• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    慢病毒載體感染成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

    2010-10-11 02:11:22任振華王淑艷張穎鄒春林張愚
    生物工程學(xué)報(bào) 2010年6期
    關(guān)鍵詞:食蟹抗病毒骨髓

    任振華,王淑艷,張穎,鄒春林,張愚

    1 首都醫(yī)科大學(xué) 宣武醫(yī)院細(xì)胞治療中心,北京 100053

    2 安徽醫(yī)科大學(xué) 人體解剖學(xué)教研室,合肥 230032

    組織工程與細(xì)胞培養(yǎng)

    慢病毒載體感染成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

    任振華1,2,王淑艷1,張穎1,鄒春林1,張愚1

    1 首都醫(yī)科大學(xué) 宣武醫(yī)院細(xì)胞治療中心,北京 100053

    2 安徽醫(yī)科大學(xué) 人體解剖學(xué)教研室,合肥 230032

    骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (Mesenchymal stem cells,MSCs) 具有增殖和多向分化潛能,臨床應(yīng)用廣泛,近年來備受關(guān)注。另一方面,MSCs易于轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)外源基因,是理想的基因工程細(xì)胞。非人靈長類 (NHPs) 和人類具有非常相近的遺傳背景,NHPs模型在評價藥物療效和移植治療等方面具有不可替代的價值。本研究采用密度梯度離心法分離成年食蟹猴骨髓單核細(xì)胞 (Marrow mononuclear cells,MNCs),貼壁培養(yǎng) MSCs。同時構(gòu)建表達(dá)綠色熒光蛋白 (Green fluorescent protein,GFP) 的慢病毒載體,感染成年食蟹猴MSCs。結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)的成年食蟹猴MSCs均感染猴泡沫病毒 (Simian foamy virus,SFV),體外培養(yǎng)成年食蟹猴MSCs必須添加抗病毒藥物Tenofovir。但由于食蟹猴MSCs感染SFV,以及培養(yǎng)中添加了抗病毒藥物Tenofovir,慢病毒載體的感染效率明顯降低 (<10%)。本研究通過停用抗病毒藥,在細(xì)胞復(fù)蘇后6 d轉(zhuǎn)染慢病毒,可大幅提高慢病毒的感染效率 (>50%)。為成年食蟹猴MSCs作為基因工程細(xì)胞應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供了技術(shù)保證。

    食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,綠色熒光蛋白,慢病毒載體,猴泡沫病毒,轉(zhuǎn)導(dǎo)

    Abstract:Mesenchymal stem cells (MSCs) have received considerable attention for various therapeutic approaches in recent years. MSCs are also easy to genetically modify to express therapeutic genes by using lentiviral vectors. Because of the similarities in genetics, physiology and metabolism between non-human primates (NHPs) and humans, NHPs models are invaluable for researching human disorders and for developing therapeutic strategies. Therefore, MSCs derived from NHPs could be a powerful tool for cell therapy and genetic engineering. Studies from captive and free-ranging adult NHPs show that up to 100% were infected with simian foamy virus (SFV). In this study, we found that all cultured MSCs derived from adult cynomolgus monkey were infected with SFV by RT-PCR. Therefore, antiviral drugs must be added in MSCs culture. However, because of SFV infection and additive antiviral drugs, the infection efficiency of the lentiviral vectors reduced significantly. In this study, we improved the infection efficiency by disabled antiviral drugs before lentiviral infection. It might be provide technical assistance for the culture of adult cynomolgus monkey MSCs as genetically engineered cells applied to clinical and experimental research.

    Keywords: cynomolgus monkey mesenchymal stem cells, green fluorescent protein, lentiviral vectors, simian foamy viruses,transduction

    骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs) 是來自于骨髓的成體干細(xì)胞,因其具有增殖和多向分化潛能、造血支持、免疫調(diào)控等特點(diǎn)而備受關(guān)注[1-2]。MSCs在體外可分化成為脂肪、成骨、軟骨等中胚層的組織細(xì)胞。由于其良好的可塑性和不涉及倫理爭議,MSCs成為組織工程和細(xì)胞治療的最佳種子細(xì)胞[3-5]。在遺傳學(xué)上,MSCs易于轉(zhuǎn)導(dǎo)、表達(dá)外源基因[6]。不論是質(zhì)粒、還是病毒載體均可攜帶目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)MSCs,在體外長期、高效地表達(dá),而不影響干細(xì)胞的特性[7-9]。因此,MSCs是基因工程理想的靶細(xì)胞。

