聚環(huán)糊精-碳納米管有機(jī)磷農(nóng)藥生物傳感器

楊海朋，陳東成，李春輝，陳仕國，戈早川

（深圳大學(xué)材料學(xué)院，深圳市特種功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518060）

0 引言

有機(jī)磷農(nóng)藥作為最常用的一類農(nóng)藥，在各種農(nóng)作物尤其是瓜果蔬菜中被廣泛應(yīng)用，農(nóng)藥殘留通過食物鏈傳導(dǎo)到人體后成為致畸、致癌、致突變等惡性疾病的誘因，危害很大,因此對有機(jī)磷農(nóng)藥等的檢測需求越來越多。測試的方法主要有儀器分析法、免疫分析法和生物傳感器法[1～2]。目前廣泛使用的氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/MS)和高效液相色譜(HPLC)等儀器分析方法,盡管能比較準(zhǔn)確地檢測農(nóng)藥的殘留量,但存在設(shè)備大、移動性差、分析費(fèi)用高以及分析周期較長等不足。免疫分析法特異性強(qiáng),但操作復(fù)雜費(fèi)時。電化學(xué)生物傳感器的應(yīng)用為實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥快速、靈敏和簡便的檢測提供了可能，已經(jīng)廣泛用于有機(jī)磷農(nóng)藥的測定[1,3～5]。但是電化學(xué)生物傳感器通常僅在一定的實(shí)驗(yàn)條件下使用狀態(tài)良好,其實(shí)際應(yīng)用的最大問題是穩(wěn)定性不夠好。對于生物傳感器而言，制備新型固定化材料和固定化方法，改善傳感器的生物敏感膜的性能，增加其穩(wěn)定性和生物活性，是研制性能優(yōu)良的生物傳感器的關(guān)鍵[6]。

碳納米管(CNT)所表現(xiàn)出的許多優(yōu)良的性能使得對CNT的研究成為目前倍受關(guān)注的熱點(diǎn)課題之一，其在生物傳感器領(lǐng)域的應(yīng)用也不斷被拓展[3,7～8]。例如研究人員把碳納米管分散于Nafion[9～10]、殼聚糖[11～12]等高聚物的溶液中制備的生物傳感器，具有很好的檢測靈敏度。然而，能夠用于分散碳納米管的此類高聚物非常有限。該課題利用環(huán)糊精作為分散劑來分散CNT，得到不溶于水的聚環(huán)糊精-碳納米管復(fù)合導(dǎo)電膜，并在該膜上固定乙酰膽堿酯酶，制備了既能保持CNT優(yōu)良的導(dǎo)電性能和電催化活性，又能維持很好的穩(wěn)定性的有機(jī)磷農(nóng)藥生物傳感器，為其實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑和儀器

試劑：多壁碳納米管(MWNT)，外徑10 nm，純度95%（清華大學(xué)化工系生產(chǎn)）。乙酰膽堿酯酶 （AChE）， 酶活力為424單位/毫克 （sigma公司）；氯化硫代乙酰膽堿（sigma公司）。其它試劑，如 β-環(huán)糊精（β-CD）、甲胺磷、濃硝酸、25%戊二醛（GD）、鹽酸、鐵氰化鉀、無水乙醇等均為分析純試劑。含四個環(huán)糊精分子的預(yù)聚環(huán)糊精由實(shí)驗(yàn)室自制（β-CDP）。

主要儀器：電化學(xué)工作站(CHI660C)，上海辰華儀器有限公司。

1.2 傳感器制備

把碳納米管放入混酸（濃硫酸和濃硝酸按體積比3∶1）中于60°C回流4 h除雜。把CNT放入β-CD和β-CDP的混合溶液超聲10 min。混合液中CNT的濃度為1 mg/mL。

用微量進(jìn)樣器吸取混合液20 μL置于干凈的玻璃片上，加入 40 μL 2.5%戊二醛和 0.2 mol/L鹽酸的等比例混合液。攪拌均勻后，用微量進(jìn)量器吸取20 μL上述溶液滴到Pt電極上，室溫下自然晾干后得到聚環(huán)糊精-碳納米管（CDP-CNT）復(fù)合膜修飾電極。然后取5 μL乙酰膽堿酯酶溶液（0.1 U/μL）和 5 μL 2.5% 的戊二醛溶液滴到已干燥的復(fù)合膜修飾電極上，室溫下自然晾干，即得到聚環(huán)糊精-碳納米管復(fù)合膜有機(jī)磷農(nóng)藥生物傳感器。

