運(yùn)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)牛、山羊、豬和雞源性成分

石豐運(yùn)，繆建錕，張利平，陶虹，呂建強(qiáng)，阮周曦，宗卉

1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070

2 深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，深圳 518010

3 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

生物技術(shù)與方法

運(yùn)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)牛、山羊、豬和雞源性成分

石豐運(yùn)1,2，繆建錕3，張利平1，陶虹2，呂建強(qiáng)2，阮周曦2，宗卉2

1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070

2 深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，深圳 518010

3 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

本研究通過(guò)對(duì)脊椎動(dòng)物分子標(biāo)記基因進(jìn)行序列分析，最終選擇線粒體DNA (mtDNA) 16S rRNA基因?yàn)槟繕?biāo)基因，利用一對(duì)通用引物，在該引物擴(kuò)增區(qū)間設(shè)計(jì)了4條特異性基因芯片檢測(cè)探針及2條質(zhì)控探針用于對(duì)牛、山羊、豬、雞等4種動(dòng)物源性成分進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增體系及雜交體系的優(yōu)化，該檢測(cè)方法能實(shí)現(xiàn)對(duì)上述4種動(dòng)物源性成分同時(shí)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)，具有很好的特異性，靈敏度均達(dá)到1 pg，最終建立了這4種動(dòng)物源性基因芯片檢測(cè)方法。該基因芯片檢測(cè)技術(shù)將為我國(guó)進(jìn)出口飼料中的動(dòng)物源性成分的鑒別提供新的檢測(cè)方法和技術(shù)支持。

線粒體16S rRNA基因，DNA芯片，動(dòng)物源性

Abstract:We analyzed the sequence of vertebrate molecular marker genes, then we selected the mitochondrial DNA (mtDNA)16S rRNA gene as marker gene. In order to detect four kinds of animal-derived ingredients, which including bovine, goat, pig and chicken. We utilized a pair of universal primers, designed four sets of species-specific microarray probes and two pairs of quality control probes. We optimized the PCR amplifications and hybridization conditions, therefore these four kinds of animal-derived ingredients could be rapid and accurate detected by this approach. The detection limits were all reaches 1 pg. We established the detection platform of these four kinds of animal-derived ingredients. This universal PCR-microarray assay provides a new method for the identification of animal-derived ingredients in the import-export field.

Keywords:mitochondrion 16S rRNA gene, DNA chip, animal-derived ingredients

隨著國(guó)際貿(mào)易的飛速發(fā)展，防御國(guó)際間動(dòng)物疫病傳播的難度也在不斷加大。為了防止瘋牛病、癢病、禽流感、甲流等經(jīng)飼料、畜產(chǎn)品傳播，世界各國(guó)政府和組織在規(guī)范對(duì)動(dòng)物源性飼料使用的同時(shí)，積極開(kāi)展動(dòng)物源性成分檢測(cè)技術(shù)方面的研究。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于動(dòng)物源性成分的檢測(cè)方法的報(bào)道主要有顯微鏡檢法、紅外光譜、ELISA、普通 PCR、熒光定量PCR等方法。但上述的分子生物學(xué)方法尚不能很好滿足快速、大規(guī)模、高通量檢測(cè)的需要。因此，需要建立一種能快速準(zhǔn)確鑒別、檢測(cè)動(dòng)物源性成分的方法，提高檢驗(yàn)檢疫通關(guān)速度，對(duì)保護(hù)我國(guó)畜牧業(yè)的安全生產(chǎn)具有重要的意義。

