沸石負載殼聚糖對高酸蘋果發(fā)酵酒的澄清工藝

席 超，張 贊，閆振華，戴洪義*

(青島農(nóng)業(yè)大學園林園藝學院，山東 青島 266109)

沸石負載殼聚糖對高酸蘋果發(fā)酵酒的澄清工藝

席 超，張 贊，閆振華，戴洪義*

(青島農(nóng)業(yè)大學園林園藝學院，山東 青島 266109)

以魯加6號蘋果發(fā)酵酒為原料，根據(jù)Box-Behnkend的中心組合試驗設(shè)計原理，在單因素的基礎(chǔ)上采用響應面分析法，建立沸石負載殼聚糖澄清蘋果酒的二次多項數(shù)學模型，并以蘋果酒澄清度為響應值和等高線建立響應面，研究沸石負載殼聚糖添加量、處理時間、處理溫度對蘋果酒澄清效果的影響。結(jié)果表明：沸石負載殼聚糖澄清蘋果酒的最佳工藝條件為沸石-殼聚糖澄清劑添加劑量11.6g/L、處理時間47.6min、處理溫度27℃；與常規(guī)法澄清蘋果酒相比，經(jīng)過處理的蘋果酒澄清度提高了16.8%，可溶性蛋白含量、總酚含量均有顯著降低，而總酸、可溶性固形物含量、兒茶素、綠原酸、咖啡酸含量變化不明顯，表兒茶素含量降低。

蘋果酒；沸石；殼聚糖；多酚；澄清

Abstract：Apple cider fermented by “Lujia 6” was used as the material to explore the effect of zeolite-loaded chitosan on the clarification of apple cider through response surface methodology on the basis of single factor experimental results according to the Box-Behnken central composite design principle. A second order quadratic mathematic model was established for the clarification of apple cider. The response values and contour plots were established by the clarity of apple cider to investigate the effects of zeolite-loaded chitosan dosage, treatment time and treatment temperature on clarification efficiency of apple cider.The optimal processing conditions were zeolite-loaded chitosan dosage of 11.6 g/L, treatment time of 47.6 min, and treatment temperature of 27 ℃. Compared with traditional clarification method, the clarity of apple cider treated by zeolite-loaded chitosan was enhanced by 16.8%. The soluble proteins and total phenols in apple cider treated by zeolite-loaded chitosan exhibited an obvious decrease; however, total acids, soluble solids, catechol, chlorogenic acid and caffeic acid did not exhibit obvious change and the epicatechin exhibited a decrease. These investigations can provide theoretical references for the clarification of apple cider.

Key words：apple cider；zeolite；chitosan；polyphenol；clarification

在蘋果酒的生產(chǎn)中，澄清是重要環(huán)節(jié)之一。澄清效果直接影響蘋果酒的最終品質(zhì)。殼聚糖是蘋果酒的一種有效澄清劑[1]，但在酸性條件下，殼聚糖會水解為葡萄糖胺單糖、二聚糖和三聚糖等低聚糖混合物，同時，由于殼聚糖密度較小，從溶液中沉降的速度較慢，澄清時間延長，影響蘋果酒的品質(zhì)。沸石具有空曠的骨架結(jié)構(gòu)，但由于沸石的孔道較小，吸附量較低。李增新等[3]利用沸石負載殼聚糖對陳醋進行澄清，得到透明的高檔陳醋，同時，沸石-殼聚糖對蘋果汁也具備良好的澄清作用[4]。采用“魯加6號”高酸蘋果制備的蘋果酒，酒體酸度較大，為避免因殼聚糖水解使澄清效果下降，本實驗將殼聚糖負載在沸石上做成澄清劑，用于“魯加6號”蘋果酒的澄清。研究最優(yōu)的澄清工藝及澄清對蘋果酒的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“魯加6號”高酸蘋果 青島農(nóng)業(yè)大學園林園藝學院試驗站。沸石(60目) 國藥集團化學試劑有限公司；殼聚糖(脫乙酰度＞92%) 上?？ú┕べQ(mào)有限公司。

菌株：本研究室篩選的SY01酵母菌[5]。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F160型振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；TULTRASPEC 3300 PRO型分光光度計Amersham Biosciences公司；TCP2型全自動測色色差儀北京鑫奧依克光電技術(shù)有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；高效液相色譜儀(美國Agilent 公司1100 系列)，由四元低壓泵、柱溫箱、光電二極管陣列檢測器、自動進樣器以及Agilent色譜工作站組成。

