• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    慢病毒載體感染成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

    2010-10-11 02:11:22任振華王淑艷張穎鄒春林張愚
    生物工程學(xué)報(bào) 2010年6期
    關(guān)鍵詞:食蟹抗病毒骨髓

    任振華,王淑艷,張穎,鄒春林,張愚

    1 首都醫(yī)科大學(xué) 宣武醫(yī)院細(xì)胞治療中心,北京 100053

    2 安徽醫(yī)科大學(xué) 人體解剖學(xué)教研室,合肥 230032

    組織工程與細(xì)胞培養(yǎng)

    慢病毒載體感染成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

    任振華1,2,王淑艷1,張穎1,鄒春林1,張愚1

    1 首都醫(yī)科大學(xué) 宣武醫(yī)院細(xì)胞治療中心,北京 100053

    2 安徽醫(yī)科大學(xué) 人體解剖學(xué)教研室,合肥 230032

    骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (Mesenchymal stem cells,MSCs) 具有增殖和多向分化潛能,臨床應(yīng)用廣泛,近年來備受關(guān)注。另一方面,MSCs易于轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)外源基因,是理想的基因工程細(xì)胞。非人靈長類 (NHPs) 和人類具有非常相近的遺傳背景,NHPs模型在評價藥物療效和移植治療等方面具有不可替代的價值。本研究采用密度梯度離心法分離成年食蟹猴骨髓單核細(xì)胞 (Marrow mononuclear cells,MNCs),貼壁培養(yǎng) MSCs。同時構(gòu)建表達(dá)綠色熒光蛋白 (Green fluorescent protein,GFP) 的慢病毒載體,感染成年食蟹猴MSCs。結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)的成年食蟹猴MSCs均感染猴泡沫病毒 (Simian foamy virus,SFV),體外培養(yǎng)成年食蟹猴MSCs必須添加抗病毒藥物Tenofovir。但由于食蟹猴MSCs感染SFV,以及培養(yǎng)中添加了抗病毒藥物Tenofovir,慢病毒載體的感染效率明顯降低 (<10%)。本研究通過停用抗病毒藥,在細(xì)胞復(fù)蘇后6 d轉(zhuǎn)染慢病毒,可大幅提高慢病毒的感染效率 (>50%)。為成年食蟹猴MSCs作為基因工程細(xì)胞應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供了技術(shù)保證。

    食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,綠色熒光蛋白,慢病毒載體,猴泡沫病毒,轉(zhuǎn)導(dǎo)

    Abstract:Mesenchymal stem cells (MSCs) have received considerable attention for various therapeutic approaches in recent years. MSCs are also easy to genetically modify to express therapeutic genes by using lentiviral vectors. Because of the similarities in genetics, physiology and metabolism between non-human primates (NHPs) and humans, NHPs models are invaluable for researching human disorders and for developing therapeutic strategies. Therefore, MSCs derived from NHPs could be a powerful tool for cell therapy and genetic engineering. Studies from captive and free-ranging adult NHPs show that up to 100% were infected with simian foamy virus (SFV). In this study, we found that all cultured MSCs derived from adult cynomolgus monkey were infected with SFV by RT-PCR. Therefore, antiviral drugs must be added in MSCs culture. However, because of SFV infection and additive antiviral drugs, the infection efficiency of the lentiviral vectors reduced significantly. In this study, we improved the infection efficiency by disabled antiviral drugs before lentiviral infection. It might be provide technical assistance for the culture of adult cynomolgus monkey MSCs as genetically engineered cells applied to clinical and experimental research.

    Keywords: cynomolgus monkey mesenchymal stem cells, green fluorescent protein, lentiviral vectors, simian foamy viruses,transduction

    骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs) 是來自于骨髓的成體干細(xì)胞,因其具有增殖和多向分化潛能、造血支持、免疫調(diào)控等特點(diǎn)而備受關(guān)注[1-2]。MSCs在體外可分化成為脂肪、成骨、軟骨等中胚層的組織細(xì)胞。由于其良好的可塑性和不涉及倫理爭議,MSCs成為組織工程和細(xì)胞治療的最佳種子細(xì)胞[3-5]。在遺傳學(xué)上,MSCs易于轉(zhuǎn)導(dǎo)、表達(dá)外源基因[6]。不論是質(zhì)粒、還是病毒載體均可攜帶目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)MSCs,在體外長期、高效地表達(dá),而不影響干細(xì)胞的特性[7-9]。因此,MSCs是基因工程理想的靶細(xì)胞。

    非人靈長類 (NHPs) 和人類具有非常相近的遺傳背景[10-11],實(shí)驗(yàn)顯示NHPs與人類MSCs具有相似的生物學(xué)特征[12]。NHPs模型在評價藥物療效和移植治療等方面具有不可替代的價值[13]。然而,研究顯示成年 NHPs感染猴泡沫病毒 (SFV) 高達(dá)100%[14],體外培養(yǎng)來自于NHPs的MSCs必須添加抗病毒藥物[15],這給MSCs慢病毒感染帶來了困難。本研究采用密度梯度離心法,分離培養(yǎng)成年食蟹猴MSCs,復(fù)蘇后的MSCs停用抗病毒藥,在停藥6 d后感染綠色熒光蛋白 (GFP) 慢病毒載體,大幅提高成年食蟹猴MSCs慢病毒感染效率,為食蟹猴MSCs作為基因工程細(xì)胞進(jìn)一步應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)或臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1實(shí)驗(yàn)動物

