板栗殼色素的提取工藝優(yōu)化及其抑菌性能

周國燕，桑迎迎，宮春波，曹斌宏，王愛民

(1.上海理工大學(xué)低溫醫(yī)學(xué)與食品冷凍研究所，上海 200093；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109)

板栗殼色素的提取工藝優(yōu)化及其抑菌性能

周國燕1，桑迎迎1，宮春波2，曹斌宏1，王愛民1

(1.上海理工大學(xué)低溫醫(yī)學(xué)與食品冷凍研究所，上海 200093；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109)

用乙醇法和超聲波法從板栗殼中提取色素，并對兩種方法進(jìn)行比較，同時研究板栗殼中色素的抑菌性及其應(yīng)用。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示：超聲波具有省時、節(jié)能、提取率高等優(yōu)點(diǎn)；超聲波協(xié)助提取法的較優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、超聲波功率200W、作用時間8min。板栗殼色素對枯草芽胞桿菌、大腸桿菌、黑曲霉和青霉具有抑制作用對蘋果汁有一定的防腐效果。

板栗殼；色素；超聲波；提??；抑菌性

Abstract：Brown pigment was extracted from chestnut shell by both alcohol-method and ultrasound-method. Both methods were analyzed and compared. The antibacterial effect and application of pigment from chestnut shell were also investigated.Results indicated that the ultrasound-method could save time and energy to obtain high extraction efficiency. The optimal conditions for ultrasonic extraction were ethanol concentration of 40% ultrasonic power of 200 W, and extraction time of 8 min.The pigment from chestnut shell had antibacterial effect againstBacillus subtilis,Escherichia coli,ActinomyceteandAspergillus niger. Therefore, the pigment has preservative effect on juice and can be developed to be a natural food preservative.

Key words：chestnut shell；pigment；ultrasonic；extraction；antibacterial effect

板栗(Castanea mollissimaBlume)屬山毛櫸科(Fagaceae)植物，為落葉喬木。我國種植板栗已有3000多年的歷史，近年來我國板栗的栽培面積和產(chǎn)量迅猛增加，產(chǎn)量居世界第一。板栗果肉的開發(fā)利用一直受到廣泛關(guān)注，但板栗殼作為加工廢棄物基本上未得到有效開發(fā)與利用。板栗殼中含有一定量的色素物質(zhì)，板栗殼色素屬于黃酮類色素[1-2]，是一種水溶性好、著色力強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定的天然棕色素，且具有一定的抗氧化和抑菌作用，同時具有較高的熱穩(wěn)定性，是目前世界上并不多見的性質(zhì)穩(wěn)定的天然食用色素之一[3-7]，具有很高的開發(fā)價值。

天然色素存在于植物組織細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破碎程度直接影響著提取效率。目前板栗殼色素的提取主要有水溶液提取、堿提取法、乙醇提取、超聲波提取及微波提取法。研究發(fā)現(xiàn)前3種方法提取率較低、耗時，不利于提高生產(chǎn)效益。超聲波提取技術(shù)是利用超聲波的空化作用，提高細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性[8]，加速細(xì)胞內(nèi)色素的溶出。張亞平[9]研究用2.0% NaOH溶液提取板栗殼色素，李紅等[10]用水溶液提取色素3h，吳雪輝等[11]用乙醇提取3h，提取率能達(dá)到50%，但隨著時間的增加，溶液蒸發(fā)得快，乙醇損失較多。超聲波法提取提取率高、時間短，但能耗高。應(yīng)用超聲波法提取的研究目前還比較少。李云雁等[2]研究的超聲波法協(xié)助提取板栗殼色素，是在超聲波場中進(jìn)行兩次浸提，每次浸提時間較長。因介質(zhì)吸收超聲波后將其轉(zhuǎn)化成熱能，導(dǎo)致物料內(nèi)部溫度升高，長時間的超聲作用使浸提溫度明顯上升，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究通過先進(jìn)行超聲提取再進(jìn)行乙醇水浴浸提，大幅縮短超聲提取時間，減少溫度對實(shí)驗(yàn)的影響，希望能在醇提的基礎(chǔ)上改進(jìn)提取工藝、縮短時間、降低成本。