    非人靈長類 (NHPs) 和人類具有非常相近的遺傳背景[10-11],實(shí)驗(yàn)顯示NHPs與人類MSCs具有相似的生物學(xué)特征[12]。NHPs模型在評價藥物療效和移植治療等方面具有不可替代的價值[13]。然而,研究顯示成年 NHPs感染猴泡沫病毒 (SFV) 高達(dá)100%[14],體外培養(yǎng)來自于NHPs的MSCs必須添加抗病毒藥物[15],這給MSCs慢病毒感染帶來了困難。本研究采用密度梯度離心法,分離培養(yǎng)成年食蟹猴MSCs,復(fù)蘇后的MSCs停用抗病毒藥,在停藥6 d后感染綠色熒光蛋白 (GFP) 慢病毒載體,大幅提高成年食蟹猴MSCs慢病毒感染效率,為食蟹猴MSCs作為基因工程細(xì)胞進(jìn)一步應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)或臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1實(shí)驗(yàn)動物

    實(shí)驗(yàn)動物包括6只8~10歲健康成年食蟹猴和1只SFV陰性幼年食蟹猴,由廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司提供,靈長類動物按照國際實(shí)驗(yàn)動物評估和認(rèn)證管理委員會 (AAALAC) 的標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng),動物病原體檢疫和生物安全檢驗(yàn)合格。

    1.1.2細(xì)胞和質(zhì)粒

    293T細(xì)胞由北京大學(xué)生命科學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈。慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒DUET101-GFP、包裝質(zhì)粒CMV△8.91和PMD.G由美國Johns Hopkins大學(xué)程臨釗教授惠贈。

    1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑

    細(xì)胞培養(yǎng)試劑DMEM-F12、DMEM、OPTI-MEM、MSC-Qualified FBS、BSA、0.25%Trysin-EDTA、GlutaMAX?-I Supplement、N2、青鏈霉素等購自Invitrogen公司。Ficoll-Paque TM Plus單核細(xì)胞分離液購自 StemCell公司。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) 購自 R&D公司。轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000購自 Invitrogen公司。Polybrene、DMSO、Transferrin購自Sigma公司。潮霉素 (Hygromycin)購自 Roche公司。逆轉(zhuǎn)錄酶 SSII和 Trizol購自Invitrogen公司。rTaq酶購自TaKaRa公司,DNA mini kit購自 Qiagen公司。Tenofovir購自 LGM Pharmaceuticals公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1食蟹猴MSCs培養(yǎng)

    無菌條件下從食蟹猴髂骨嵴抽取5 mL骨髓,加入等體積的 DPBS稀釋,貼壁緩慢加入離心管內(nèi)盛有等體積的Ficoll分離液上,2 500 r/min離心20 min,小心吸取中間層細(xì)胞置于另一離心管中,PBS洗滌 2次,5×105cells/mL單核細(xì)胞種植在DMEM低糖培養(yǎng)基,包含10% FBS、1%青鏈霉素、1% GlutaMAX、20 ng/mL bFGF 和 10 μmol/L Tenofovir,5% CO2、37℃孵箱培養(yǎng),24 h后更換培養(yǎng)基,80%長滿后 0.25%胰酶消化傳代。體外培養(yǎng)擴(kuò)增 MSCs到一定數(shù)量后凍存,每毫升凍存液中細(xì)胞不應(yīng)低于106個細(xì)胞,異丙醇逐步降溫,?80℃過夜,轉(zhuǎn)移到液氮中保存。

    1.2.2體外培養(yǎng)MSCs感染SFV

    按照DNA提取試劑盒的操作步驟,提取食蟹猴MSCs基因組DNA。用Trizol裂解MSCs,提取RNA,Oligo(dT) 逆轉(zhuǎn)成cDNA。按照文獻(xiàn)報(bào)道[16-17],特異引物檢測體外培養(yǎng)的食蟹猴 MSCs感染 SFV的比例。引物序列包括:round 1:forward 5′-AGGATGGT GGGGACCAGCTA-3′;reverse 5′-GCTGCCCCTTG GTCAGAGTG-3′。round 2:forward 5′-CAGTGAA TTCCAGAATCTCTTC-3′;reverse 5′-CACTTATCCC ACTAGATGGTTC-3′。