    實(shí)驗(yàn)動物包括6只8~10歲健康成年食蟹猴和1只SFV陰性幼年食蟹猴,由廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司提供,靈長類動物按照國際實(shí)驗(yàn)動物評估和認(rèn)證管理委員會 (AAALAC) 的標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng),動物病原體檢疫和生物安全檢驗(yàn)合格。

    1.1.2細(xì)胞和質(zhì)粒

    293T細(xì)胞由北京大學(xué)生命科學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈。慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒DUET101-GFP、包裝質(zhì)粒CMV△8.91和PMD.G由美國Johns Hopkins大學(xué)程臨釗教授惠贈。

    1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑

    細(xì)胞培養(yǎng)試劑DMEM-F12、DMEM、OPTI-MEM、MSC-Qualified FBS、BSA、0.25%Trysin-EDTA、GlutaMAX?-I Supplement、N2、青鏈霉素等購自Invitrogen公司。Ficoll-Paque TM Plus單核細(xì)胞分離液購自 StemCell公司。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) 購自 R&D公司。轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000購自 Invitrogen公司。Polybrene、DMSO、Transferrin購自Sigma公司。潮霉素 (Hygromycin)購自 Roche公司。逆轉(zhuǎn)錄酶 SSII和 Trizol購自Invitrogen公司。rTaq酶購自TaKaRa公司,DNA mini kit購自 Qiagen公司。Tenofovir購自 LGM Pharmaceuticals公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1食蟹猴MSCs培養(yǎng)

    無菌條件下從食蟹猴髂骨嵴抽取5 mL骨髓,加入等體積的 DPBS稀釋,貼壁緩慢加入離心管內(nèi)盛有等體積的Ficoll分離液上,2 500 r/min離心20 min,小心吸取中間層細(xì)胞置于另一離心管中,PBS洗滌 2次,5×105cells/mL單核細(xì)胞種植在DMEM低糖培養(yǎng)基,包含10% FBS、1%青鏈霉素、1% GlutaMAX、20 ng/mL bFGF 和 10 μmol/L Tenofovir,5% CO2、37℃孵箱培養(yǎng),24 h后更換培養(yǎng)基,80%長滿后 0.25%胰酶消化傳代。體外培養(yǎng)擴(kuò)增 MSCs到一定數(shù)量后凍存,每毫升凍存液中細(xì)胞不應(yīng)低于106個細(xì)胞,異丙醇逐步降溫,?80℃過夜,轉(zhuǎn)移到液氮中保存。

    1.2.2體外培養(yǎng)MSCs感染SFV

    按照DNA提取試劑盒的操作步驟,提取食蟹猴MSCs基因組DNA。用Trizol裂解MSCs,提取RNA,Oligo(dT) 逆轉(zhuǎn)成cDNA。按照文獻(xiàn)報(bào)道[16-17],特異引物檢測體外培養(yǎng)的食蟹猴 MSCs感染 SFV的比例。引物序列包括:round 1:forward 5′-AGGATGGT GGGGACCAGCTA-3′;reverse 5′-GCTGCCCCTTG GTCAGAGTG-3′。round 2:forward 5′-CAGTGAA TTCCAGAATCTCTTC-3′;reverse 5′-CACTTATCCC ACTAGATGGTTC-3′。

    1.2.3慢病毒載體包裝和濃縮

    慢病毒包裝采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)染法,293T細(xì)胞培養(yǎng)在高糖 DMEM 培養(yǎng)基,包含 10%FBS、1% Glutamine和1%青鏈霉素。將293T細(xì)胞傳代于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿,待細(xì)胞80%匯合后轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過程中,首先將構(gòu)建好的編碼GFP的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 DUET101、包裝質(zhì)粒 CMV△8.91和PMD.G按一定比例溶于 OPTI-MEM 中,同時將Lipofectamine 2 000溶于等體積的OPTI-MEM中,室溫放置5 min。然后將兩者混合,輕柔混勻,室溫靜置20 min。用OPTI-MEM培養(yǎng)基更換293T細(xì)胞培養(yǎng)基后,加入轉(zhuǎn)染混合液。待轉(zhuǎn)染混合液培養(yǎng)8~12 h后,換成ITS培養(yǎng)基 (DMEM高糖培養(yǎng)基包含10 μg/mL Insulin、5 μg/mL Transferrin、1% Glutamine和1%青鏈霉素),分別于24 h和48 h后收集病毒上清,用0.45 μm濾器過濾細(xì)胞碎片,4℃保存。將病毒上清加入 Ultra-Plus 20濾膜,4℃、4 000× g離心20 min,所得濃縮病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行滴度鑒定后,?80℃保存,用于下一步實(shí)驗(yàn)。

