響應面分析法優(yōu)化仙人掌黃酮提取工藝

朱 珠，冷進松

(吉林工商學院食品工程分院，吉林 長春 130062)

響應面分析法優(yōu)化仙人掌黃酮提取工藝

朱 珠，冷進松

(吉林工商學院食品工程分院，吉林 長春 130062)

利用響應面分析法對仙人掌中黃酮類物質的提取工藝進行優(yōu)化。先通過單因素試驗，然后選取適當的試驗因素與水平，根據中心組合試驗設計，采用四因素三水平響應面分析法，對各個因素的顯著性和交互作用進行分析。結果表明：仙人掌黃酮醇提工藝的最佳條件為液料比20:1(mL/g)、浸提溫度52.5℃、浸提時間4h、乙醇體積分數85%，在該條件下測得的仙人掌黃酮最大提取率為0.784%。

仙人掌；黃酮；提??；響應面法

Abstract：Response surface methodology was used to optimize the extraction processing of cactus flavonoids according to central composite design principle based on the single factor experimental results. Through screening of factors and levels, and the analysis of cross-interaction among factors, the optimal extraction conditions for cactus flavonoids were material-liquid ratio of 1:20, extraction temperature of 52.5 ℃, extraction time of 4 h, and alcohol concentration of 85%. The extraction rate of flavonoids was 0.784% under the optimal extraction conditions.

Key words：cactus；flavonoids；extraction；response surface methodology

仙人掌屬多年生肉質草本植物，其種類約有300多種，它營養(yǎng)豐富。近來研究發(fā)現：仙人掌含有生物堿類、黃酮類、甾醇類等功能性成分，具有降血脂、降血壓、降血糖的作用。黃酮具有增強心血管功能、抗腫瘤、增強免疫力、延緩衰老及抗氧化、降血糖、降血壓等作用[1]。響應面分析法(response surfacemethodology)系采用多元二次回歸方法作為函數估計的工具，將多因子試驗中因素與指標的相互關系用多項式近似擬合，依此可對函數的響應面和等高線進行分析，研究因子與響應面之間、因子與因子之間的相互關系。它與過去廣為使用的“正交試驗設計法”不同，具有試驗周期短，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點[2]。為了更大程度地開發(fā)利用仙人掌資源，本實驗著重研究利用響應面分析法得到其中黃酮類物質的最優(yōu)提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用仙人掌 長春生態(tài)園大棚種植基地；蘆丁對照品 南京替斯艾么中藥技術研究所；乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、石油醚(均為分析純)。

1.2 儀器與設備

HH-S型恒溫水浴鍋 鞏義濕英峪予華儀器廠；UV-2102C型紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器有限公司；RE-52C旋轉蒸發(fā)器、SHRZ-Ⅲ循環(huán)真空水泵 上海予華儀器設備有限公司；SXT-02索氏抽提器 上海洪紀儀器設備有限公司；AY120型托盤電子分析天平 日本島津制作所。

1.3 方法

1.3.1 回流提取法提取工藝

1.3.1.1 工藝流程

1.3.1.2 操作要點

稱取仙人掌干粉2.0g，加入70%乙醇100mL，浸泡30min，55℃條件下回流提取2h，然后取出用布氏漏斗抽濾，保留濾液，濾渣用70%乙醇100mL再次浸泡30min，二次回流2h。取出抽濾，將兩次得到濾液合并，濾液濃縮并用70%乙醇溶液定容至25mL，得黃酮提取液原料，以備后用。

1.3.2 仙人掌中黃酮的提取和測定

精確稱取2.0g仙人掌粉到具塞三角瓶中，按試驗設計加入乙醇溶液，在恒溫水浴下振蕩提取一定時間，冷卻后過濾至50mL容量瓶中，用體積分數70%的乙醇溶液洗滌濾渣及定容。取濾液2mL，按2.1節(jié)方法測定吸光度，試劑空白參比。黃酮提取率按下式計算[3]：

式中：Y為定容后提取液中蘆丁含量/(mg/mL)；50為仙人掌粉提取液定容后的體積/mL； 25為2mL提取液定容后體積/mL；2為從50mL提取液中吸取的體積/mL；2000為仙人掌粉質量/mg。

1.3.3 回流提取法最佳提取條件的選擇[4]