1.3 有機(jī)磷農(nóng)藥傳感器的性能測試

利用CHI660C電化學(xué)工作站對制備的傳感器進(jìn)行循環(huán)伏安檢測。采用三電極系統(tǒng)（參比電極為飽和甘汞電極，對電極為鉑絲電極，工作電極為有機(jī)磷農(nóng)藥傳感器）測量傳感器在不同濃度甲胺磷抑制條件下對硫代乙酰膽堿溶液的電流響應(yīng)曲線。

2 結(jié)果討論

2.1 β-CD及β-CDP配比對修飾電極電化學(xué)性能的影響

把不同配比的β-CD和β-CDP修飾電極置于50 mmol/L的鐵氰化鉀（K3Fe(CN)6）溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安測試，所得曲線如圖1所示。由圖可知，2%β-CD和5%β-CDP混合溶液分散CNT制備的復(fù)合膜修飾電極的氧化-還原峰峰形對稱性最好，峰值最大，說明CNT在以2%β-CD+5%β-CDP為基底組成的復(fù)合膜中分散效果最好，其修飾電極電化學(xué)性能優(yōu)異。

2.2 有機(jī)磷農(nóng)藥生物傳感器的性能檢測

2.2.1 循環(huán)伏安曲線

圖1 四種不同配比的β-CD和β-CDP制成的CDP-CNT復(fù)合膜修飾電極在50 mmol/L的鐵氰化鉀溶液中的循環(huán)伏安曲線圖（掃描速度50 mV/s）Fig.1 The cyclic voltammetry curves of four different types of modified electrodes:the modified materials on the electrodes are the films prepared via 2%β-CD+5%β-CDP,2%β-CD+8% β-CDP,2%β-CD+2%β-CDP,and 5%β-CDP,respectively(50 mmol/L K3Fe(CN)6at 50 mV/s)

把制備好的有機(jī)磷農(nóng)藥生物傳感器分別放入磷酸緩沖溶液和0.5 mmol/L氯化硫代乙酰膽堿溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安測試，電壓掃描范圍為-0.4 至 0.8 V，掃描速度 0.1 V/s，掃描結(jié)果見圖 2。由圖可見，傳感器在不含底物的緩沖溶液中沒有明顯的氧化還原峰；在含有0.5 mmol/L底物的溶液中，則在0.4 V和0.1 V附近出現(xiàn)明顯的氧化還原峰。膽堿在普通電極上的氧化電位為0.8 V左右[13]，而在目前的傳感器電極上氧化電位降低為約0.4 V，說明碳納米管對底物具有良好的電催化活性。

圖2 有機(jī)磷農(nóng)藥生物傳感器在磷酸緩沖溶液和0.5 mmol/L乙酰膽堿溶液中的循環(huán)伏安曲線（電壓掃描范圍為-0.4 至 0.8 V，掃描速度 0.1 V/s）Fig.2 The cyclic voltammetry curves of the biosensor in 0.5 mmol/L acetylthiocholine chloride solution and in PBS.The scan rate is 0.1 V/s

2.2.2 抑制率曲線的測量

在0.5 V工作電壓下，用傳感器測定5×10-4mol/L硫代乙酰膽堿溶液的電流響應(yīng)曲線，所得電流為基準(zhǔn)電流i0。把制好的傳感器在濃度分別為1.0、2.0、4.0 、6.0、10.0、15.0 mg/L 的甲胺磷溶液里浸泡12 min，分別測定其在相同濃度硫代乙酰膽堿溶液中的抑制電流ii。根據(jù)公式K=(ii-i0)/ii×100℅計(jì)算抑制率。抑制率-濃度關(guān)系曲線示于圖3。有機(jī)磷的濃度越大，對酶的活性的抑制力就越強(qiáng)，加入相同濃度的乙酰膽堿溶液時產(chǎn)生的響應(yīng)電流就越小。以有機(jī)磷農(nóng)藥濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)做圖，則得到圖3中的插圖。可見當(dāng)甲胺磷濃度在 1.0～15.0 mg/L范圍內(nèi)時，抑制率與濃度數(shù)值的對數(shù)呈線性關(guān)系，檢測范圍較文獻(xiàn)值更寬[1]。圖中直線部分的擬合線性方程為 y=11.8*ln(c)+44.8，r=0.992(n=6),方程中 c是以mg/L為單位的有機(jī)磷濃度。理論上的檢測限是指10%的抑制率所對應(yīng)的抑制劑濃度，因此可計(jì)算得到該傳感器對甲胺磷的檢測下限為0.05 mg/L。