    1.2.4慢病毒載體感染MSCs

    將成年食蟹猴MSCs凍存管從液氮中取出,37℃迅速解凍,轉(zhuǎn)移入15 mL離心管中加入10 mL不含抗病毒藥物Tenofovir的MSCs培養(yǎng)基,1 000 r/min離心2 min。吸出上清,種植于含有或不含抗病毒藥物Tenofovir的MSCs培養(yǎng)基中。按1∶3傳代,用含有或不含抗病毒藥物Tenofovir的MSCs培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 2~6 d。等到細(xì)胞長滿 70%,更換新鮮培養(yǎng)基,根據(jù)GFP慢病毒滴度和細(xì)胞數(shù)量,分別于不同的時間點(diǎn) (2、4、6 d),按不同拷貝數(shù) (1、5、10、15) 加入病毒上清,同時按培養(yǎng)基體積加入8 μg/mL的polybrene。孵育20 h后棄去轉(zhuǎn)染液,加入新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)1周后,熒光顯微鏡觀察GFP陽性細(xì)胞,流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)慢病毒感染效率。SFV陰性食蟹猴MSCs作為對照。

    1.3 統(tǒng)計(jì)分析

    數(shù)據(jù)以x±s表示,SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 成年食蟹猴MSCs培養(yǎng)

    骨髓單核細(xì)胞 (MNCs) 以 2×105cells/cm2接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶,48 h后更換培養(yǎng)基,2~4 d后出現(xiàn)增殖克隆,部分細(xì)胞呈紡錘形或多角形,大小長短不一。經(jīng)8~10 d培養(yǎng),細(xì)胞80%融合,細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變成以長梭形為主,呈渦旋狀排列生長。胰酶消化傳代,當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增到一定數(shù)量后凍存。

    2.2 慢病毒載體包裝和滴度檢測

    GFP慢病毒載體DUET101包含2個啟動子結(jié)構(gòu)EF1-α和PGK,分別驅(qū)動GFP基因和潮霉素抗性基因 (圖1E)。慢病毒載體系統(tǒng)的3個質(zhì)粒DUET101、CMV8.91和PMD.G按一定比例共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(圖1A、1B),收集感染后24 h,48 h的上清,濃縮后感染293T細(xì)胞 (圖1C),流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)GFP陽性細(xì)胞比例達(dá) 95% (圖 1D),計(jì)算病毒滴度為1×107TU/mL (TU,Transduction unit)。

    圖1 慢病毒載體包裝及滴度檢測Fig.1 Package and titer detection of lentiviral vectors. (A)293T cells (Magnification, 100×). (B) Package of lentiviral vectors in 293T cells (20 h after lipofectin transfection,Magnification, 100×). (C) Detection of the lentiviral titer by infecting 293T cells with concentrated virus (Magnification,100×). (D) The percentage of GFP positive cells by flow cytometry. (E) Sketch map of lentiviral vectors encoding GFP.

    2.3 成年食蟹猴MSCs感染猴泡沫病毒 (SFV)

    研究報(bào)道3歲以上的非人靈長類 (NHPs) 感染猴泡沫病毒 (SFV) 比例高達(dá)100%[14]。與前人的報(bào)道一致[15],體外培養(yǎng)食蟹猴MSCs添加抗病毒藥物Tenofovir,避免出現(xiàn)因 SFV感染引起的細(xì)胞融合(圖2A)。而沒有添加抗病毒藥物Tenofovir,將出現(xiàn)大的融合細(xì)胞,細(xì)胞無法分裂增殖 (圖2B)。RT-PCR確認(rèn)出現(xiàn)融合細(xì)胞的MSCs感染SFV (圖2C)。結(jié)果顯示,隨機(jī)選擇的6只8~10歲健康成年食蟹猴均感染SFV,體外培養(yǎng)必須添加Tenofovir,否則不超過3代即出現(xiàn)大片融合細(xì)胞,無法繼續(xù)傳代培養(yǎng) (圖2D)。添加抗病毒藥物能繼續(xù)體外培養(yǎng),且能維持MSCs正常的細(xì)胞形態(tài)和增殖分化能力[15]。

    圖2 成年食蟹猴MSCs感染SFVFig.2 SFV infection in cultured MSCs of adult cynomolgus monkey. (A) MSCs culture with Tenofovir (Magnification,200×). (B) The morphology of fusion cells were showed in MSCs culture without Tenofovir (Magnification, 200×). (C)RT-PCR reconfirmed MSCs infected with SFV. MSC (+) or (-)indicated the presence or absence of fusion cells in MSCs culture. (D) Adult cynomolgus monkey MSCs could be passaged for more than 10 with Tenofovir, and not more than passage 3 without Tenofovir.

    2.4 成年食蟹猴MSC轉(zhuǎn)染慢病毒

    SFV陰性的食蟹猴MSCs作為對照,檢測慢病毒感染食蟹猴MSCs效率。結(jié)果顯示,慢病毒MOI值為5和10,食蟹猴MSCs感染效率可達(dá)到80%以上 (圖3A)。在MOI值為10的條件下,隨著感染時間延長,感染效率逐漸提高,20 h后到達(dá)平臺水平,感染效率為85%左右 (圖3B)。

    圖 3 不同拷貝數(shù)或感染時間條件下慢病毒感染 SFV陰性MSCs的效率Fig.3 Infection efficiency of SFV negative MSCs with lentiviral vectors at different MOI or infection times. (A) The percentage of GFP positive cells at different MOI (*P<0.05,