1.3.3.1 乙醇體積分數對提取率的影響

稱取2.0g食用仙人掌干粉5份，分別加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇100mL，在90℃條件下進行回流提取2h。取出抽濾，棄去濾渣，濾液分別濃縮并定容至25mL。準確吸取2mL樣液，測定吸光度A，利用黃酮含量測定公式得出黃酮類物質的含量。

1.3.3.2 液料比對提取率的影響

稱取2.0g食用仙人掌干粉5份，分別按液料比14:1、17:1、20:1、23:1、26:1(mL/g)加入70%乙醇，其操作步驟同1.3.3.1節(jié)。最后測定濾液試樣吸光度A，得出黃酮類物質的含量。

1.3.3.3 溫度對提取率的影響

稱取2.0g食用仙人掌干粉5份，分別加入70%乙醇100mL，于50、60、70、80、90℃條件下回流提取2h，其操作步驟同1.3.3.1節(jié)，測定吸光度A，得出黃酮類物質的含量。

1.3.3.4 時間對提取率的影響

稱取2.0g食用仙人掌干粉5份，分別提取1、2、3、4、5h，其操作步驟同1.3.3.1節(jié)，測定吸光度A，得出黃酮類物質的含量。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線和回歸方程的建立[5-6]

精確稱取蘆丁標準品0.0128g，用體積分數70%的乙醇溶解，定容至50mL，得到質量濃度為0.256mg/mL的蘆丁標準溶液。分別取標準液0、1、2、3、4、5mL于6個25mL容量瓶中，各加入20mL質量分數1%的AlCl3溶液，用體積分數70%的乙醇定容至刻度，靜置10min后于420nm波長處測定吸光度，試劑空白參比。用最小二乘法作線性回歸，得蘆丁質量濃度Y/(mg/mL)與吸光度A的標準曲線。其回歸方程：Y=0.04542X＋0.000465，相關系數R=0.99984。

2.2 乙醇體積分數對提取率的影響

圖1 乙醇體積分數對黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of alcohol concentration on extraction rate of flavonoids

由圖1可知，隨著乙醇體積分數的增加，黃酮的提取率呈先上升后下降趨勢，在80%時達到最大值，對應黃酮提取率為0.688%，當體積分數大于80%時，其提取率反而下降。由于高體積分數的乙醇溶液使得一些醇溶性雜質、色素(葉綠素等)、親脂性強的成分溶出量增加，這些成分與黃酮類化合物競爭，與乙醇-水分子體系結合，參與顯色反應進而影響最終的測定，干擾因素隨之增大。從而導致黃酮類化合物的提取率不升反降[7]。

2.3 液料比對提取率的影響

圖2 液料比對黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of flavonoids

由圖2可知，隨著液料比的增大，仙人掌中黃酮的提取率呈先增大后逐漸平衡的趨勢，從14:1(mL/g)到23:1(mL/g)時提取率增幅較大。隨著液料比的繼續(xù)增大，其提取率變化不大，繼續(xù)加大液料比，會造成提取液的浪費，同時會給后續(xù)工藝帶來新的困難[8]。從節(jié)約原料方面考慮，最終確定料液比的最佳范圍為17:1～20:1(mL/g)。

2.4 提取溫度對提取率的影響

圖3 提取溫度對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of flavonoids

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，黃酮提取率增加，在60℃時達到最大值。隨著溫度的繼續(xù)升高，提取率逐漸降低。提取溫度過高時，可能會導致大量醇溶性雜質加速溶解，從而阻礙了黃酮類化合物在乙醇中的溶解度，降低了黃酮類化合物提取率。在高溫高氧的環(huán)境下，黃酮類化合物結構被氧化破壞，從而導致黃酮類提取率的下降。因此，提取溫度的最佳范圍為 50～60℃[9]。

2.5 提取時間對提取率的影響

圖4 提取時間對黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of flavonoids

由圖4可知，隨著提取時間的增加，仙人掌中黃酮的提取率呈先增大后逐漸降低的趨勢，從1h到4h時提取率增幅較大，在4h時達到最大。開始時，提取時間的增加，增加了黃酮類化合物在乙醇中的溶解，提高了其提取率，隨著提取時間的延長，會使其他醇溶性物質同時被溶解提取，妨礙了黃酮類化合物的溶解度，其他醇溶性雜質的存在會對實驗結果的準確性產生影響，需對提取時間加以控制[10]。

