迎春花抑菌活性物提取工藝

羅玉燕，盧成瑛,,*，伍 鋼，桂克印

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000；2.吉首大學(xué) 湖南省林產(chǎn)化工工程重點實驗室，湖南 張家界 427000)

迎春花抑菌活性物提取工藝

羅玉燕1，盧成瑛1,2,*，伍 鋼2，桂克印2

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000；2.吉首大學(xué) 湖南省林產(chǎn)化工工程重點實驗室，湖南 張家界 427000)

目的：優(yōu)化迎春花花中抑菌活性物質(zhì)的提取工藝。方法：以抑菌效果為指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定提取溶劑的體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時間進(jìn)行4因素3水平正交試驗。結(jié)果：最佳提取工藝條件為：溶劑為體積分?jǐn)?shù)90%乙醇溶液，60℃水浴加熱2h；提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、藤黃八疊球菌和變形桿菌的的最小抑菌濃度均為0.125g/mL，最小殺菌濃度均為0.25g/mL；提取物經(jīng)強(qiáng)酸及高溫處理后抑菌效果不明顯，在堿性環(huán)境、紫外光、氧化還原劑處理后抑菌活性穩(wěn)定；提取物的乙酸乙酯和正丁醇部位具有抑菌活性。結(jié)論：本實驗所建立的工藝方法可應(yīng)用于迎春花花中抑菌活性物質(zhì)的提取。

迎春花花；提??；抑菌活性

Abstract：Objective:To optimize the extraction processing of antibacterial substances fromJasminum nudiflorumLindl flowers. Methods:On the basis of antibacterial activity as an index, orthogonal experiments were used to investigate the effects of solvent concentration, extraction temperature and extraction time on extraction rate of antibacterial substances fromJasminum nudiflorumLindl flowers. Results:The optimal extraction conditions were 90% ethanol, extraction temperature of 60 ℃ and extraction time of 2 h. The extract fromJasminum nudiflorumLindl flowers had the minimum inhibitory concentration of 0.125 g/mL and the minimum bactericidal concentration of 0.25 g/mL forStaphylococlus aureus,Sarcina lutea,Bacillus subitilis,Proteusbacillus vulgarisandEscheichia coli. Strong acid and heating treatments of the extract could result in the loss of antibacterial effect. On the other hand, antibacterial activity of the extract was not affected by UV, oxidants and reductants in alkaline environments. Antibacterial substances were existed in ethyl acetate and n-butanol phase during extraction process. Conclusion:The extraction processing in this study is feasible to extract bioactive substances with antibacterial activity fromJasminum nudiflorumLindl flowers.

Key words：flower ofJasminum nudiflorumLindl；extract；bacteriostatic activity

木犀科茉莉花屬植物迎春花(Jasminum nudiflorumLindl.)在長江流域各地廣有栽培，其花、葉亦為湘西民間常用草藥。葉苦、平，可清熱解毒、止血、止痛，用于治療跌打損傷、外傷出血、口腔炎、婦科炎癥、癰癤腫毒和外陰搔癢等癥?；ǔＷ鞑栾嫞湮陡?、澀、平，清熱利尿、解毒，可治療頭痛發(fā)熱、泌尿系統(tǒng)感染和下肢潰瘍[1]。文獻(xiàn)記載迎春花的花、葉含丁香甙、迎春花苷和迎春花苦味質(zhì)，有清熱解毒之功效[2]。國內(nèi)外已有迎春花葉和花中化學(xué)成分報道[3-7]。為有效地開發(fā)利用迎春花這一豐富的資源植物，本實驗對迎春花花中的抑菌活性物的提取進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

迎春花花：2010年4至5月2010年4～5月采于吉首大學(xué)校園內(nèi)，經(jīng)吉首大學(xué)城鄉(xiāng)資源與規(guī)劃學(xué)院植物分類學(xué)廖博儒教授鑒定，45℃烘干，粉碎。

金黃色葡萄球菌(Staphylococlus aureus1.879)、大腸桿菌(Escheichia coli1.797)、藤黃八疊球菌(Sarcina lutea1.880)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subitilis1.1849)、變形桿菌(Proteusbacillus vulgaris1.491)菌株均購于中國菌種保藏中心，本實驗室冷凍保藏。