    成年食蟹猴MSCs 均感染SFV,體外培養(yǎng)必須添加抗病毒藥物Tenofovir (圖4A、4F)。與SFV陰性MSCs感染效率比較 (圖3和圖4E、4J),SFV陽性MSCs由于感染SFV,以及培養(yǎng)添加的抗病毒藥物 Tenofovir,明顯降低慢病毒感染效率 (<10%)(圖4G和圖5)。因此,為了提高慢病毒的感染效率,在復(fù)蘇成年食蟹猴 MSCs后停用抗病毒藥物,分別于不同的時間點(diǎn),感染慢病毒 (圖 4H、4I和圖5),隨著停用時間的延長轉(zhuǎn)染效率相應(yīng)增加,停用 6 d后慢病毒轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到50% (圖4I和圖5)。但另一方面,由于成年食蟹猴MSCs感染SFV,隨著停用抗病毒藥物時間的延長,會出現(xiàn)融合細(xì)胞 (平均超過8 d后),MSCs將無法繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

    圖4 停用抗病毒藥物Tenofovir后不同時間點(diǎn)慢病毒載體的感染效率Fig.4 Infection efficiency of SFV positive MSCs without Tenofovir with lentiviral vectors at different time point after recovery by fluorescence microscope. (A) and (F) SFV positive MSCs with or without Tenofovir in culture (Magnification, 200×). (B) and (G)The very low infection efficiency of SFV positive MSCs with Tenofovir (Magnification, 400×). (C) and (H) The infection efficiency of SFV positive MSCs without Tenofovir at 2 days after the recovery was about 15% (Magnification, 200×). (D) and (I) The infection efficiency of SFV positive MSCs without Tenofovir at 6 days after the recovery was more than 50% (Magnification, 200×). (E) and(J) As a control, lentiviral vectors infected SFV negative MSCs, and the infection efficiency was about 85% (Magnification, 100×).

    圖5 流式細(xì)胞儀檢測停用抗病毒藥物Tenofovir不同時間點(diǎn)慢病毒載體的感染效率Fig.5 Infection efficiency of SFV positive MSCs without Tenofovir at different time point after the recovery of by flow cytometry (**P<0.01).

    3 討論

    猴泡沫病毒 (SFV) 主要感染非人靈長類(NHPs),包括大猩猩、狒狒、猴等。SFV通過體液傳播,能感染經(jīng)常接觸 NHPs的人群或其他物種。雖然研究顯示捕獲的或野外的 3歲以上的 NHPs感染SFV比例高達(dá)100%[14],但至今尚未發(fā)現(xiàn)SFV對NHPs有致病性。SFV物種間的傳播會引起致病性的改變[18-19],但尚沒有確切的證據(jù)表明人類感染 SFV而致病[20]。與之前的研究一致,本研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)8~10歲食蟹猴MSCs均感染SFV,體外培養(yǎng)擴(kuò)增MSCs必須添加抗病毒藥物。

    慢病毒和 SFV均屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科,為 RNA病毒[21-22],病毒基因均包括gag、pol和env 3個基本結(jié)構(gòu)基因。目前,現(xiàn)有的慢病毒載體來源于多個物種,如HIV-1、2型和SIV等。對HIV來源的慢病毒載體構(gòu)建研究最廣泛和深入,它與一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不同的是,對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力,可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而達(dá)到持久性表達(dá)[23]。本研究發(fā)現(xiàn),體外構(gòu)建的GFP慢病毒載體,感染293T細(xì)胞和食蟹猴MSCs效率分別高達(dá) 95%和85%以上,并能在體外持續(xù)表達(dá)。

    MSCs可以自體取材,體外擴(kuò)增,可作為基因工程改造細(xì)胞,不存在免疫排斥,上述優(yōu)點(diǎn)使MSCs成為各種疾病基因治療中不可替代的重要載體[24-26]。研究顯示,MSCs作為基因工程細(xì)胞,易于接受外援基因。對比各種基因轉(zhuǎn)導(dǎo) MSCs的方法,慢病毒具有最高的感染效率,并能穩(wěn)定表達(dá)[27]。本研究發(fā)現(xiàn),成年食蟹猴MSCs均感染SFV,體外培養(yǎng)MSCs必須添加抗病毒藥物,但由于SFV感染和添加抗病毒藥物的影響,慢病毒感染效率非常低下。因此,為了提高慢病毒的感染效率,復(fù)蘇成年食蟹猴 MSCs后停用抗病毒藥物,停藥 6 d慢病毒轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到50%,大幅提高SFV陽性MSCs的感染效率。另一方面,停用抗病毒的時間不宜過長,超過8 d后,MSCs會出現(xiàn)因SFV感染而引起的融合細(xì)胞,MSCs將無法繼續(xù)傳代培養(yǎng)。本研究解決了因SFV感染而引起的食蟹猴 MSCs慢病毒感染效率低下的問題,為食蟹猴 MSCs作為基因工程載體細(xì)胞應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供了技術(shù)保證。

    REFERENCES

    [1] Abdallah BM, Kassem M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications.Gene Ther, 2008, 15(2): 109–116.

    [2] Barry FP, Murphy JM. Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization.Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36(4): 568–584.

    [3] Agata H, Watanabe N, Ishii Y,et al. Feasibility and efficacy of bone tissue engineering using human bone marrow stromal cells cultivated in serum-free conditions.Biochem Biophys Res Commun, 2009, 382(2): 353–358.

