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    聚鄰氨基苯甲酸/納米金復(fù)合膜電化學(xué)免疫傳感器用于水體中大腸桿菌的檢測

    2010-10-19 10:31:08張新愛滕瑛巧劉慧杰金利通
    化學(xué)傳感器 2010年2期
    關(guān)鍵詞:辣根對苯二酚玻碳

    符 瑩,張新愛,滕瑛巧,劉慧杰,張 文,金利通

    (華東師范大學(xué)化學(xué)系,上海200062)

    0 引言

    大腸桿菌是水體污染程度的重要指示菌,是腸道中最普遍、數(shù)量最多的一類細(xì)菌。當(dāng)大腸桿菌由糞便尤其是腸道病患者糞便或醫(yī)院污水污染的水源排放后,它可引發(fā)傷寒、痢疾、霍亂等腸道疾病流行[1]。存在于溪流、河水、湖泊等與人類生活密切相關(guān)的環(huán)境中的大腸桿菌已經(jīng)成為人類病原存在的一個重要指標(biāo),是環(huán)境保護、食品衛(wèi)生、飲水衛(wèi)生和流行性病學(xué)領(lǐng)域中最重要的研究對象之一。因此,水體中大腸桿菌的檢測研究對環(huán)境衛(wèi)生以及流行病學(xué)等方面都具有十分重要的意義[2~4]。

    大腸桿菌的傳統(tǒng)檢測方法包括多管發(fā)酵法、濾膜法、熒光法、生物檢測法等。這些方法準(zhǔn)確度高,但是存在檢測周期長、程序復(fù)雜、所需試劑繁多等缺點,已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代檢測需要。電化學(xué)免疫傳感器具有簡單、靈敏、快速等獨特的優(yōu)點,近年來受到了人們的廣泛關(guān)注[5~6]。該文發(fā)展了一種具有低耗、高靈敏度、高選擇性等特性的電化學(xué)免疫傳感器實現(xiàn)了對水體中大腸桿菌的快速檢測。

    1 實驗部分

    1.1 儀器與試劑

    CHI 660電化學(xué)分析系統(tǒng)(CHI,美國);S4800型掃描電子顯微鏡(SEM,Hitachi,日本)。

    多克隆E.coli抗體 (北京寶賽生物科技有限公司,中國);辣根過氧化酶標(biāo)記的大腸桿菌抗體(ab20425,Abcam,英國);大腸桿菌菌種(華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中國);其余試劑如牛血清白蛋白(BSA,Sigma,美國)等均為分析純,實驗用水為二次蒸餾水,所有實驗均在室溫下操作。

    1.2 免疫傳感器的制備

    玻碳電極(拋光后)分別在-0.10~1.35 V 電位下和 1.0 mmol/L HAuCl4溶液中,-0.04~0.93 V 電位下和50 mmol/L鄰氨基苯甲酸溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描制得poly-o-ABA/AuNP修飾電極,然后在此電極上滴加10 μL新配制的0.40 mol/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺基 (EDC)和0.10 mol/L N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)混合溶液并活化 40 min。 PBS 淋洗后,加入 10 μL 100 μg/mL的大腸桿菌抗體,用10 μL 1.0 mol/L乙醇胺和10 μL 1.0%BSA來封閉未結(jié)合的羧基以避免非特異性吸附。再加入10 μL大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)溶液,溫育1 h。 最后,將 10 μL 100 μg/mL 辣根過氧化酶標(biāo)記的大腸桿菌抗體滴加在電極表面反應(yīng)1 h,用PBS清洗。

    1.3 測試方法

    三電極系統(tǒng)中以甘汞電極為參比電極,鉑絲電極為輔助電極,研制的免疫傳感器為工作電極。電極在5.0 mL 1.0 mmol/L對苯二酚溶液中,以-0.40 V~1.00 V 的電位范圍進(jìn)行循環(huán)伏安掃描,電流穩(wěn)定后加入 50 μL 0.48 mol/L 的 H2O2,通過響應(yīng)電流的大小來檢測大腸桿菌的濃度。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 修飾電極的掃描電子顯微鏡(SEM)圖譜表征