1.3 方法

1.3.1 蘋果酒制備

將“魯加6號”蘋果洗凈，用榨汁機勻速壓榨取果汁，立即并其中添加偏重亞硫酸鉀溶液，使其終質(zhì)量濃度為50mg/L，添加果膠酶和淀粉酶使其終體積濃度均為3.33mL/L。置于50℃恒溫水浴保溫2h，用正壓過濾器三層濾紙過濾后，得到蘋果清汁，將其靜置24h后，按5%(m/m)接種量接入已活化好的SY01菌株低溫發(fā)酵。

1.3.2 沸石-殼聚糖澄清劑制備

用5%的醋酸溶液緩慢溶解殼聚糖，配制成0.5%的殼聚糖溶液。用60mL此溶液將50g沸石調(diào)成糊狀，使之充分浸潤。將此糊狀物加熱干燥，研細，即得沸石負載殼聚糖澄清劑。

1.3.3 澄清度的測定

取1mL樣品，以去離子水為空白，測定680nm處透光率，以T680表示，重復3次，以去離子水為空白，測定波長420nm處的吸光度，以A420表示，重復3次。

1.3.4 單因素試驗

進行沸石負載殼聚糖澄清劑的添加量、處理溫度、處理時間的單因素試驗，每個處理平行試驗3次。

1.3.4.1 澄清劑添加量對澄清度的影響

取10mL樣品于試管中，處理溫度20℃、處理時間5min，添加不同劑量的澄清劑，處理后靜置，取上清液，測定蘋果酒澄清度。

1.3.4.2 處理溫度對蘋果酒澄清度的影響

固定澄清劑添加劑量8g/L，處理時間5min，比較不同處理溫度對澄清效果的影響。

1.3.4.3 處理時間對蘋果酒澄清的影響

固定澄清劑添加劑量8g/L，處理溫度20℃，比較不同處理時間對蘋果酒澄清度的影響。

1.3.5 可溶性蛋白含量的測定

采用Bradford法[6]。

1.3.6 多酚的測定

采用FC法測定蘋果酒中多酚含量[7]，平行試驗3次。

1.3.7 色差的測定

以蒸餾水作對照，用色差儀測定蘋果酒色差，平行試驗3次。

1.3.8 小分子酚類物質(zhì)測定

采用高效液相色譜法(HPLC法)[8]。

樣品的預處理：取25mL已經(jīng)蘋果果酒用1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0左右，加入25mL的乙酸乙酯，用恒溫振蕩器振蕩10min后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，分離出酯相和水相，水相再用25mL的乙酸乙酯萃取一次，合并酯相。酯相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮至干，殘渣溶于25mL超純水中，此為中性酚；水相用6mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2.0左右，再分別用25mL的乙酸乙酯萃取2次，合并酯相，酯相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮至干，殘渣溶于25mL超純水中，此為酸性酚。經(jīng)0.22μm的微孔過濾膜過濾后放在4℃的冰箱中保存?zhèn)溆茫叫性囼?次。

色譜條件：色譜柱：Eclipse XDB-C18(150mm×4.6mm，5μm)；流動相：A為甲醇；B為1%的乙酸溶液(V/V)，梯度洗脫程序；柱溫30℃、流速1.0mL/min。紫外檢測波長280nm，進樣量20μL；檢測器：光電二極管陣列檢測器。

1.3.9 響應面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以蘋果酒澄清度為試驗指標，以澄清劑添加劑量、澄清時間、澄清溫度3個因素為自變量，設(shè)計三因素三水平，共17個試驗點的響應面分析試驗，每個試驗點做3次平行試驗，優(yōu)化澄清工藝。

表1 響應面試驗因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3.10 常規(guī)法澄清蘋果酒的工藝條件

明膠-膨潤土澄清法(工藝條件參照文獻[9])。

1.3.11 可溶性固形物的測定

采用阿貝折射儀測定。以去離子水調(diào)零，測定可溶性固形物，重復3次。

1.3.12 滴定酸測定

用自動電位滴定儀進行測定，重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 澄清劑添加劑量對蘋果酒澄清的影響

圖1 澄清劑添加劑量對蘋果酒澄清的影響Fig.1 Effect of zeolite-loaded chitosan dosage on the clarification of apple cider

由圖1可見，沸石-殼聚糖對高酸蘋果酒具有明顯的澄清作用，在沸石-殼聚糖的添加量為0～8g/L時，透光率隨著添加計量的提高直線增加，添加量為8～10g/L時，透光率值比較高，隨著用量進一步增大，蘋果酒的澄清度反而降低。表明沸石-殼聚糖在添加量低于10g/L時，其對蘋果酒中渾濁物質(zhì)吸附，使蘋果酒的澄清度呈增加趨勢，但進一步加大沸石-殼聚糖的量，其自身可能對澄清造成負面影響。