    [4] Porada CD, Zanjani ED, Almeida-Porad G. Adult mesenchymal stem cells: a pluripotent population with multiple applications.Curr Stem Cell Res Ther, 2006,1(3): 365–369.

    [5] Krampera M, Pizzolo G, Aprili G,et al. Mesenchymal stem cells for bone, cartilage, tendon and skeletal muscle repair.Bone, 2006, 39(4): 678–683.

    [6] Bartholomew A, Patil S, Mackay A,et al. Baboon mesenchymal stem cells can be genetically modified to secrete human erythropoietinin vivo.Hum Gene Ther,2001, 12(12): 1527–1541.

    [7] Chan J, O’Donoghue K, de la Fuente J,et al. Human fetal mesenchymal stem cells as vehicles for gene delivery.Stem Cells, 2005, 23(1): 93–102.

    [8] Lee K, Majumdav MK, Buyaner D,et al. Human mesenchymal stem cells maintain transgene expression during expansion and differentiation.Mol Ther, 2001,3(6): 857–864.

    [9] Zhang XY, La Russa VF, Bao L,et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells.Mol Ther, 2002, 5(5Pt 1):555–565.

    [10] Boffelli D, McAuliffe J, Ovcharenko D,et al.Phylogenetic shadowing of primate sequences to find functional regions of the human genome.Science, 2003,299(5611): 1391–1394.

    [11] Dunbar CE. The use of nonhuman primate models to improve gene transfer into haematopoietic stem cells.J Intern Med, 2001, 249(4): 329–338.

    [12] Izadpanah R, Joswig T, Tsien F,et al. Characterization of multipotent mesenchymal stem cells from the bone marrow of rhesus macaques.Stem Cells Dev, 2005, 14(4):440–451.

    [13] Inaba M, Adachi Y, Hisha H,et al. Extensive studies on perfusion method plus intra-bone marrow-bone marrow transplantation using cynomolgus monkeys.Stem Cells,2007, 25(8): 2098–2103.

    [14] Jones-Engel L, Steinkraus KA, Murray SM,et al.Sensitive assays for simian foamy viruses reveal a high prevalence of infection in commensal, free-ranging Asian monkeys.J Virol, 2007, 81(14): 7330–7337.

    [15] Lee CC, Ye F, Tarantal AF. Comparison of growth and differentiation of fetal and adult rhesus monkey mesenchymal stem cells.Stem Cells Dev, 2006, 15(2):209–220.

    [16] Jones-Engel L, Engel GA, Schillaci MA,et al. Primate-tohuman retroviral transmission in Asia.Emerg Infect Dis,2005, 11(7): 1028–1035.

    [17] Jones-Engel L, May CC, Engel GA,et al. Diverse contexts of zoonotic transmission of simian foamy viruses in Asia.Emerg Infect Dis, 2008, 14(8): 1200–1208.

    [18] Murray SM, Picker LJ, Axthelm MK,et al. Expanded tissue targets for foamy virus replication with simian immunodeficiency virus-Induced immunosuppression.J Virol, 2006, 80(2): 663–670.

    [19] Cummins JE Jr, Boneva RS, Switzer WM,et al. Mucosal and systemic antibody responses in humans infected with Simian foamy virus.J Virol, 2005, 79(20): 13186–13189.

    [20] Switzer WM, Bhullar V, Shanmugam V,et al. Frequent simian foamy virus infection in persons occupationally exposed to nonhuman primates.J Virol, 2004, 78(6):2780–2789.

    [21] Neuman-Haefielin D. Foamy viruses.Intervirology, 1993,35: 196–207.

    [22] Lai Z, Brady RO. Gene transfer into the central nervous systemin vivousing a recombinant lentivirus vector.JNeurosci Res, 2002, 67(3): 363–371.

    [23] Chang LJ, Gay EE. The molecular genetics of lentiviral vectors--current and future perspectives.Curr Gene Ther,2001, 1(3): 237–251.

    [24] Himes BT, Neuhuber B, Coleman C,et al. Recovery of function following grafting of human bone marrow-derived stromal cells into the injured spinal cord.Neurorehabil Neural Repair, 2006, 20(2): 278–296.

    [25] Lee RH, Hsu SC, Munoz J,et al. A subset of human rapidly self-renewing marrow stromal cells preferentially engraft in mice.Blood, 2006, 107(5): 2153–2161.

    [26] Gregory CA, Prockop DJ, Spees JL. Non-hematopoietic bone marrow stem cells: molecular control of expansion and differentiation.Exp Cell Res, 2005, 306(2): 330–335.

    [27] McMahon JM, Conroy S, Lyons M,et al. Gene transfer into rat mesenchymal stem cells: a comparative study of viral and nonviral vectors.Stem Cells Dev, 2006, 15(1):87–96.

    Improving infection efficiency of adult cynomolgus monkey mesenchymal stem cells with lentiviral vectors

    Zhenhua Ren1,2, Shuyan Wang1, Ying Zhang1, Chunlin Zou1, and Y. Alex Zhang1

    1Cell Therapy Center,Xuanwu Hospital,Capital Medical University,Beijing100053,China
    2Department of Anatomy,Anhui Medical University,Hefei230032,China

    Received:January 27, 2010;Accepted:March 26, 2010

    Supported by:Scientific Project of Beijing Municipal Science & Technology Commission (No. D07050701350703).