基因芯片基本原理是將核酸片段作為識(shí)別分子，按預(yù)先設(shè)置的排列固定于特定的固相支持載體的表面形成微點(diǎn)陣，利用反向固相雜交技術(shù)，將標(biāo)記的樣品分子與微點(diǎn)陣上的核酸探針雜交，以實(shí)現(xiàn)多到數(shù)萬(wàn)個(gè)分子之間的雜交反應(yīng)，通過(guò)特殊的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行高通量、大規(guī)模地分析檢測(cè)樣品中多個(gè)基因的表達(dá)狀況或者特定基因分子的存在[1]?；蛐酒蚓哂懈咄俊⒏叨炔⑿行?、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)而得到了廣泛的應(yīng)用[2-3]。基因芯片目前主要產(chǎn)品包括基因表達(dá)譜芯片，轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)芯片，新生兒基因檢測(cè)芯片，肝炎病毒、艾滋病毒基因檢測(cè)芯片，其中腫瘤檢測(cè)、肝病檢測(cè)、自身免疫疾病診斷芯片即將或已經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng)用和商業(yè)化運(yùn)作。物種鑒定檢測(cè)芯片研制仍處于起步階段，如應(yīng)用于臨床致病真菌鑒定[4]和水產(chǎn)食品中常見(jiàn)病原微生物鑒定[5]等。但迄今為止，基因芯片技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物源性成分鑒定檢測(cè)還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究嘗試建立用基因芯片技術(shù)同時(shí)對(duì)牛、山羊、豬、雞 4種動(dòng)物成分的快速檢測(cè)方法，較好地彌補(bǔ)了常規(guī)分子檢測(cè)方法的缺陷，能實(shí)現(xiàn)一次反應(yīng)完成對(duì)多種動(dòng)物源性成分的種類初篩和鑒定，為我國(guó)進(jìn)出口飼料及畜產(chǎn)品快速篩查和種類鑒定提供有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品

牛肉、山羊肉、豬肉、雞肉、綿羊肉、狗肉、兔肉、鴨肉、鵝肉、鵪鶉肉、火雞肉、鷓鴣肉和魚(yú)肉均購(gòu)自廣東深圳超市，驢肉和鹿肉均購(gòu)自內(nèi)蒙古呼和浩特超市。這些樣品均經(jīng)過(guò)品種鑒定并測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果證明均為其名稱所述之物種。

1.2 試劑和儀器

細(xì)胞/組織-基因組提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物公司。ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL2000購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司。醛基化DNA芯片基片及蓋片、4孔圍欄購(gòu)自北京博奧生物公司。

NANO-PLOTTER2芯片點(diǎn)樣儀、GenePix4200A芯片掃描儀、ABI Verti PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)、烘箱 (BINDER)、核酸蛋白分析儀DU800 (Beckman) 均由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植中心提供。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)相關(guān)檢測(cè)文獻(xiàn)及對(duì)牛、山羊、豬、雞、魚(yú)等動(dòng)物的DNA分子標(biāo)記基因序列進(jìn)行系統(tǒng)分析，最終選擇mtDNA 16S rRNA基因?yàn)槟繕?biāo)基因。根據(jù)文獻(xiàn)選用了一對(duì)可擴(kuò)增該基因的通用引物 Universal-Forward/Reverse[6]，在引物的擴(kuò)增區(qū)間設(shè)計(jì)出一系列探針，用于檢測(cè)牛、山羊、豬、雞源性成分。將候選探針序列用 GenBank的 Blastn軟件進(jìn)行比對(duì)分析，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，經(jīng)過(guò)篩選選擇了特異性較好的序列作為固相芯片檢測(cè)探針，質(zhì)控探針包括陽(yáng)性定位點(diǎn)探針及Cy5標(biāo)記互補(bǔ)鏈、陰性質(zhì)控探針。質(zhì)控探針均與牛、山羊、豬、雞、魚(yú)以及馬等動(dòng)物mtDNA的16S rRNA基因序列無(wú)同源性。引物和探針的合成、修飾由上海超世生物技術(shù)有限公司完成，具體序列見(jiàn)表1。

1.4 芯片的制備

固相探針用1× TE溶解至終濃度為40 μmol/L，與 50% DMSO等體積混勻后作為探針點(diǎn)樣混合液，加入384孔板中，空白對(duì)照為50% DMSO，按預(yù)先設(shè)計(jì)的探針點(diǎn)陣排布順序，點(diǎn)樣至基片上。點(diǎn)樣后基片在濕盒中37℃烘箱中水合12 h，用 0.2%SDS洗液漂洗2 min，去離子水漂洗3次，每次2 min。再放入0.2% NaBH4封閉液中封閉15 min，中間靜置5 min；去離子水漂洗3次，每次2 min，2 000 r/min離心2 min干燥，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 基因芯片的陣列設(shè)計(jì)

每張醛基化玻片上固定著4個(gè)矩陣，探針點(diǎn)陣排布如圖1所示，每個(gè)陣列共4行11列，第1列和第1行均為陽(yáng)性定位點(diǎn)探針，其他探針各設(shè)5個(gè)重復(fù)。

表1 動(dòng)物源性基因芯片通用引物、檢測(cè)探針和質(zhì)控探針Table 1 Universal primers, species- specific probes and quality control probes used in this study

圖1 基因芯片探針排布圖Fig.1 Layout of microarray probes. A: anchor probe; N: negative probe; B: blank control.