試劑為分析純。

KQ-250E超聲儀 昆山超聲儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；RE-540旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 Yamato公司；HM-20S pH酸度計 TOA電子公司；PW/10-002培養(yǎng)箱 重慶實驗設(shè)備廠；CCV-1311超凈工作臺、SM-52高壓蒸汽滅菌鍋、AEG-220電子天平 日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 迎春花抑菌活性物質(zhì)提取工藝確定

1.2.1.1 單因素提取試驗

提取溶劑體積分?jǐn)?shù)的確定：在確定水浴加熱提取時間3h、提取溫度60℃的條件下，以1:30的料液比分別用蒸餾水、體積分?jǐn)?shù)10%～90%乙醇溶液和無水乙醇進(jìn)行提取，比較不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取迎春花花中抑菌活性物質(zhì)的抑菌活性的影響。

加熱提取溫度的確定：在確定水浴加熱提取時間為3h，及上一實驗確定的提取溶劑體積分?jǐn)?shù)的條件下，以1:30的料液比在15、30、45、60、75、90℃的溫度條件下提取，比較不同提取溫度對迎春花中抑菌活性物質(zhì)的抑菌活性的影響。

超聲輔助提取時間的確定：在上述試驗確定的提取溫度和提取溶劑濃度下，以1:30的料液比分別進(jìn)行超聲波處理，比較不同超聲時間對提取迎春花中抑菌活性物質(zhì)的抑菌活性的影響。

加熱提取時間的確定：在上述單因素最佳條件下，以1:30的料液比在水浴鍋中加熱0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h以確定提取時間對迎春花中抑菌活性物質(zhì)的抑菌活性的影響。

1.2.1.2 正交試驗

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

根據(jù)上述單因素試驗確定的條件范圍，用乙醇作溶劑，以溶劑體積分?jǐn)?shù)(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)、超聲時間(D)四因素三水平，選擇L9(34)正交試驗進(jìn)行迎春花花中抑菌活性物質(zhì)提取的優(yōu)化試驗(表1)，并進(jìn)行方差分析，得出最佳提取條件。

取一定量干燥迎春花加入適量溶劑水浴加熱提取(液固比30:1)，濾液減壓濃縮至生藥質(zhì)量濃度為1g/mL，檢測各提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌，藤黃八疊球菌及枯草芽孢桿菌生長的抑制活性，方差分析得最佳活性提取物的提取方法。

1.2.2 抑菌活性測定[8]

在盛有100片Φ6mm無菌濾紙片的小瓶中加入1mL提取液，45℃烘干備用。將試驗菌種接于試管斜面，37℃、24h培養(yǎng)，重復(fù)兩次活化菌種；向活化菌種管中加入適量無菌生理鹽水，刮取菌苔、混勻，麥?zhǔn)媳葷崤涑?08CFU/mL的菌懸液備用。在超凈工作臺上向營養(yǎng)平板中分別加入0.1mL菌懸液，L型玻棒涂布均勻，將藥敏紙片等距放入含菌平板，37℃、12h培養(yǎng)后開始觀測記錄結(jié)果。另設(shè)蒸餾水為陰性對照，提取溶劑為空白對照，1mg/mL黃連素為陽性對照。

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)測定

采用試管二倍稀釋法測定最小抑菌濃度，稱取最佳提取條件下提取的化合物1g置于小試管中，加入無菌培養(yǎng)基1.0mL，然后取出0.5mL放入第2管中，加入培養(yǎng)基0.5mL，依次類推，稀釋成不同濃度，再用刻度滴管加入濃度為5×106CFU/mL(麥?zhǔn)媳葷?的各種菌液0.05mL，充分搖勻，使各試管的菌液濃度為5×105CFU/mL，含藥量分別為1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312g/mL，置37℃擺床(200r/min)中培養(yǎng)16～24h觀察結(jié)果，觀察試管澄清度，若液體培養(yǎng)基混濁，表示細(xì)菌生長，若液體培養(yǎng)基完全清亮，表示無細(xì)菌生長。無細(xì)菌生長的最小濃度為最小抑菌濃度。設(shè)未加菌液為空白對照，黃連素為陽性對照。