    Corresponding author:Y. Alex Zhang. Tel: +86-10-63184557; Fax: +86-10-83198889; E-mail: yaz@bjsap.org

    北京市科委科技計(jì)劃 (No. D07050701350703) 資助。

    猜你喜歡
    食蟹抗病毒骨髓
    一起去食蟹
    Ancient stone tools were found
    慢性乙型肝炎抗病毒治療是關(guān)鍵
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:52
    抗病毒治療可有效降低HCC的發(fā)生及改善患者預(yù)后
    肝博士(2021年1期)2021-03-29 02:32:14
    抗病毒藥今天忘吃了,明天要多吃一片嗎?
    肝博士(2020年4期)2020-09-24 09:21:26
    宮頸癌術(shù)后調(diào)強(qiáng)放療中骨髓抑制與骨髓照射劑量體積的關(guān)系
    食蟹
    對抗病毒之歌
    融化的冰床
    中外文摘(2019年10期)2019-06-17 02:13:50
    贊美骨髓
    文苑(2018年18期)2018-11-08 11:12:42
    免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲国产精品一区二区三区在线| 精品福利永久在线观看| 一区在线观看完整版| 成年av动漫网址| 日韩大片免费观看网站| a级毛片在线看网站| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲精品美女久久av网站| 国产日韩欧美亚洲二区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 国产激情久久老熟女| 久久综合国产亚洲精品| 一二三四在线观看免费中文在| 高清在线视频一区二区三区| 久久久精品免费免费高清| 国产av精品麻豆| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 天天添夜夜摸| 精品少妇久久久久久888优播| 久久久久人妻精品一区果冻| 日韩伦理黄色片| 日本vs欧美在线观看视频| 大片电影免费在线观看免费| 两个人看的免费小视频| www日本在线高清视频| 久久久久精品性色| 国产熟女午夜一区二区三区| 大话2 男鬼变身卡| 久久久久久久久久久免费av| 精品国产露脸久久av麻豆| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 大香蕉久久网| 亚洲七黄色美女视频| 国产福利在线免费观看视频| av线在线观看网站| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美精品亚洲一区二区| 在线 av 中文字幕| 国产精品熟女久久久久浪| 一二三四在线观看免费中文在| 男人舔女人的私密视频| 人妻人人澡人人爽人人| 最近手机中文字幕大全| 韩国av在线不卡| 曰老女人黄片| 99久国产av精品国产电影| 国产亚洲av高清不卡| 搡老乐熟女国产| 亚洲国产精品一区三区| 9191精品国产免费久久| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲美女视频黄频| 咕卡用的链子| 亚洲欧美色中文字幕在线| 99国产综合亚洲精品| 极品人妻少妇av视频| 亚洲国产最新在线播放| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产成人精品久久久久久| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 色精品久久人妻99蜜桃| 综合色丁香网| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久99一区二区三区| 色综合欧美亚洲国产小说| 婷婷色综合www| 欧美av亚洲av综合av国产av | 国产日韩欧美视频二区| 免费看不卡的av| 国产精品国产三级专区第一集| 成人影院久久| 欧美亚洲日本最大视频资源| 波野结衣二区三区在线| 精品久久蜜臀av无| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 美女福利国产在线| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲国产欧美一区二区综合| 丰满迷人的少妇在线观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产不卡av网站在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 久久青草综合色| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 99精国产麻豆久久婷婷| 午夜久久久在线观看| 在现免费观看毛片| 纯流量卡能插随身wifi吗| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久97久久精品| 超碰成人久久| 亚洲精品在线美女| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产成人系列免费观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 交换朋友夫妻互换小说| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲精品乱久久久久久| netflix在线观看网站| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产精品一区二区精品视频观看| netflix在线观看网站| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲欧美清纯卡通| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久久精品区二区三区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 午夜影院在线不卡| 九草在线视频观看| 欧美精品一区二区大全| 在线观看免费日韩欧美大片| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 亚洲,欧美,日韩| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲av电影在线进入| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲av男天堂| 一区二区三区四区激情视频| 美国免费a级毛片| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲专区中文字幕在线 | 成人黄色视频免费在线看| 十分钟在线观看高清视频www| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 黄片播放在线免费| 精品国产国语对白av| 麻豆乱淫一区二区| 久久精品国产a三级三级三级| videos熟女内射| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产免费福利视频在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 欧美中文综合在线视频| 嫩草影院入口| 亚洲五月色婷婷综合| 国产日韩欧美亚洲二区| 另类亚洲欧美激情| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲av电影在线进入| 永久免费av网站大全| 哪个播放器可以免费观看大片| 99久久精品国产亚洲精品| 我的亚洲天堂| 人妻人人澡人人爽人人| 如何舔出高潮| 日韩电影二区| 国产一区二区三区综合在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 日韩精品有码人妻一区| 国产一区二区 视频在线| 亚洲国产最新在线播放| 电影成人av| av免费观看日本| av片东京热男人的天堂| xxxhd国产人妻xxx| 热99国产精品久久久久久7| 国产精品久久久久久精品古装| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 操出白浆在线播放| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲国产精品成人久久小说| 韩国精品一区二区三区| 午夜福利,免费看| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久久久久久久免费视频了| av国产精品久久久久影院| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 