吳雪輝[12]、李云雁[13]等對板栗殼色素的抑菌性分別進(jìn)行了研究，但對不同菌種的抑制作用差別較大，也沒有進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用的防腐實(shí)驗(yàn)，故本實(shí)驗(yàn)針對影響食品加工、貯藏的幾種常見菌種重新考察抑菌性，并將板栗殼色素粗提物應(yīng)用到新鮮蘋果汁中考察實(shí)際抑菌效果，系統(tǒng)探討該色素的抑菌性能。為板栗殼色素的開發(fā)利用提供依據(jù)，有助于其作為天然有效的食品防腐劑在工業(yè)中應(yīng)用推廣。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

板栗殼(市售板栗剝殼而得，粉碎至50目)；蘋果市購；無水乙醇(AR)、可溶性淀粉、KNO3、MgSO4、FeSO4·7H2O 天津市博迪化工有限公司；PDA培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、磷酸氫二鉀(AR) 天津市巴斯夫化工有限公司；瓊脂(BR) 石獅市瓊脂粉加工廠；氯化鈉(AR) 濟(jì)南試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

天孚牌JYT-S架盤藥物天平 常熟市金羊砝碼儀器有限公司；AP250D電子分析天平 奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司；LFJ粉碎機(jī) 嵊州市新穎粉碎設(shè)備有限公司；SPX型智能生化培養(yǎng)箱 寧波東南儀器有限公司；DHP-9082培養(yǎng)箱 龍口市先科儀器公司；UV-2100分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；TGL-16C高速臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；UH-1200B超聲波細(xì)胞粉碎儀 天津奧特賽思斯儀器有限公司；DZX-6050B干燥箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HW.SY21-K6電熱恒溫水浴鍋 北京市長風(fēng)儀器儀表公司；RE52-98真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫(yī)用核子儀器公司；SQ380-C榨汁機(jī) 上海帥佳電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色素的提取

1.3.1.1 乙醇法提取板栗殼色素

工藝流程：板栗殼→去雜→干燥→粉碎→乙醇溶液浸提→離心分離→濾液→真空減壓濃縮→干燥→產(chǎn)品。

將干燥的新鮮板栗殼放入粉碎機(jī)中，粉碎(50目)，取適量粉料投入錐形瓶中，加入適量提取劑(乙醇溶液)，搖勻，水浴加熱浸提。再用離心機(jī)分離(4000r/min，15min)，將所得濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮(45℃，真空0.09MPa)，濃縮至溶液呈黏稠狀，濃縮液在干燥箱中干燥(60℃)至質(zhì)量恒定。

影響板栗殼色素提取率的因素很多，板栗殼色素易溶于極性較大的溶劑而不溶或難溶于非極性溶劑[14]，試驗(yàn)選取乙醇為萃取劑。通過系列單因素試驗(yàn)和參考相關(guān)文獻(xiàn)[15]，選取提取乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、料液比、水浴溫度、浸提時間4個因素，選用L9(34)正交試驗(yàn)表[16]，提取樣液稀釋25倍后在277nm波長處測定吸光度，以其吸光度為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定較優(yōu)工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)因素水平見表1。λmax=277nm作為板栗殼色素吸光度的特征波長[1]。

表1 乙醇法正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for alcohol extraction method

據(jù)劉平等[1]繪制出板栗殼色素質(zhì)量濃度C與吸光度A的標(biāo)準(zhǔn)曲線，板栗殼色素在0.012～0.2mg/mL范圍內(nèi)，吸光度與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為C=0.0695A－0.0001，R2=0.9999。式中：A為吸光度；C為板栗殼色素的質(zhì)量濃度/(mg/mL)。色素提取率計算式：提取率/%=[CV/(1000m)]×100。式中：V為提取液體積/mL，m為板栗殼粉末用量/g。

1.3.1.2 超聲波法協(xié)助提取法

工藝流程：板栗殼→去雜→干燥→粉碎→以乙醇溶液為溶劑，在超聲波場中浸提→水浴浸提→離心分離(4000r/min，15min)→濾液→真空減壓濃縮→干燥→產(chǎn)品。