1.6 熒光摻入法PCR擴(kuò)增與標(biāo)記

熒光摻入法PCR反應(yīng)體系為：10× PCR buffer 2.5 μL、Mg2+2 μL、正向引物和反向引物各 0.5 μL(10 μmol/L)、Taq酶 0.2 μL (5 U/μL)、Cy5-dNTPs 0.4 μL、DNA 模板 (10 ng/μL) 1 μL、ddH2O 補(bǔ)足總體積到25 μL?？瞻讓?duì)照為ddH2O代替DNA。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸 5 min。Cy5-dNTPs 配方為 ddH2O 2.85 μL、dATP(10 mmol/L) 1 μL、dCTP (10 mmol/L) 1 μL、dGTP(10 mmol/L) 1 μL、dTTP (10 mmol/L) 0.65 μL、Cy5-dCTP (1 mmol/L) 3.5 μL。

1.7 雜交及掃描

分別取 7 μL 芯片雜交液 (5× SSC，0.1% SDS)，6 μL PCR標(biāo)記產(chǎn)物、Cy5標(biāo)記陽(yáng)性定位探針互補(bǔ)鏈1 μL，混勻后95℃變性5 min，立即冰浴5 min。將其按預(yù)計(jì)排布順序加入芯片點(diǎn)樣區(qū)，蓋上蓋玻片置于雜交盒中52℃烘箱中避光雜交2 h。雜交后的芯片依次放入42℃預(yù)熱洗液I (0.3× SSC，0.2%SDS)和洗液 II (0.06× SSC) 磁力攪拌清洗，各 3 min，2 000 r/min離心2 min干燥。激光共聚焦掃描儀設(shè)置為在635 nm的激發(fā)波長(zhǎng)掃描芯片，激光功率為60%，PMT設(shè)置為60%進(jìn)行掃描。圖像用GenePixs V5.0軟件分析，以JPEG和TIFF的格式保存。

1.8 特異性實(shí)驗(yàn)

為了更好地評(píng)價(jià)本檢測(cè)方法的特異性，共選取15種不同種的動(dòng)物組織 (見(jiàn) 1.1)，用通用引物Universal-Forward/Reverse進(jìn)行熒光摻入法 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，雜交、掃描過(guò)程見(jiàn)1.7。

1.9 靈敏度實(shí)驗(yàn)

將提取的牛、山羊、豬、雞的DNA模板原液測(cè)量濃度后母液均定量至 10 ng/μL，分別進(jìn)行 10×梯度稀釋，即 10?1～10?6共 6個(gè)梯度。用通用引物Universal-Forward/Reverse進(jìn)行熒光摻入法 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，雜交、掃描過(guò)程見(jiàn)1.7。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶基因片段熒光摻入法PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別用牛、山羊、豬、雞、綿羊、鹿、驢、狗、兔、鴨、鵝、鵪鶉、火雞、鷓鴣、魚(yú)等15種動(dòng)物源性DNA模板和空白對(duì)照進(jìn)行熒光摻入法PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖 2。通用引物 Universal-Forward/

圖2 通用引物動(dòng)物源性PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Agarose electrophoresis analysis of PCR products by primers Universal-Forward/Reverse. M: DNA marker DL 2 000; 1?16:bovine, goat, pig, chicken, sheep, donkey, deer, dog, rabbit, duck, goose, quail, turkey, artridge, fish, blank control.

Reverse能有效擴(kuò)增出以上15種動(dòng)物源性的DNA模板，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，回收純化并測(cè)序，結(jié)果表明15種動(dòng)物源性PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度分別在234～249 bp之間，與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小相同，空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶。同時(shí)，用該通用引物對(duì)牛源性成分進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，電泳結(jié)果見(jiàn)圖 3，牛 DNA濃度為10?5稀釋度時(shí)，5 μL PCR產(chǎn)物通過(guò)電泳已經(jīng)看不到電泳條帶。

2.2 基因芯片特異性檢測(cè)結(jié)果

圖3 靈敏度實(shí)驗(yàn)PCR電泳圖Fig.3 Agarose electrophoresis analysis of sensitivity test of bovine by Universal-Forward/Reverse. M: DNA marker DL 2 000; 1?6: 10?1, 10?2, 10?3, 10?4, 10?5, blank control.