美国免费a级毛片| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 老司机在亚洲福利影院| 久热爱精品视频在线9| 不卡av一区二区三区| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 大片免费播放器 马上看| 丝袜脚勾引网站| 午夜免费观看性视频| 香蕉丝袜av| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 高清视频免费观看一区二区| 久久人妻熟女aⅴ| 久久人妻熟女aⅴ| 1024视频免费在线观看| 最新在线观看一区二区三区 | 日韩一本色道免费dvd| 色吧在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 精品久久久精品久久久| 韩国精品一区二区三区| 香蕉丝袜av| 亚洲精品乱久久久久久| 国产精品久久久久久精品电影小说| 在线观看人妻少妇| 免费观看av网站的网址| 日韩制服骚丝袜av| 我要看黄色一级片免费的| 国产精品免费视频内射| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲欧洲国产日韩| 99久久综合免费| 亚洲国产精品国产精品| 啦啦啦 在线观看视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 午夜免费鲁丝| 少妇 在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 国产免费现黄频在线看| 两性夫妻黄色片| 多毛熟女@视频| 午夜激情av网站| 日日啪夜夜爽| 精品一品国产午夜福利视频| 国产成人精品久久久久久| 2018国产大陆天天弄谢| 老司机深夜福利视频在线观看 | 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 美女视频免费永久观看网站| 日本黄色日本黄色录像| 香蕉国产在线看| 久久久久久久精品精品| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久午夜综合久久蜜桃| 老司机在亚洲福利影院| 丝袜喷水一区| 久久人妻熟女aⅴ| 精品国产一区二区久久| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 夫妻性生交免费视频一级片| 女人精品久久久久毛片| av国产精品久久久久影院| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产毛片在线视频| 中文欧美无线码| 久久99热这里只频精品6学生| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品久久久人人做人人爽| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲色图综合在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲欧美精品自产自拍| av片东京热男人的天堂| 男男h啪啪无遮挡| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 青春草亚洲视频在线观看| 99九九在线精品视频| 亚洲精品在线美女| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 波野结衣二区三区在线| 国产精品成人在线| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 日本欧美视频一区| 国产福利在线免费观看视频| www.精华液| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美激情高清一区二区三区 | 男女午夜视频在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 欧美成人午夜精品| 精品一品国产午夜福利视频| 一级,二级,三级黄色视频| 激情五月婷婷亚洲| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久久久精品人妻al黑| 色吧在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久热在线av| 亚洲成人国产一区在线观看 | 丝袜脚勾引网站| 人体艺术视频欧美日本| 美女福利国产在线| 亚洲在久久综合| 男女边吃奶边做爰视频| 精品一区二区三卡| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲图色成人| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 性色av一级| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 欧美日韩精品网址| 人成视频在线观看免费观看| 不卡av一区二区三区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 色视频在线一区二区三区| h视频一区二区三区| 一本色道久久久久久精品综合| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 中文欧美无线码| 一二三四在线观看免费中文在| 国产免费福利视频在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美人与善性xxx| 久久久精品94久久精品| 久久婷婷青草| 亚洲国产中文字幕在线视频| 日本欧美视频一区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲国产精品国产精品| 精品久久久久久电影网| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲国产av影院在线观看| 18禁动态无遮挡网站| 一区二区三区精品91| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产av码专区亚洲av| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲,欧美,日韩| 久久午夜综合久久蜜桃| 尾随美女入室| 伦理电影免费视频| 国产午夜精品一二区理论片| 国产高清国产精品国产三级| 熟女av电影| 欧美精品av麻豆av| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 美女中出高潮动态图| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 伊人久久国产一区二区| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 日韩视频在线欧美| 成人三级做爰电影| 日韩一区二区视频免费看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 欧美av亚洲av综合av国产av | 热99久久久久精品小说推荐| 成人影院久久| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 综合色丁香网| 国产探花极品一区二区| 免费观看性生交大片5| 亚洲在久久综合| 久久综合国产亚洲精品| 捣出白浆h1v1| 亚洲,一卡二卡三卡| 十八禁网站网址无遮挡| 丁香六月欧美| 免费高清在线观看日韩| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产老妇伦熟女老妇高清| 成年美女黄网站色视频大全免费| 老司机亚洲免费影院| 99精国产麻豆久久婷婷| 99久国产av精品国产电影| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美人与性动交α欧美软件| 黄频高清免费视频| 不卡av一区二区三区| 黄频高清免费视频| 久久久久精品性色| 久久久久久久久久久久大奶| 韩国av在线不卡| 国产极品天堂在线| 麻豆乱淫一区二区| 男人操女人黄网站| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 五月天丁香电影| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 精品久久久精品久久久| 丝袜美腿诱惑在线| 日本欧美国产在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 十八禁人妻一区二区| 久久久精品区二区三区| 欧美日韩一级在线毛片| 高清在线视频一区二区三区| 大码成人一级视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 