圖3 乙酰膽堿酯酶百分抑制率與甲胺磷農(nóng)藥濃度關(guān)系圖(內(nèi)置圖為抑制率-濃度的對數(shù)關(guān)系圖)Fig.3 Acetylcholinesterase percent inhibition vs Methamidophos concentrations incubated in phosphate buffer solution.Calibration graph of acetylcholinesterase percent inhibition vs.logarithm of concentration of Methamidophos is shown in the inset

為了研究傳感器的工作機(jī)理，測定了不同掃描速度下傳感器在硫代乙酰膽堿溶液中的循環(huán)伏安曲線（電壓掃描范圍為-0.4至0.8 V，掃描速度從 0.01 至 0.5 V/s），所得結(jié)果示于圖 4A。 圖中從最內(nèi)圈的循環(huán)伏安曲線開始，所用的掃描速度分 別 是 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 V/s。

圖4 (A)不同掃描速度下傳感器在氯化硫代乙酰膽堿溶液(0.5 mmol/L)中的循環(huán)伏安曲線（電壓掃描范圍為 -0.4 至 0.8 V，掃描速度從內(nèi)圈到外圈依次為 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 V/s）;(B)不同掃描速度下的循環(huán)伏安曲線的峰電流分別對掃描速度（ν）、掃描速度的1/2次方（ν1/2）及掃描速度的3/4次方（ν3/4）圖Fig.4 (A)Cyclic voltammetry curves of AChE/CDP/CNT sensor in 0.5 mmol/L acetylthiocholine chloride solution at scan rates of:0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 V/s;(B)Fitting curves of peak current vs.(i)sweep rate(ν),(ii)the square root of sweep rate(ν1/2)and(iii)the three fourth power of sweep rate(ν3/4)

以各次循環(huán)伏安曲線的峰電流分別對ν、ν1/2及ν3/4做圖，所得曲線示于圖4B。根據(jù)已有研究結(jié)果，如果峰電流對掃描速度成正比，說明電極的電子傳遞過程受表面反應(yīng)（電子轉(zhuǎn)移）步驟控制；如果峰電流對掃描速度的1/2次方成正比，說明電極的電子傳遞過程受擴(kuò)散步驟控制。 由圖4B可見，在傳感器電極上發(fā)生的電極反應(yīng)與這兩種情況都不符合，而是與掃描速度的3/4次方成正比。說明傳感器的電子傳遞過程同時受表面反應(yīng)和擴(kuò)散兩種電極反應(yīng)機(jī)理控制。 通常固定化酶的電極反應(yīng)都是由擴(kuò)散控制機(jī)理起主要作用。據(jù)此可認(rèn)為，由于碳納米管的加入，縮短了酶與電極、底物與基礎(chǔ)電極之間傳遞電子的途徑，因而擴(kuò)散步驟的影響減小，從而表現(xiàn)為二者混合控制的電極反應(yīng)機(jī)理。這與納米鉑顆粒摻雜的生物傳感器電子傳遞過程類似[14]。

3 結(jié)論

利用環(huán)糊精-預(yù)聚環(huán)糊精的混合溶液作分散劑來分散CNT，通過預(yù)聚環(huán)糊精的聚合反應(yīng)制備出不溶于水的CDP-CNT復(fù)合膜，以其作為載體固定乙酰膽堿酯酶，得到了一種靈敏度較高、檢測范圍較寬的有機(jī)磷農(nóng)藥生物傳感器。該傳感器可以在 1.0～15.0 mg/L濃度范圍內(nèi)檢測農(nóng)藥甲胺磷的含量，檢測下限為0.05 mg/L。文中還探討了該傳感器的電極反應(yīng)機(jī)理，表明電極的電子傳遞過程受電子轉(zhuǎn)移步驟和擴(kuò)散控制步驟兩者共同作用。

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