圖4 特異性檢測(cè)雜交結(jié)果Fig.4 Specificity test result of microarray. A?O: bovine, goat, pig, chicken, donkey, deer, dog, rabbit, duck, goose, artridge, quail,turkey, sheep, fish, respectively.

用通用引物進(jìn)行熒光摻入法標(biāo)記PCR擴(kuò)增，按1.7方法進(jìn)行雜交、掃描，結(jié)果如圖4所示。為了能有效地對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行評(píng)判，在根據(jù)文獻(xiàn)[7]得出本系統(tǒng)的陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為通過(guò)Gene Pix 4200A掃描識(shí)別的信噪比大于3的信號(hào)為陽(yáng)性信號(hào)。陽(yáng)性質(zhì)控探針及陰性質(zhì)控探針雜交信號(hào)正常，4條特異性探針與目的產(chǎn)物有很好的雜交信號(hào)，與其余11種供試材料之間無(wú)雜交信號(hào)，不存在交叉反應(yīng)，這4條特異性探針有很好的特異性。

2.3 基因芯片靈敏度檢測(cè)結(jié)果

用通用引物進(jìn)行熒光摻入法標(biāo)記PCR擴(kuò)增，按1.7方法進(jìn)行雜交、掃描，牛、山羊、豬、雞源性成分的基因芯片靈敏度檢測(cè)結(jié)果分別見(jiàn)圖 5～8，最低檢測(cè)限都達(dá)到了10?5稀釋度，即濃度為1 pg。牛源性成分靈敏度檢測(cè)電泳結(jié)果表明 (圖3)，牛DNA濃度為10?5稀釋度時(shí)，5 μL PCR產(chǎn)物通過(guò)電泳已經(jīng)看不到電泳條帶 (山羊、豬、雞電泳結(jié)果與?；疽恢?，但是通過(guò)基因芯片雜交后仍然可以看到較為明顯的雜交信號(hào) (圖5)。

2.4 基因芯片檢測(cè)方法可重復(fù)性驗(yàn)證

從2批點(diǎn)制的檢測(cè)芯片中各隨機(jī)抽取4張，針對(duì)bovine和goat探針位點(diǎn)的靶基因做2次雜交，每次再?gòu)?批次芯片中隨機(jī)抽取2張雜交，所用靶基因的量 (10 ng/μL) 及雜交條件都是相同的，用以驗(yàn)證該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。第 1次雜交各芯片標(biāo)記為 1A、1B、2A、2B；第 2次雜交各芯片標(biāo)記為1C、1D、2C、2D。從雜交掃描分析后的圖像上可以看出，無(wú)論是批間還是批次雜交試驗(yàn)都得到了明顯的信號(hào)結(jié)果 (圖9)，而且各個(gè)探針間也沒(méi)有交叉反應(yīng)。

圖5 基因芯片對(duì)牛成分的靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Sensitivity test result of bovine by microarray. (A) 10?1. (B) 10?2. (C) 10?3. (D) 10?4. (E) 10?5. (F) 10?6.

圖6 基因芯片對(duì)山羊成分的靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Sensitivity test result of goat by microarray. (A) 10?1. (B) 10?2. (C) 10?3. (D) 10?4. (E) 10?5. (F) 10?6.

圖7 基因芯片對(duì)豬成分的靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Sensitivity test result of pig by microarray. (A) 10?1. (B) 10?2. (C) 10?3. (D) 10?4. (E) 10?5. (F) 10?6.

圖8 基因芯片對(duì)雞成分的靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.8 Sensitivity test result of chicken by microarray. (A) 10?1. (B) 10?2. (C) 10?3. (D) 10?4. (E) 10?5. (F) 10?6.

圖9 可重復(fù)性雜交試驗(yàn)結(jié)果Fig.9 Repeatability results of hybrization. 1A, 1B, 1C, 1D: bovine; 2A, 2B, 2C, 2D: goat.