2.6 響應面法優(yōu)化仙人掌黃酮提取工藝

2.6.1 黃酮提取因素水平和試驗方案[11]

表1 試驗因素水平編碼Table 1 Factors and levels of response surface methodology

表2 仙人掌黃酮提取響應面分析方案及結果Table 2 Design and results of response surface methodology for the extraction of cactus flavonoids

根據Central Composite實驗設計原理，綜合單因素試驗所得結果，選取乙醇體積分數、浸提溫度、浸提時間和液料比4個對黃酮提取率影響較大的因素，對提取工藝進行響應面分析，具體方案見表1、2。

仙人掌黃酮類物質提取率及含量檢測結果見表3，采用Design-Experts 程序對所得數據進行回歸分析，4個因素經過擬合得到黃酮提取率回歸方程如下所示：

當P值小于0.05即表示該項指標顯著，從表3的分析結果來看，整體模型的P值小于0.0001，表明該二次方程模型極顯著[12-13]。液料比和乙醇體積分數影響顯著，而浸提時間和浸提溫度影響不顯著。在所選取的各因素水平范圍內，按照對結果的影響排序，液料比＞乙醇體積分數＞浸提時間＞浸提溫度。

表3 仙人掌黃酮提取工藝參數數學統(tǒng)計分析Table 3 Result analysis of response surface methodology for optimizing extraction processing of cactus flavonoids

2.6.2 因素間的交互影響

圖5 各因素間交互作用的響應面圖Fig.5 Response surface plots for the effects of cross-interactions among different factors on extraction rate of flavonoids from cactus

根據擬合模型繪制仙人掌黃酮提取率三維響應面圖見圖5，在所選范圍內存在極值，即存在響應面最高點。圖5 a表明，提取溫度低、時間短時，黃酮提取率低；但溫度過高、時間過長可能導致黃酮得率下降，這可能是由于時間長、溫度高使黃酮分解[14]。圖5b表明，在液料比較大范圍內均可以得到較大的Y響應值，在液料比20:1(mL/g)、溫度52.5℃附近可以達到響應值最高點，與ANOVA分析[15]結果吻合。圖5c表明，提取溫度適中，乙醇體積分數在較大范圍內均可以得到較高的提取率。圖5d中的等高線為橢圓形，在提取時間比較短時，液料比對總黃酮的得率影響非常顯著，表現為曲線比較陡，說明在提取時間不是很充足時，提高液料比能明顯提高總黃酮的得率，而在提取時間較充分時，液料比對總黃酮的得率影響不是很明顯，表現為曲線比較平緩，即提取時間比較充分的狀況下，即使提高液料比，總黃酮的得率也得不到明顯提高。圖5e表明，在乙醇體積分數85%、提取時間4h附近可以達到響應值最高點。圖5f表明，在乙醇體積分數較高、液料比較大的范圍內可以達到響應值最高點。由Design-Expert軟件優(yōu)化程序分析仙人掌黃酮含量相對較高的提取工藝參數范圍為提取時間3.5～4.0h、提取溫度45～55.2℃、液料比17:1～23:1(mL/g)，仙人掌黃酮提取率可以達到0.75%～0.81%?？偟膩砜?，4個試驗因素對黃酮提取率及含量響應值的影響均不是簡單的線性關系，平方項對響應值也有很大的影響；提取溫度和提取時間對仙人掌黃酮提取率有著顯著的影響。

2.7 浸提工藝條件的確定

通過軟件Design-Expert 7.0求解方程，得出最優(yōu)浸提工藝條件為液料比20:1(mL/g)、浸提溫度52.5℃、浸提時間4h、乙醇體積分數85%，此時仙人掌黃酮的提取率達到極值0.796%。為檢驗結果的可靠性，采用修正條件進行浸提實驗，結果得出仙人掌黃酮的實際提取率為0.784%，與理論預測值基本吻合。因此，可知利用響應面分析法得到的仙人掌黃酮浸提工藝參數真實可靠，有實用價值[16]。

3 結 論

應用響應面分析法優(yōu)化仙人掌黃酮的浸提工藝，結果表明：獲得最高仙人掌黃酮提取率所需的最佳工藝條件為液料比20:1(mL/g)、浸提溫度52.5℃、浸提時間4h、乙醇體積分數85%，仙人掌黃酮的提取率為0.784%。