2.1.2 處理時間對蘋果酒澄清度的影響

圖2 處理時間對蘋果酒澄清度的影響Fig.2 Effect of treatment time on the clarification of apple cider

由圖2可知，不同處理時間對高酸蘋果酒的澄清度存在影響，在處理前30min內(nèi)，透光率變化明顯，隨著處理時間的延長，透光率增加明顯；30～50min時間時，透光率也有增加，但增加緩慢；隨著時間的進一步延長，澄清度并沒有增加，反而降低。表明處理時間過長反而不利于蘋果酒的澄清，可能會使蘋果酒中物質(zhì)發(fā)生過度氧化，使蘋果酒澄清度下降。

2.1.3 處理溫度對蘋果酒澄清度的影響

由圖3可知，在處理溫度為10～20℃時，隨著溫度的提高，蘋果酒的澄清度隨溫度升高而提高，在20～30℃范圍內(nèi)，澄清度達到較大值，隨著溫度的進一步升高，高酸蘋果酒的澄清度下降。表明溫度高于40℃時，可能會使沸石-殼聚糖的吸附能力下降，從而使蘋果酒澄清度下降。

圖3 處理溫度對蘋果酒澄清度的影響Fig.3 Effect of treatment temperature on the clarification of apple cider

2.2 響應面試驗設(shè)計

為了確定澄清最佳工藝條件，選擇澄清劑添加劑量、澄清時間、處理溫度3個因素進行響應面回歸分析。試驗設(shè)計與結(jié)果如表3所示，其中1～12為析因試驗，13～17為中心試驗，用來估計試驗誤差。

表3 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments

對表3的數(shù)據(jù)進行回歸分析，得二次多元回歸方程：Y=97.24+0.26X1+0.73X2－ 1.31X3－0.15X1X2+0.48X1X3+0.30X2X3－1.81X12－1.98X22－3.71X32，對該模型進行方差分析，結(jié)果見表4。

由表4可知，此方程模型達到極顯著水平(P＜0.01)，失擬項各項數(shù)據(jù)分析表明該模型失擬不顯著(P＞0.05)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9237，表明90%的數(shù)據(jù)可以用這個方程解釋。所以可以用次方程來分析和預測沸石負載殼聚糖澄清劑澄清高酸蘋果酒的工藝結(jié)果。同時，從表4可以看出，模型的二次項對澄清的影響極顯著(P＜0.01)，模型的一次項X3對澄清的影響達到顯著(P＜0.05)，二次項對澄清的影響達到顯著(P＜0.05)。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation for the clarification of apple cider

2.3 響應面分析

沸石負載殼聚糖澄清高酸蘋果酒的響應面及其等高線見圖4～6。此3個圖直觀地反映了各個因素對響應值(T680)的影響。

圖4 澄清劑計量和處理時間對澄清度的影響Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between zeolite-loaded chitosan dosage and treatment time on the clarification of apple cider

由圖4可知，響應面的坡度相對較為平緩，表明響應值(高酸蘋果酒澄清度)可以忍受沸石-殼聚糖澄清劑添加劑量和處理時間的改變。在沸石-殼聚糖劑量為10～11g/L時對澄清效果最有利。其預測值為96.15%。等高線呈現(xiàn)近圓形，表明沸石-殼聚糖添加劑量與處理時間交互作用不強。

圖5 澄清劑計量和處理溫度對澄清度的影響Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between zeolite-loaded chitosan dosage and treatment temperature on the clarification of apple cider

由圖5可知，響應面的坡度相對陡峭，表明響應值(高酸蘋果酒澄清度)對處理溫度的改變較對澄清劑添加劑量的改變要敏感。等高線呈現(xiàn)橢圓形，表明兩因素(澄清劑添加劑量，處理溫度)交互作用強度較強。

圖6 處理時間和處理溫度對澄清度的影響Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between treatment time and treatment temperature on the clarification of apple cider

由圖6可知，處理溫度與處理時間兩因素的響應面的坡度相對陡峭，等高線呈現(xiàn)橢圓形，表明響應值對處理溫度的改變比澄清劑添加劑量的改變敏感。

2.4 沸石負載殼聚糖澄清高酸蘋果酒工藝參數(shù)的優(yōu)化和驗證

為了進一步確定方程模擬的最佳點，對所得的回歸方程取一階偏導等于零并整理得：X1=0.90，X2=－0.24，X3=0.40。換算成試驗條件：澄清劑添加劑量11.6g/L，處理時間47.6min，處理溫度27℃。蘋果酒澄清度為96.2%。