將無細(xì)菌生長的液體培養(yǎng)基中取出0.1mL涂布平板，置37℃溫箱中培養(yǎng)16～24h觀察有無細(xì)菌生長。無細(xì)菌生長的最小濃度為最小殺菌濃度。

1.2.4 抑菌活性穩(wěn)定性實驗[9-10]

1.2.4.1 酸堿穩(wěn)定性實驗

用HCl、NH4OH稀釋液將最佳條件下提取的提取物的pH值分別調(diào)至2、4、5、6、7、8、9、10、12，K-B紙片法測定抑菌活性。

1.2.4.2 熱穩(wěn)定性實驗

試管分裝適量提取物，置70、85、100、121℃處理15min，K-B紙片法測定抑菌活性。

1.2.4.3 紫外光處理試驗

將5mL提取液分裝于10cm培養(yǎng)皿中，置紫外燈(256nm，6W，樣距25cm)下照射不同時間，K-B紙片擴(kuò)散法測定抑菌活性。

1.2.4.4 氧化還原劑處理實驗

于試管提取物中分別添加0.5%和1%的VC，0.25%和0.5% Na2SO3，0.25%和0.5% H2O2，處理15min，KB紙片法測定抑菌活性。

1.2.5 抑菌活性物的初步分離

將90%乙醇的提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取3次，將各萃取液及萃余水相適量濃縮至藥液質(zhì)量濃度為1g/mL，K-B紙片法測定抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳提取條件測定

2.1.1 單因素試驗結(jié)果

圖1 提取溶劑體積分?jǐn)?shù)對抑菌活性物的影響Fig.1 Effect of solvent concentration on antibacterial activity of extract

由圖1可以看出，當(dāng)提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)小于50%時，提取物對5種試驗菌沒有抑菌效果，當(dāng)隨著提取溶劑體積分?jǐn)?shù)的提高，提取物的抑菌效果越來越明顯，到90%時達(dá)到最大，所以選擇90%的乙醇體積分?jǐn)?shù)作為迎春花花中抑菌活性物的最適提取體積分?jǐn)?shù)。

圖2 加熱提取溫度對抑菌活性物的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on antibacterial activity of extract

圖3 超聲提取時間對抑菌活性物的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on antibacterial activity of extract

由圖2得出，水浴加熱提取時，隨著溫度的升高，抑菌活性物對5個受試細(xì)菌的抑菌效果均明顯增大，但超過60℃時開始下降，所以60℃左右為水浴加熱提取的最佳溫度。

從圖3的超聲提取時間對抑菌活性物的影響可以看出，超聲波處理后，活性物的抑菌活性隨超聲時間的增加并無明顯變化。

圖4 加熱提取時間對抑菌活性物的影響Fig.4 Effect of extraction time on antibacterial activity of extract

由圖4可知，水浴加熱提取時間對活性物的抑菌活性影響較大，在加熱1～3h之間活性物的抑菌效果較明顯。

2.1.2 正交試驗結(jié)果

表2 正交試驗結(jié)果直觀分析表Table 2 Results of orthogonal experiments

正交試驗結(jié)果的直觀數(shù)據(jù)分析表明，R3＞R4＞R1＞R2，即因素C影響最大，因素D、A次之，因素B影響最小，方差分析結(jié)果表明，各因素均無顯著影響，即因素影響主順序為C、D、A、B。提示在迎春花花中抑菌成分提取時水浴加熱的方法可取，但時間應(yīng)當(dāng)控制好，而超聲波處理顯著降低其抑菌活性，故不宜做超聲波處理。

直觀分析和方差分析得A2B2C2D1，即90%乙醇、60℃、2h、不超聲為迎春花花中抑菌活性物提取最佳條件。以此作為以后實驗提取物的提取條件(表2、3)。

表3 正交試驗方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments

2.2 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測定

表4 迎春花花提取物最小抑菌濃度測定Table 4 Minimum inhibitory concentration of the extract fromJasminum nudiflorumLindl flowers