    圖1為poly-o-ABA/AuNP修飾電極的SEM圖譜。可以觀察到聚鄰氨基苯甲酸的纖維和多孔結(jié)構(gòu)以及分布于其中的金納米粒子[7]。

    2.2 修飾電極的電化學(xué)阻抗譜(EIS)表征

    圖1 poly-o-ABA/AuNP修飾電極的SEM圖Fig.1 Scanning electron micrograph of poly-o-ABA/AuNP modified GCE

    由圖2知:相對于裸玻碳電極,AuNPs修飾電極的阻抗明顯減小,說明AuNPs有效地促進(jìn)了電子的傳遞。而poly-o-ABA修飾電極的阻抗明顯增大,表明poly-o-ABA的導(dǎo)電性比較差,阻礙了電子的傳遞[8~9]。在圖2的曲線d中,poly-o-ABA/AuNP修飾電極的阻抗介于納米金與聚鄰氨基苯甲酸之間。依次加上大腸桿菌抗體、大腸桿菌、辣根過氧化酶標(biāo)記的抗體后,阻抗值逐漸增加,證明大腸桿菌抗體、大腸桿菌和辣根過氧化酶標(biāo)記的抗體均被固載到poly-o-ABA/AuNP修飾電極上[10~12]。

    2.3 免疫傳感器上酶的電化學(xué)行為

    圖3為在免疫傳感器中分別加入10 μL大腸桿菌抗體和10 μL辣根過氧化酶標(biāo)記抗體并培養(yǎng)1 h,再放入10 mL 1.0 mmol/L對苯二酚的PBS溶液,檢測得到循環(huán)伏安圖 (a)。加入1.6 mmol/L的H2O2后,(b)中響應(yīng)電流增加,顯示出明顯的電催化過程。

    2.4 大腸桿菌的檢測原理

    圖4為poly-o-ABA/AuNP免疫傳感器的工作原理。反應(yīng)體系包括典型的夾心免疫反應(yīng)過程和特異性反應(yīng)的電化學(xué)檢測。該傳感器在1.0 mmol/L對苯二酚存在下,通過辣根過氧化酶催化底物H2O2實現(xiàn)了對大腸桿菌的檢測。

    2.5 實驗條件的優(yōu)化

    該實驗研究了H2O2濃度對電流響應(yīng)的影響。由圖5知:在1.0 mmol/L對苯二酚存在的條件下, 當(dāng) H2O2濃度在 0.0至 4.8 mmol/L范圍內(nèi)時,響應(yīng)電流與H2O2濃度呈線性關(guān)系。所以在免疫檢測中,選擇4.8 mmol/L的H2O2作為檢測底液的濃度。

    圖2 (a)裸玻碳電極;(b)AuNPs玻碳電極;(c)poly-o-ABA玻碳電極;(d)poly-o-ABA/AuNP玻碳電極;(e)抗體/poly-o-ABA/AuNP玻碳電極;(f)大腸桿菌/抗體/poly-o-ABA/AuNP玻碳電極;(g)辣根過氧化酶標(biāo)記抗體/大腸桿菌/抗體/poly-o-ABA/AuNP 玻碳電極在 10 mmol/L[Fe(CN)6]4-/3-(0.010 mol/L pH7.0 PBS,0.10 mol/L KCl)中的電化學(xué)阻抗譜Fig.2 EIS of different electrodes in the presence of 10 mmol/L[Fe(CN)6]4-/3-solution(0.010 mol/L pH7.0 PBS,0.10 mol/L KCl):(a)bare GCE;(b)AuNPs modified GCE;(c)poly-o-ABA modified GCE;(d)poly-o-ABA/AuNP modified GCE;(e)anti-E.coli/poly-o-ABA/AuNP modified GCE;(f)E.coli/anti-E.coli/poly-o-ABA/AuNP modified GCE;(g)HRP-anti-E.coli/E.coli/anti-E.coli/poly-o-ABA/AuNP modified GCE