向裝有板栗殼粉末的小燒杯中加入適量的乙醇溶液，進(jìn)行攪拌，將燒杯的口部用塑料薄膜封住以防乙醇揮發(fā)。將超聲波探頭插進(jìn)料液內(nèi)，探頭不能碰到燒杯壁及底部。在超聲波場中作用后，再進(jìn)行水浴浸提。

試驗(yàn)選取提取乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波功率和作用時間3個因素，在277nm波長處測定吸光度，以吸光度為指標(biāo)進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)，確定超聲波協(xié)助提取的最佳工藝。正交試驗(yàn)因素水平見表2。

表2 超聲波法正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for ultrasonic extraction method

1.3.2 板栗殼提取物的抑菌作用

1.3.2.1 抑菌譜

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、青霉、黑曲霉、放線菌為指示菌。細(xì)菌菌懸液、霉菌菌懸液的制備：將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌分別接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[17]斜面上，黑曲霉、青霉接種到PDA培養(yǎng)基[18]斜面上，放線菌接種到高氏一號培養(yǎng)基[19]斜面上。細(xì)菌于37℃培養(yǎng)2d，霉菌于28℃培養(yǎng)3d。取活化好的菌種斜面，用無菌生理鹽水配制成(1～10)×106CFU/mL的菌懸液[20]，備用。

濾紙片法測定抑菌作用[21]：用無菌鑷子將滅菌的直徑為11mm的圓形濾紙片分別浸入無菌水、板栗殼提取液、40%的乙醇和5%苯酚溶液中，備用。用滅菌的移液管移取已制備好的菌懸液0.5mL，滴入已經(jīng)倒有相應(yīng)固體培養(yǎng)基的平皿表面，用涂布器使其均勻分布在培養(yǎng)基的表面。用無菌鑷子夾取浸有以上4種液體的濾紙片，放入含菌平皿中，每皿3片。霉菌和放線菌用點(diǎn)種法接種，然后在靠近接種點(diǎn)的周圍放上濾紙片，每皿3片。以上均在無菌工作臺中操作。在相應(yīng)的溫度下培養(yǎng)一定時間，觀察抑菌圈的大小，量取抑菌圈直徑，取平均值。

1.3.2.2 板栗殼色素抑菌作用的應(yīng)用

取4個新鮮的蘋果，去皮，榨汁，分裝在4個三角瓶中，每瓶50mL。板栗殼色素在較低質(zhì)量濃度下有明顯的抑菌作用[13]。向三角瓶中分別加入質(zhì)量濃度為3、2、1、0.5g/100mL的板栗殼色素提取液10mL，對照試驗(yàn)組用40%的乙醇溶液。用滅好菌的移液管分別吸取0.5mL上述溶液和菌懸液于平板上，用涂布器使其均勻分布在培養(yǎng)基的表面。在相應(yīng)的溫度下培養(yǎng)一定時間，觀察抑菌作用，以細(xì)菌總數(shù)為指標(biāo)計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇法提取板栗殼色素正交試驗(yàn)

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiments for alcohol extraction method

表4 正交試驗(yàn)方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments for alcohol extraction method

研究報道板栗殼色素為黃酮類色素[21]，易溶于乙醇溶液。從表3可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、水浴溫度、浸提時間均對板栗殼色素提取率有一定影響。極差分析結(jié)果表明，影響板栗殼棕色素提取的主要因素是提取溫度，次要因素是料液比，再次因素是浸提時間，影響最小的是乙醇體積分?jǐn)?shù)，其最佳組合是A2B1C3D3。因此，從板栗殼中提取棕色素的最佳工藝條件是：乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1:8(g/mL)、水浴溫度80℃、浸提時間80min。隨提取溫度、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，色素的提取率不斷提高。經(jīng)方差分析(表4)，水浴溫度對板栗殼色素提取率的影響最大，且具有顯著性差異。隨提取溫度的上升，色素提取率提高趨勢增大。

2.2 超聲波協(xié)助提取法正交試驗(yàn)

表5 L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of orthogonal experiments for ultrasonic extraction method

