度升高而顯著增加，當(dāng)溫度為100℃時(shí)，黃酮得率最高。一般來(lái)說(shuō)，在高溫下提取效率高，因?yàn)闇囟壬?，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，滲透、擴(kuò)散、溶解速度加快，使黃酮類(lèi)物質(zhì)更易溶解到溶劑中。但當(dāng)溫度達(dá)到100℃以上時(shí)黃酮得率下降，高溫造成黃酮類(lèi)物質(zhì)的破壞，故適宜的提取溫度為100℃。

2.3.3 提取時(shí)間的選擇

取樣品1g，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，在100℃分別快速萃取5、10、15、20、25min，測(cè)定提取液黃酮含量，并計(jì)算得率。如圖4所示，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮得率增加。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到10min時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大。由于長(zhǎng)期使其處于高溫狀態(tài)易導(dǎo)致黃酮類(lèi)物質(zhì)被破壞，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間使得率反而下降，故提取時(shí)間可選擇在10min左右。

圖4 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids fromOenanthe javanica

2.3.4 提取次數(shù)的選擇

圖5 提取次數(shù)對(duì)黃酮得率的影響Fig.5 Effect of repeated extraction number on extraction rate of total flavonoids fromOenanthe javanica

取樣品1g，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，在100℃快速萃取10min，分別萃取1、2、3、4、5次，由圖5可知，在提取次數(shù)為兩次以內(nèi)時(shí)，黃酮得率隨著提取次數(shù)增加而有很大增加，當(dāng)提取3次后，黃酮得率變化不大，表明快速溶劑萃取法重復(fù)兩次能將水芹中的絕大部分黃酮類(lèi)物質(zhì)提取出來(lái)，這與快速萃取工藝有關(guān)。在快速萃取完成后，先用溶劑快速?zèng)_洗樣品，然后用氮?dú)獯祾呤占刻崛∫海看翁崛『蟮狞S酮溶液和樣品分離完全，殘留少。

2.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)的結(jié)果，水芹黃酮快速提取過(guò)程中采用L9(34)正交試驗(yàn)(表2)研究總黃酮快速萃取的工藝條件，結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表2 工藝優(yōu)化L9(34)正交試驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments

表3 工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and of results of orthogonal experiments

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments

由極差分析可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取次數(shù)對(duì)黃酮得率影響最大，其次是提取溫度，而提取時(shí)間的影響較小。最佳提取工藝組合為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度100℃、提取時(shí)間5min、提取次數(shù)3次。用該條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，黃酮的得率為3.64%。由方差分析可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取次數(shù)對(duì)黃酮得率的影響都達(dá)到了極顯著水平(P＜0.01)，而提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響并不顯著(P＞0.05)。

3 結(jié) 論

水芹黃酮最佳的提取工藝是以60%的乙醇為溶劑，在100℃的提取溫度下，每次提取5min，提取3次的效果最佳，水芹黃酮得率為3.64%?？焖佥腿∧茉诤芏痰臅r(shí)間里完成萃取過(guò)程，大大縮短了傳統(tǒng)萃取所耗用的時(shí)間，可降低成本。

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Extraction Processing of Total Flavonoids fromOenanthe javanicausing Accelerated Solvent Extraction Method

TANG Qiao-yu1，ZHOU Yi-feng2
(1. Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Enshi 445000, China；2. School of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China)

TS255.1

A

1002-6630(2010)22-0190-04

2010-06-27

恩施土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)與社會(huì)發(fā)展科技指導(dǎo)性項(xiàng)目

唐巧玉(1979—)，女，講師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用研究。E-mail：zhoujunye2009@163.com