    1.2.3慢病毒載體包裝和濃縮

    慢病毒包裝采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)染法,293T細(xì)胞培養(yǎng)在高糖 DMEM 培養(yǎng)基,包含 10%FBS、1% Glutamine和1%青鏈霉素。將293T細(xì)胞傳代于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿,待細(xì)胞80%匯合后轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過程中,首先將構(gòu)建好的編碼GFP的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 DUET101、包裝質(zhì)粒 CMV△8.91和PMD.G按一定比例溶于 OPTI-MEM 中,同時將Lipofectamine 2 000溶于等體積的OPTI-MEM中,室溫放置5 min。然后將兩者混合,輕柔混勻,室溫靜置20 min。用OPTI-MEM培養(yǎng)基更換293T細(xì)胞培養(yǎng)基后,加入轉(zhuǎn)染混合液。待轉(zhuǎn)染混合液培養(yǎng)8~12 h后,換成ITS培養(yǎng)基 (DMEM高糖培養(yǎng)基包含10 μg/mL Insulin、5 μg/mL Transferrin、1% Glutamine和1%青鏈霉素),分別于24 h和48 h后收集病毒上清,用0.45 μm濾器過濾細(xì)胞碎片,4℃保存。將病毒上清加入 Ultra-Plus 20濾膜,4℃、4 000× g離心20 min,所得濃縮病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行滴度鑒定后,?80℃保存,用于下一步實(shí)驗(yàn)。

    1.2.4慢病毒載體感染MSCs

    將成年食蟹猴MSCs凍存管從液氮中取出,37℃迅速解凍,轉(zhuǎn)移入15 mL離心管中加入10 mL不含抗病毒藥物Tenofovir的MSCs培養(yǎng)基,1 000 r/min離心2 min。吸出上清,種植于含有或不含抗病毒藥物Tenofovir的MSCs培養(yǎng)基中。按1∶3傳代,用含有或不含抗病毒藥物Tenofovir的MSCs培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 2~6 d。等到細(xì)胞長滿 70%,更換新鮮培養(yǎng)基,根據(jù)GFP慢病毒滴度和細(xì)胞數(shù)量,分別于不同的時間點(diǎn) (2、4、6 d),按不同拷貝數(shù) (1、5、10、15) 加入病毒上清,同時按培養(yǎng)基體積加入8 μg/mL的polybrene。孵育20 h后棄去轉(zhuǎn)染液,加入新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)1周后,熒光顯微鏡觀察GFP陽性細(xì)胞,流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)慢病毒感染效率。SFV陰性食蟹猴MSCs作為對照。

    1.3 統(tǒng)計(jì)分析

    數(shù)據(jù)以x±s表示,SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 成年食蟹猴MSCs培養(yǎng)

    骨髓單核細(xì)胞 (MNCs) 以 2×105cells/cm2接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶,48 h后更換培養(yǎng)基,2~4 d后出現(xiàn)增殖克隆,部分細(xì)胞呈紡錘形或多角形,大小長短不一。經(jīng)8~10 d培養(yǎng),細(xì)胞80%融合,細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變成以長梭形為主,呈渦旋狀排列生長。胰酶消化傳代,當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增到一定數(shù)量后凍存。

    2.2 慢病毒載體包裝和滴度檢測

    GFP慢病毒載體DUET101包含2個啟動子結(jié)構(gòu)EF1-α和PGK,分別驅(qū)動GFP基因和潮霉素抗性基因 (圖1E)。慢病毒載體系統(tǒng)的3個質(zhì)粒DUET101、CMV8.91和PMD.G按一定比例共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(圖1A、1B),收集感染后24 h,48 h的上清,濃縮后感染293T細(xì)胞 (圖1C),流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)GFP陽性細(xì)胞比例達(dá) 95% (圖 1D),計(jì)算病毒滴度為1×107TU/mL (TU,Transduction unit)。

    圖1 慢病毒載體包裝及滴度檢測Fig.1 Package and titer detection of lentiviral vectors. (A)293T cells (Magnification, 100×). (B) Package of lentiviral vectors in 293T cells (20 h after lipofectin transfection,Magnification, 100×). (C) Detection of the lentiviral titer by infecting 293T cells with concentrated virus (Magnification,100×). (D) The percentage of GFP positive cells by flow cytometry. (E) Sketch map of lentiviral vectors encoding GFP.