由表5可見，乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)、超聲波作用時間和超聲波功率對板栗殼色素提取率有一定影響，影響依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲波作用時間>超聲波功率。在α=0.05下的方差分析顯示以上3個因素對色素提取率影響的顯著性不明顯。提取率最高試驗(yàn)是第4組，即A2B1C2，因此最佳的提取工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、超聲波功率200W、作用時間8min。在此工藝參數(shù)下提取率較高，為5.94%，且能耗小，提取時間縮短。

2.3 乙醇法與超聲波協(xié)助提取法的比較

超聲波協(xié)助提取是利用超聲波的空化作用，使液體微粒之間發(fā)生猛烈撞擊，提高細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，加速細(xì)胞內(nèi)色素的溶出，提高提取效率。在相同的試驗(yàn)條件下，超聲波200W協(xié)助提取8min比僅用乙醇法浸提色素的提取率高了23%，可在較短的時間內(nèi)從板栗殼中萃取出較多的色素成分，超聲時間較短，料液溫度變化小，減少浸提時溫度上升對浸提率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較準(zhǔn)確。

從能耗、時間以及提取劑消耗的經(jīng)濟(jì)角度來看，超聲波具有省時、節(jié)能、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，因此超聲波的協(xié)助提取作用較顯著。

2.4 色素的抑菌作用

2.4.1 抑菌譜

濾紙片實(shí)驗(yàn)結(jié)果：40%的乙醇溶液對6種指示菌無抑制作用。板栗殼色素提取液對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、黑曲霉、青霉有抑制作用，其中對枯草芽孢的抑制作用最為顯著，抑菌順序?yàn)榭莶菅挎邨U菌＞青霉＞大腸桿菌＞黑曲霉。對金黃色葡萄球菌和放線菌無抑制作用。5%苯酚溶液使微生物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性從而達(dá)到抑菌作用。色素提取液對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、青霉的抑制作用強(qiáng)于5%的苯酚溶液。指示菌的抑菌圈直徑見表6。

表6 指示菌抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Table 6 Comparison on antibacterial effects on experimental bacteria

2.4.2 板栗殼色素抑菌作用的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

板栗殼提取物中含有黃酮類物質(zhì)，這些物質(zhì)的分子中一般都含有鄰位酚羥基，具有與金屬離子絡(luò)合以及與蛋白質(zhì)的強(qiáng)結(jié)合能力，極大地影響到微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和細(xì)胞代謝的活動，因此具有抑菌性能[22]。提取液應(yīng)用于蘋果汁中，由表7可見，隨著提取物溶液質(zhì)量濃度的增加，其抑菌作用越明顯?？梢姲謇鯕ぬ崛∥镌谳^低質(zhì)量濃度下就有較明顯的抑菌作用，在3g/100mL的質(zhì)量濃度下可基本達(dá)到抑菌，是一種較有效的天然抑菌劑。

表7 不同質(zhì)量濃度下的細(xì)菌總數(shù)Table 7 Total bacterial counts at different concentration conditions

3 結(jié) 論

乙醇法和超聲波法都可從板栗殼中提取棕色素，但是超聲波法比乙醇法具有更大的優(yōu)勢，省時、節(jié)能、提取率更高。板栗殼色素提取的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比1:8(g/mL)、水浴溫度80℃、浸提時間80min，超聲波功率200W、作用時間8min。

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、青霉是食品生產(chǎn)、加工和貯藏過程中常見的腐敗菌種，板栗殼色素對其生長均有一定的抑制作用，其中對枯草芽孢桿菌的抑制作用最顯著，且低濃度下抑菌明顯，說明板栗殼色素具有良好的抑菌作用。板栗殼提取物中含有黃酮類物質(zhì)，應(yīng)用到蘋果汁中，質(zhì)量濃度3g/100mL的色素提取液可有99.86%的抑菌率，抑菌效果明顯且無毒副作用，可作為天然的抑菌劑。

有研究表明，板栗殼色素有很好的熱穩(wěn)定性，經(jīng)高溫處理后，抑菌效果未發(fā)生明顯的改變，且色素水溶液對光、熱及氧化劑和還原劑的耐受力較強(qiáng)。我國板栗殼資源豐富，板栗殼色素不僅是天然色素，還有抑菌作用，無毒副作用，是值得大力推廣使用的的天然色素和食品防腐劑。

[1] 劉平, 李云雁. 板栗殼色素超聲波提取方法研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(4):196-198.