3 討論

mtDNA是高等動(dòng)物唯一的核外遺傳物質(zhì)，所有組織細(xì)胞中均含有大量的線粒體[8]，mtDNA主要以編碼序列構(gòu)成，種內(nèi)的異質(zhì)基因很少，而在不同的物種間具有高度的變異性[9]。在高等植物中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類似結(jié)構(gòu)的基因，在植物mtDNA中也沒(méi)有相似的編碼同源蛋白的基因[10-11]，因此，高等生物mtDNA 16S rRNA是一個(gè)比較理想的、保守性較好的分子標(biāo)記基因。本研究通過(guò)該區(qū)段的一對(duì)通用引物Universal-Forward/Reverse可以對(duì) 15種脊椎動(dòng)物mtDNA 16S rRNA基因進(jìn)行有效擴(kuò)增，結(jié)合特異性探針，構(gòu)建固相基因芯片，可同時(shí)進(jìn)行多種動(dòng)物源性成分的鑒別檢測(cè)，不僅可以降低檢測(cè)步驟及時(shí)間，還可降低檢測(cè)成本。

獲得具有很好特異性和高靈敏度的探針是成功建立基因芯片檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵[12-14]，因此如何進(jìn)行探針的設(shè)計(jì)與篩選來(lái)消除探針雜交的不利影響，提高檢測(cè)的特異性將是基因芯片應(yīng)用技術(shù)研究的重點(diǎn)之一[15-16]。在探針篩選過(guò)程中，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)探針的Tm值及雜交溫度[17]和探針在 PCR產(chǎn)物序列上的位置對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱有著較為明顯的影響。雜交溫度降低將增加探針的信號(hào)值，但探針的特異性將降低；雜交溫度提高將降低探針的信號(hào)值，但探針的特異性將提高，而最佳的雜交溫度一般低于探針的理論Tm值8℃～10℃，通過(guò)對(duì)雜交溫度進(jìn)行系統(tǒng)的梯度性優(yōu)化試驗(yàn)獲得最佳的雜交溫度。由于探針的位置對(duì)特異性也有影響，在靠近PCR產(chǎn)物5′端的位置時(shí)，反向探針的雜交信號(hào)要好于正向的探針。當(dāng)所設(shè)計(jì)的探針的位置在靠近PCR產(chǎn)物中間的位置時(shí)，正向探針的雜交信號(hào)與反向探針雜交信號(hào)相近[18]，所以在設(shè)計(jì)探針時(shí)要考慮探針的選擇位點(diǎn)及方向性。

本研究在進(jìn)行基因芯片靈敏度檢測(cè)方法過(guò)程中，發(fā)現(xiàn) 10?5梯度稀釋的牛 DNA通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳無(wú)目的產(chǎn)物，但是通過(guò)基因芯片雜交后有雜交信號(hào)，說(shuō)明基因芯片檢測(cè)方法的靈敏度要高于常規(guī)PCR，這一研究結(jié)果與翟俊輝等[19]的研究結(jié)果相符。

本研究選取通用引物只通過(guò)一次PCR擴(kuò)增就可以得到 15種動(dòng)物的目的片段，結(jié)合PCR-基因芯片技術(shù)可同時(shí)鑒別檢測(cè)多種動(dòng)物源性成分，并且具有很好的特異性和靈敏度。通過(guò)對(duì)牛、山羊、豬和雞動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法的初步研究，獲得了該體系PCR擴(kuò)增及芯片雜交等步驟的參數(shù)，為進(jìn)一步對(duì)其余的動(dòng)物源性成分的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。本方法大大地縮短了檢測(cè)周期，為口岸檢驗(yàn)檢疫提供高效、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)手段，為我國(guó)進(jìn)口食品、畜產(chǎn)品快速篩查和種類鑒定提供有效的技術(shù)平臺(tái)，具有非常廣闊的推廣應(yīng)用前景。

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Detection of bovine, goat, pig and chicken derived ingredients in animal products with universal PCR-microarray method

Fengyun Shi1,2, Jiankun Miao3, Liping Zhang1, Hong Tao2, Jianqiang Lü2, Zhouxi Ruan2,and Hui Zong2

1Faculty of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou730070,China
2Shenzhen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Shenzhen518010,China
3State Key Laboratory of Agro-biotechnology,China Agricultural University,Beijing100193,China

Received:January 14, 2010;Accepted:April 9, 2010

Supported by:Project of Shenzhen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau (No. SZ2008015).

Corresponding author:Hui Zong. Tel: +86-755-25588685; E-mail: zonghui32@yahoo.com.cn

深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目 (No. SZ2008015) 資助。