成年动漫av网址| 夫妻午夜视频| 亚洲男人天堂网一区| 精品一区二区三区av网在线观看 | 色综合欧美亚洲国产小说| 三上悠亚av全集在线观看| 精品国产露脸久久av麻豆| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 9色porny在线观看| 国产在线一区二区三区精| 十八禁人妻一区二区| 亚洲四区av| 在线天堂中文资源库| 免费av中文字幕在线| 国产日韩欧美亚洲二区| 69精品国产乱码久久久| 99热全是精品| 一区在线观看完整版| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲伊人色综图| 国产97色在线日韩免费| 精品一区二区三卡| 中国国产av一级| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 丁香六月欧美| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 午夜日本视频在线| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久精品国产亚洲av高清一级| e午夜精品久久久久久久| 精品第一国产精品| 美女中出高潮动态图| 性少妇av在线| 韩国高清视频一区二区三区| 1024视频免费在线观看| 午夜激情av网站| 亚洲精品一区蜜桃| 99精品久久久久人妻精品| 久久久精品区二区三区| 久久免费观看电影| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲av电影在线进入| 欧美久久黑人一区二区| 日韩视频在线欧美| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 在线观看www视频免费| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产日韩欧美在线精品| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产黄色免费在线视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲四区av| 精品酒店卫生间| 国产片内射在线| 伊人久久国产一区二区| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲情色 制服丝袜| 成年动漫av网址| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 伊人久久国产一区二区| 国产男女内射视频| 国产成人一区二区在线| netflix在线观看网站| 国产福利在线免费观看视频| 性色av一级| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产又爽黄色视频| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲成人av在线免费| 女性被躁到高潮视频| 中文天堂在线官网| 亚洲精品国产区一区二| 成人国产av品久久久| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 最近中文字幕2019免费版| a 毛片基地| 两性夫妻黄色片| 亚洲av在线观看美女高潮| 777米奇影视久久| 人妻 亚洲 视频| av国产精品久久久久影院| 在线天堂最新版资源| 一级a爱视频在线免费观看| 国产精品无大码| 日日啪夜夜爽| 丰满乱子伦码专区| 岛国毛片在线播放| 亚洲一区中文字幕在线| 国产一区二区三区av在线| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产片内射在线| 伦理电影大哥的女人| 老司机影院成人| 一区二区三区精品91| 亚洲国产精品国产精品| www.熟女人妻精品国产| 女性生殖器流出的白浆| a 毛片基地| 最黄视频免费看| 免费少妇av软件| 精品第一国产精品| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 在线观看免费午夜福利视频| 欧美97在线视频| 黄色怎么调成土黄色| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 精品视频人人做人人爽| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲av日韩在线播放| 在线观看www视频免费| 桃花免费在线播放| 国产一卡二卡三卡精品 | 国产探花极品一区二区| av不卡在线播放| 久久99精品国语久久久| 91成人精品电影| 制服人妻中文乱码| 国产精品av久久久久免费| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| h视频一区二区三区| 亚洲精品av麻豆狂野| 永久免费av网站大全| 国产精品蜜桃在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久av网站| 最近手机中文字幕大全| 中文欧美无线码| 免费黄频网站在线观看国产| 久久综合国产亚洲精品| 成年美女黄网站色视频大全免费| 婷婷色av中文字幕| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 十八禁网站网址无遮挡| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 一区在线观看完整版| 精品国产一区二区三区四区第35| 国精品久久久久久国模美| 人成视频在线观看免费观看| 成年av动漫网址| 男女边吃奶边做爰视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一级a爱视频在线免费观看| 日本wwww免费看| 久久婷婷青草| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲国产av新网站| 午夜影院在线不卡| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲,欧美,日韩| 91精品国产国语对白视频| 欧美最新免费一区二区三区| 热99国产精品久久久久久7| 日韩一本色道免费dvd| 丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美日韩福利视频一区二区| av在线app专区| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲欧美成人精品一区二区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 精品一区二区三区av网在线观看 | 美女扒开内裤让男人捅视频| 伊人久久国产一区二区| 街头女战士在线观看网站| 久久ye,这里只有精品| 国产男女内射视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 制服丝袜香蕉在线| 午夜免费鲁丝| 久久狼人影院| 99久久精品国产亚洲精品| 天堂俺去俺来也www色官网| 天堂中文最新版在线下载| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲,欧美精品.| 国产激情久久老熟女| 一个人免费看片子| 国产成人啪精品午夜网站| 免费在线观看完整版高清| 亚洲精品久久午夜乱码| 免费高清在线观看日韩| 免费黄色在线免费观看| 日本vs欧美在线观看视频| 午夜免费观看性视频| av国产久精品久网站免费入址| 91国产中文字幕| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久ye,这里只有精品| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲国产欧美网| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产精品无大码| 亚洲专区中文字幕在线 | 激情视频va一区二区三区| 一区二区av电影网| avwww免费| xxxhd国产人妻xxx| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 日韩一区二区三区影片| 性少妇av在线| 久久天堂一区二区三区四区| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久精品国产亚洲av高清一级| 一二三四在线观看免费中文在| 日本午夜av视频| 在线观看人妻少妇| 欧美另类一区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久97久久精品| 男女下面插进去视频免费观看| 老司机靠b影院| 中文字幕色久视频| 在线精品无人区一区二区三| 欧美日韩国产mv在线观看视频|