    圖3 在免疫傳感器中加入(a)1.0 mmol/L對苯二酚;(b)1.0 mmol/L 對苯二酚和 1.6 mmol/L H2O2的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammogram of HRP-anti-E.coli/E.coli/anti-E.coli/poly-o-ABA/AuNP modified GCE containing(a)1.0 mmol/L hydroquinone;(b)1.0 mmol/L hydroquinone and 1.6 mmol/L H2O2

    考察了該傳感器在 pH5.5到 pH8.5的范圍的檢測底液中對大腸桿菌的檢測,結(jié)果表明在pH7.0時響應(yīng)電流最大,因此選擇7.0為檢測的最優(yōu)pH值。反應(yīng)時間是影響催化反應(yīng)的一個重要因素,響應(yīng)電流隨免疫反應(yīng)的時間的增加而增大,實驗中在60 min時達(dá)到平衡,所以選擇培養(yǎng)時間為60 min。

    2.6 免疫傳感器對大腸桿菌的檢測

    由圖6知,免疫傳感器檢測大腸桿菌的線性范圍為 1.0×103~1.0×107cfu/mL,線性回歸方程為I(μA)=-0.38+0.22logcE.coli。 對 于 濃 度 為 1.0×104cfu/mL的大腸桿菌,每組數(shù)據(jù)測定三次,RSD為4.5%,檢測限為2×102cfu/mL。

    2.7 選擇性實驗

    在大腸桿菌(1.0×104cfu/mL)溶液中,加入枯草桿菌(1.0×105cfu/mL)、酵母菌(1.0×105cfu/mL)、放線桿菌(1.0×105cfu/mL)作為干擾物,用相同的實驗步驟考察免疫傳感器對大腸桿菌的響應(yīng)電流。實驗結(jié)果顯示響應(yīng)電流沒有顯著增加,表明該免疫傳感器具有良好的選擇性。

    2.8 河水中大腸桿菌的檢測

    將 1.0 L 的河水用孔徑為 0.45 μm 的濾紙過濾,富集得到的大腸桿菌溶液溶解于5.0 mL PBS(0.1 mol/L,pH7.4)中,運用該實驗中的方法對大腸桿菌進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示大腸桿菌的濃度為50 cfu/mL,與平板計數(shù)法(52 cfu/mL)得到的結(jié)果一致。

    圖4 基于poly-o-ABA/AuNP修飾玻碳電極的免疫傳感器工作原理Fig.4 Schematic of the amperometric immunosensor based on poly-o-ABA/AuNP modified GCE

    圖5 H2O2濃度對辣根過氧化酶標(biāo)記抗體修飾的poly-o-ABA/AuNP修飾電極的影響(a)0.4 mmol/L;(b)0.8 mmol/L;(c)6.0 mmol/L的H2O2在基底中的電流響應(yīng),插圖為響應(yīng)電流與H2O2濃度的線性圖Fig.5 Response currents of HRP-anti-E.coli/poly-o-ABA/AuNP modified GCE in(a)0.4 mmol/L;(b)0.8 mmol/L;(c)6.0 mmol/L H2O2;Insert shows the calibration plot between the response current and H2O2concentration

    圖6 (a)0.0 cfu/mL;(b)1.0×103cfu/mL;(c)1.0×105cfu/mL 的大腸桿菌在免疫傳感器上的電流響應(yīng);插圖為響應(yīng)電流與大腸桿菌的濃度對數(shù)的線性關(guān)系圖Fig.6 Response currents of the immunosensor toward the(a)0.0 cfu/mL;(b)1.0 ×103cfu/mL;(c)1.0×105cfu/mL of E.coli.Insert shows the calibration plot between the response current and the logarithmic value of E.coli concentration

    3 結(jié)論

    該實驗采用poly-o-ABA/AuNP制備出新型的免疫傳感器,并將其應(yīng)用于河水中大腸桿菌的檢測。該傳感器檢測河水中的大腸桿菌具有靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點,在飲用水和食品安全檢測等方面有很好的應(yīng)用前景。

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