[2] 李云雁, 宋光森. 超聲波協(xié)助提取板栗殼色素的研究[J]. 食品科技,2003(8):57-58.

[3] CALVO C, SALVADOR A. Use of natural colorants in food gels. Influence of composition of gels on their color and study of their stability during storage[J]. Food Hydrocolloids, 2000, 14(5):439-443.

[4] 李永祥, 詹少華, 蔡永萍. 板栗殼色素的提取、純化及穩(wěn)定性[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2008, 24(9):298-302.

[5] 王力華, 楊柏珍, 韓桂云, 等. 一種板栗殼天然棕色素的提取方法:中國, 03133730.9[P]. 2005-01-26.

[6] 綦菁華, 黃漫青, 王芳, 等. 板栗殼棕色素的提取方法:中國,200710178662.8[P]. 2009-04-15.

[7] de VASCONCELOS M D B M, BENNETT R N, QUIDEAU S, et al.Evaluating the potential of chestnut (Castanea sativaMill.) fruit pericarp and integument as a source of tocopherols, pigments and polyphenols[J]. Industruak Crops and Products, 2010, 31(2):301-311.

[8] SINISTERRA J V. Application of ultrasound to biotechnology:an overview[J]. Ultrasonics, 1992, 30(3):180-185.

[9] 張亞平. 板栗殼色素的提取工藝[J]. 云南化工, 2009, 36(3):31-32.

[10] 李紅, 王海舟. 板栗殼中提取色素的研究[J]. 萍鄉(xiāng)高等?？茖W(xué)校學(xué)報, 2008, 25(6):78-79.

[11] 吳雪輝, 黃敏勝, 張遠(yuǎn)志. 板栗殼食用色素的提取工藝條件研究[J].食品科技, 2004(4):57-59.

[12] 吳雪輝, 張遠(yuǎn)志, 秦慧慧, 等. 板栗殼天然色素的抑菌和清除自由基作用研究[J]. 食品科技, 2006(6):133-136.

[13] 李云雁, 宋光森. 板栗殼色素抑菌性的研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2004,5(4):63-65.

[14] 李濤, 趙云. 板栗殼色素的提取研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工:學(xué)刊, 2010(3):45-46.

[15] 郭雷, 郝倩. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化板栗殼總黃酮提取工藝的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 37(32):15979-15980.

[16] 杜榮騫. 生物統(tǒng)計學(xué)[M]. 2版. 北京:高等教育出版社, 2003:119-139.

[17] 沈萍, 范秀榮, 李廣武. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京:高等教育出版社,2004.

[18] 林稚蘭, 黃秀梨. 現(xiàn)代微生物學(xué)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京:科學(xué)出版社,2000.

[19] 周德慶. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊[M]. 上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社, 1986.

[20] 李云雁, 宋光森. 板栗殼提取物抑菌作用研究[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2004, 24(4):61-64.

[21] 吳春華, 張加研, 秦永劍, 等. 微波輻照提取板栗殼棕色素的研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2007, 27(增刊1):121-124.

[22] 席芳. 板栗殼化學(xué)成分的研究[D]. 鄭州:鄭州大學(xué), 2007.

Optimal Extraction Parameters and Antibacterial Properties of Pigment from Chestnut Shell

ZHOU Guo-yan1，SANG Ying-ying1，GONG Chun-bo2，CAO Bin-hong1，WANG Ai-min1
(1. Institute of Cryo-medicine and Food Refrigeration, Shanghai University of Science and Technology, Shanghai 200093, China；2. College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

TS202.3

A

1002-6630(2010)22-0101-05

2010-07-05

國家自然科學(xué)基金青年基金項目(50206013)；上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項目(S30503)

周國燕(1970—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称防鋬隼洳睾蜕餆嵯到y(tǒng)。E-mail：efly_snow@163.com