迎春花花提取物對5個受試菌的最小抑菌濃度均為0.125g/mL(表4)，對5個受試菌的最小殺菌濃度均為 0.25g/mL(表 5)。

表5 迎春花花提取物最小殺菌濃度測定Table 5 Minimum bactericidal concentration of the extract fromJasminum nudiflorumLindl flowers

2.3 提取物抑菌活性穩(wěn)定性實驗

2.3.1 酸堿穩(wěn)定性

實驗表明提取物堿處理后抑菌活性較為穩(wěn)定，酸對其活性影響較大。pH值≤2時，受試菌沒有出現(xiàn)明顯的生長抑制，但pH值≥4時，抑菌活性較為穩(wěn)定(表6)。

2.3.2 熱穩(wěn)定性

提取液經(jīng)高溫處理后進(jìn)行抑菌活性測定，結(jié)果表明高溫處理對其抑菌活性有明顯影響(表7)。

2.3.3 紫外光處理實驗

提取物經(jīng)過紫外光處理后均具強(qiáng)抑菌活性，表明紫外光處理對其抑菌活性無顯著影響(表8)。

2.3.4 氧化還原劑處理實驗

提取物經(jīng)氧化還原劑處理后仍具有強(qiáng)抑菌活性，提示提取液抑菌活性物對強(qiáng)氧化還原劑具有較高的穩(wěn)定性(表9)。

表6 酸堿處理后提取物的抑菌圈直徑(±s,n=5)Table 6 Inhibition zone diameters of the extract with acid treatments (±s,n=5)mm

表6 酸堿處理后提取物的抑菌圈直徑(±s,n=5)Table 6 Inhibition zone diameters of the extract with acid treatments (±s,n=5)mm

注：“－”表示沒有明顯抑菌圈(下同)；**.P＜0.01。

受試菌pH未處理 2 4 6 7 8 10 12金黃色葡萄球菌 14.5±0.41 － ** 15.0±0.71 14.7±1.25 16.8±0.24 15.3±0.47 15.2±0.85 15.2±0.62枯草桿菌 17±0 － ** 17.2±0.47 17±0.71 18.3±0.47 17.5±1.47 15.7±0.47 16.7±0.47大腸桿菌 16.3±0.47 － ** 17±0 17±0.71 16.7±0.47 15.2±1.31 14.7±0.94 15.7±0.94變形桿菌 15.3±0 － ** 15.2±0.62 16.0±0.65 16.3±0.12 14.8±0.42 15.0±0.24 16.1±0.16藤黃八疊球菌 14.7±0.51 － ** 14.8±0.47 15.0±1.20 15.2±0.38 15.3±0.40 15.5±0.35 14.7±0.20

表7 熱處理后提取物的抑菌圈直徑(±s,n=5)Table 7 Inhibition zone diameters of the extract with heating treatments (±s,n=5)mm

表7 熱處理后提取物的抑菌圈直徑(±s,n=5)Table 7 Inhibition zone diameters of the extract with heating treatments (±s,n=5)mm

熱處理溫度與時間未處理 70℃、30min 70℃、1h 85℃、30min 85℃、1h 100℃、30min 100℃、1h 121℃、20min金黃色葡萄球菌 17.5±0.41 16±0.82 16.8±0.24 14.7±0.47 12±0.82 10.2±0.62 8±0.82 —枯草桿菌 17±0 17±0 17.7±0.24 16.3±0.47 15.3±0.25 13.7±0.24 7.2±0.85 —大腸桿菌 17.3±0.47 16.7±0.47 17.3±0.94 15.5±0.41 13.8±0.24 9.7±0.24 8.5±0 —變形桿菌 16.8±0.24 15.8±0.23 16.1±0.51 15.5±0.26 14.4±0.23 10.5±0.15 8.9±0 —藤黃八疊球菌 15.3±0.21 14.8±0.25 13.8±0.26 12.5±0.56 11.8±0.60 9.80±0.30 9.0±0.26 —受試菌

表8 365nm紫外光處理后提取物的抑菌圈直徑(±s,n=5)Table 8 Inhibition zone diameters of the extract with UV treatment at 365 nm (±s,n=5)mm