通過試驗進一步檢驗方程的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進行澄清試驗，測得蘋果酒的澄清度為95.1%，與方程模擬值基本接近，進一步驗證了模型的可靠性。

2.5 傳統(tǒng)方法澄清蘋果酒的試驗對比

在相同前處理的條件下，比較沸石負載殼聚糖澄清法與傳統(tǒng)蘋果酒澄清法對高酸蘋果酒的澄清效果。

表5 沸石負載殼聚糖與傳統(tǒng)澄清法對蘋果酒澄清的效果比較Table 5 Comparison on clarification effect between traditional clarification method and zeolite-loaded chitosan clarification method

由表5可以看出，采用沸石-殼聚糖對蘋果酒進行澄清，雖然處理時間延長了32.6min，處理溫度比明膠-膨潤土澄清法高2℃，但澄清度卻提高了13.7%，同時沉淀物易于沉降于瓶底且界面明顯，有利于虹吸倒酒。

2.6 沸石負載殼聚糖對高酸蘋果酒中小分子酚類物質(zhì)的影響

以優(yōu)化條件澄清魯加6號高酸蘋果酒，澄清前后蘋果酒中的小分子酚類物質(zhì)液相色譜圖對照，見圖7。

圖7 沸石負載殼聚糖處理前后蘋果酒中小分子酚類液相色譜圖比較Fig.7 Comparison on chromatographs of total phenols in apple cider before and after treatment with zeolite-loaded chitosan

蘋果酒中主要的4種單酚物質(zhì)包括兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素，其含量過高會發(fā)生氧化聚合反應，從而影響蘋果酒的澄清。由圖7可以看出，沸石負載殼聚糖對蘋果酒中兒茶素、綠原酸、咖啡酸影響不大，但能降低高酸蘋果酒中表兒茶素的含量。

2.7 經(jīng)過沸石負載殼聚糖處理后的蘋果酒主要指標的變化

表6 處理后蘋果酒與未處理蘋果酒相關(guān)指標對照Table 6 Comparison of related index in apple cider with and without treatment of zeolite-loaded chitosan

由表6可以看出，沸石-殼聚糖不影響高酸蘋果酒的滴定酸和可溶性固形物，但可以使蘋果酒中的可溶性蛋白，總酚含量降低，同時經(jīng)過處理的蘋果酒的A420nm、黃色色差、總色差值也有顯著降低。

3 討論與結(jié)論

3.1 采用沸石-殼聚糖對高酸蘋果發(fā)酵酒澄清效果明顯。最優(yōu)澄清條件為沸石-殼聚糖澄清劑添加劑量11.6 g/L、處理時間47.6min、處理溫度27℃。在此條件下澄清蘋果酒澄清度可達95.1%；經(jīng)過處理后，蘋果酒中主要的小分子酚類物質(zhì)[10]——兒茶素、綠原酸、咖啡酸含量變化不大，表兒茶素含量降低?？扇苄缘鞍?，總酚含量均有降低，總酸、可溶性固形物含量不變。

3.2 試驗發(fā)現(xiàn)沸石-殼聚糖澄清劑對“魯加6號”高酸蘋果酒中兒茶素、綠原酸、咖啡酸影響不大，其可能原因為“魯加6號”蘋果果實中上述幾種小分子酚類物質(zhì)含量低，澄清對其影響不明顯。澄清對可溶性蛋白質(zhì)、總酚含量的影響，表明沸石-殼聚糖澄清劑對可溶性蛋白、總酚物質(zhì)有吸附作用。蘋果酒中多酚與蛋白質(zhì)可以發(fā)生聚合[11]。沸石-殼聚糖澄清劑通過吸附多酚、可溶性蛋白質(zhì)，可以降低二者聚合的發(fā)生。

3.3 由于蘋果酒中的香味物質(zhì)，包括脂類、醇類等物質(zhì)。采用沸石-殼聚糖澄清法，是否會影響蘋果酒中的香味物質(zhì)含量，還需進一步研究。

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Effect of Zeolite-loaded Chitosan on the Clarification of Apple Cider

XI Chao，ZHANG Zan，YAN Zhen-hua，DAI Hong-yi*
(College of Horticulture and Landscape, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

TS255.44

A

1002-6630(2010)22-0164-06

2010-02-01

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2008BAD92B01)；國家現(xiàn)代蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目；山東良種產(chǎn)業(yè)化工程項目

席超(1983—)，男，碩士研究生，研究方向為果樹育種。E-mail：xichao52033@163.com

*通信作者：戴洪義(1956—)，男，教授，博士，研究方向為果樹遺傳育種與生物技術(shù)。E-mail：hydai@qau.edu.cn