本次研究通過響應面分析，在試驗范圍之內找到了最佳控制點。與正交設計的方差分析相比，響應面回歸分析能夠更準確地指明最佳控制條件，而正交設計僅能從試驗預先設定的幾個水平中優(yōu)選組合，因此正交設計得到的最佳工藝條件，并非真實意義的最佳條件，只能說是理想條件。另外響應面中的嶺脊分析還可在曲面復雜時，在試驗范圍之外找到最佳控制點，從而確定新的試驗方向，這是正交設計的方差分析所不能比擬的。這在進一步的驗證實驗中得到了證實，由此可以看出建立的模型與實際情況是比較吻合的。

[1] 國家藥典委員會. 中國藥典:一部[M]. 北京:化學工業(yè)出版社, 2005:132.

[2] 黃璞, 謝明勇, 聶少平, 等. 響應曲面法優(yōu)化微波輔助提取黑靈芝孢子多糖工藝研究[J]. 食品科學, 2007, 28(10):200-203.

[3] 覃海元, 黃衛(wèi)萍, 農志榮, 等. 超聲波提取仙人掌中黃酮類物質的研究[J]. 中國食品添加劑, 2008(4):61-62.

[4] 周勝男, 褚翠翠, 陸寧. 食用仙人掌中黃酮類物質的提取研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2008(2):228-230.

[5] 覃海元, 黃衛(wèi)萍, 農志榮, 等. 正交法優(yōu)化仙人掌中黃酮類物質提取條件的研究[J]. 北京工商大學學報:自然科學版, 2007, 25(4):12-14.

[6] 覃海元, 農志榮, 黃衛(wèi)萍, 等. 微波提取仙人掌中黃酮類物質試驗研究[J]. 保鮮與加工, 2008(4):39-40.

[7] 劉敦華, 董文江, 陳正行. 響應面法優(yōu)化超聲波提取枸杞黃酮的工藝研究[J]. 糧油加工, 2010(3):99-103.

[8] 逮家輝, 姜鑫, 李昊龍, 等. 應用響應面法優(yōu)化超聲波法提取甘草中總黃酮的工藝[J]. 吉林大學學報:工學版, 2008, 32(增刊2):294-295.

[9] 張澤志, 高霞, 林鈺, 等. 用響應面法優(yōu)化微波提取花生殼總黃酮工藝[J]. 河南工業(yè)大學學報:自然科學版, 2010, 31(4):33-36.

[10] 宋立華, 鄭遠榮, 孫向軍, 等. 超聲法提取仙人掌總黃酮工藝條件的研究[J].上海交通大學學報:農業(yè)科學版, 2008, 26(1):72-73.

[11] 劉洋, 趙謀明, 楊寧, 等. 響應面分析法優(yōu)化仙人掌多糖提取工藝的研究[J]. 食品與機械, 2006, 22(6):43-44.

[12] 熊子文, 羅麗萍, 張麗麗. 響應面法優(yōu)化野艾蒿總黃酮的超聲波提取工藝[J]. 食品科學, 2010, 31(8):39-41.

[13] 費榮昌. 概率統(tǒng)計解題分析[M]. 南京:江蘇科學技術出版社, 1984:214-219.

[14] 楊寶, 趙謀明, 李寶珍, 等. 荔枝殼黃酮類物質的醇提工藝[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2005, 31(4):144-146.

[15] 劉振學, 黃仁和, 田愛民. 實驗設計與數據處理[M]. 北京:化學工業(yè)出版社, 2005.

[16] 慕運動. 響應面方法及其在食品工業(yè)中的應用[J]. 鄭州工程學院學報, 2001, 22(3):91-94.

Optimization of Extraction for Cactus Flavonoids by Response Surface Methodolgy

ZHU Zhu，LENG Jin-song
(Branch of Food Engineering, Jilin Business and Technology College, Changchun 130062, China)

R284.2

A

1002-6630(2010)22-0185-05

2010-06-25

吉林省教育廳“十一五”科學技術研究項目(吉教科合字[2007]第253號)

朱珠(1960—)，女，教授，碩士，研究方向為食品科學與工程。E-mail：zzabc2008@126.com