表8 365nm紫外光處理后提取物的抑菌圈直徑(±s,n=5)Table 8 Inhibition zone diameters of the extract with UV treatment at 365 nm (±s,n=5)mm

15 30金黃色葡萄球菌 17±0 18.3±0.94 16.5±0.41 17.2±0.62枯草桿菌 16.7±0.94 17.7±0.94 17.8±1.03 18.2±0.85大腸桿菌 17±0.41 18±0 17.5±0.41 18.5±0.41變形桿菌 15.2±0.23 16.0±0.50 15.7±0.30 14.8±0.27藤黃八疊球菌 14.8±0.68 15.2±0.40 15.7±0.58 14.3±0.79受試菌 365nm紫外光處理時間/ min 05

表9 氧化還原劑處理后提取物的抑菌圈直徑(±s,n=5)Table 9 Inhibition zone diameters of the extract with oxidant and reductant treatments (±s,n=5)mm

表9 氧化還原劑處理后提取物的抑菌圈直徑(±s,n=5)Table 9 Inhibition zone diameters of the extract with oxidant and reductant treatments (±s,n=5)mm

空白對照未處理 0.5% VC 1% VC 0.25% Na2SO30.5% Na2SO30.25% H2O20.5% H2O2 1% VC 0.5% Na2SO30.5% H2O2金黃色葡萄球菌 16±0 16.7±0.24 16.2±1.20 17.1±0.83 16±0.72 15.3±0.9018.2±0.45 － － －枯草桿菌 15.7±0.92 16.4±0.31 17.2±0.74 17.3±0.27 16±0 15.6±0.64 16±0.62 － － －大腸桿菌 16±0.21 16±0.82 16.2±0.62 18±0 15.3±1.25 15.3±1.2517.7±0.64 － － －變形桿菌 15.6±0.32 15.8±0.75 16.0±0.56 15.4±0.42 15.8±0.32 14.8±0.2515.0±0.42 － － －藤黃八疊球菌 14.8±0.80 15.3±0.32 15.3±0.45 15.8±0.43 16.0±0.42 15.7±0.5215.5±0.80 － － －受試菌 氧化還原劑處理

2.4 抑菌活性物的初步分離

采用溶劑萃取法對抑菌活性物進(jìn)行初步分離，各部位組分抑菌實驗表明迎春花花中抑菌活性物質(zhì)可溶于乙醇、乙酸乙酯和正丁醇(表10)。

表10 不同溶劑萃取物的抑菌圈直徑Table 10 Inhibition zone diameters of the extract from different extraction solvents mm

3 結(jié) 論

本研究對迎春花提取物的抑菌活性進(jìn)行系統(tǒng)研究，通過正交試驗確證最佳提取條件為90%乙醇、60℃、水浴加熱2h；提取物對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、變形桿菌和藤黃八疊球菌的最小抑菌濃度為0.125g/mL；提取物在強(qiáng)酸性環(huán)境中不穩(wěn)定，紫外光、氧化還原劑處理對抑菌效果沒有影響，但高溫處理后以及在堿性環(huán)境中對其抑菌有影響。實驗表明迎春花提取物具有一定的抑菌活性，迎春花花的乙醇提取物具有較明顯的抑菌活性，在醫(yī)藥和食品防腐領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Extraction Processing of Antibacterial Substances fromJasminum nudiflorumLindl Flowers

LUO Yu-yan1，LU Cheng-ying1,2,*，WU Gang2，GUI Ke-yin2
(1. College of Biology Resource and Environmental Sciences, Jishou University, Jishou 416000, China；2. Key Laboratory for Forest Products and Chemical Industry Engineering of Hunan, Jishou University, Zhangjiajie 427000, China)

S685.18

A

1002-6630(2010)22-0129-05

2010-06-30

湖南省自然科學(xué)基金項目(03JJY6016)

羅玉燕(1983—)，女，碩士研究生，研究方向為植物生態(tài)學(xué)。E-mail：luoyuyan2008@yahoo.com.cn

*通信作者：盧成瑛(1952—)，女，教授，研究方向為植物資源開發(fā)利用。E-mail：lcy2109@163.com