    2.3 成年食蟹猴MSCs感染猴泡沫病毒 (SFV)

    研究報(bào)道3歲以上的非人靈長類 (NHPs) 感染猴泡沫病毒 (SFV) 比例高達(dá)100%[14]。與前人的報(bào)道一致[15],體外培養(yǎng)食蟹猴MSCs添加抗病毒藥物Tenofovir,避免出現(xiàn)因 SFV感染引起的細(xì)胞融合(圖2A)。而沒有添加抗病毒藥物Tenofovir,將出現(xiàn)大的融合細(xì)胞,細(xì)胞無法分裂增殖 (圖2B)。RT-PCR確認(rèn)出現(xiàn)融合細(xì)胞的MSCs感染SFV (圖2C)。結(jié)果顯示,隨機(jī)選擇的6只8~10歲健康成年食蟹猴均感染SFV,體外培養(yǎng)必須添加Tenofovir,否則不超過3代即出現(xiàn)大片融合細(xì)胞,無法繼續(xù)傳代培養(yǎng) (圖2D)。添加抗病毒藥物能繼續(xù)體外培養(yǎng),且能維持MSCs正常的細(xì)胞形態(tài)和增殖分化能力[15]。

    圖2 成年食蟹猴MSCs感染SFVFig.2 SFV infection in cultured MSCs of adult cynomolgus monkey. (A) MSCs culture with Tenofovir (Magnification,200×). (B) The morphology of fusion cells were showed in MSCs culture without Tenofovir (Magnification, 200×). (C)RT-PCR reconfirmed MSCs infected with SFV. MSC (+) or (-)indicated the presence or absence of fusion cells in MSCs culture. (D) Adult cynomolgus monkey MSCs could be passaged for more than 10 with Tenofovir, and not more than passage 3 without Tenofovir.

    2.4 成年食蟹猴MSC轉(zhuǎn)染慢病毒

    SFV陰性的食蟹猴MSCs作為對照,檢測慢病毒感染食蟹猴MSCs效率。結(jié)果顯示,慢病毒MOI值為5和10,食蟹猴MSCs感染效率可達(dá)到80%以上 (圖3A)。在MOI值為10的條件下,隨著感染時間延長,感染效率逐漸提高,20 h后到達(dá)平臺水平,感染效率為85%左右 (圖3B)。

    圖 3 不同拷貝數(shù)或感染時間條件下慢病毒感染 SFV陰性MSCs的效率Fig.3 Infection efficiency of SFV negative MSCs with lentiviral vectors at different MOI or infection times. (A) The percentage of GFP positive cells at different MOI (*P<0.05,

    成年食蟹猴MSCs 均感染SFV,體外培養(yǎng)必須添加抗病毒藥物Tenofovir (圖4A、4F)。與SFV陰性MSCs感染效率比較 (圖3和圖4E、4J),SFV陽性MSCs由于感染SFV,以及培養(yǎng)添加的抗病毒藥物 Tenofovir,明顯降低慢病毒感染效率 (<10%)(圖4G和圖5)。因此,為了提高慢病毒的感染效率,在復(fù)蘇成年食蟹猴 MSCs后停用抗病毒藥物,分別于不同的時間點(diǎn),感染慢病毒 (圖 4H、4I和圖5),隨著停用時間的延長轉(zhuǎn)染效率相應(yīng)增加,停用 6 d后慢病毒轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到50% (圖4I和圖5)。但另一方面,由于成年食蟹猴MSCs感染SFV,隨著停用抗病毒藥物時間的延長,會出現(xiàn)融合細(xì)胞 (平均超過8 d后),MSCs將無法繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

    圖4 停用抗病毒藥物Tenofovir后不同時間點(diǎn)慢病毒載體的感染效率Fig.4 Infection efficiency of SFV positive MSCs without Tenofovir with lentiviral vectors at different time point after recovery by fluorescence microscope. (A) and (F) SFV positive MSCs with or without Tenofovir in culture (Magnification, 200×). (B) and (G)The very low infection efficiency of SFV positive MSCs with Tenofovir (Magnification, 400×). (C) and (H) The infection efficiency of SFV positive MSCs without Tenofovir at 2 days after the recovery was about 15% (Magnification, 200×). (D) and (I) The infection efficiency of SFV positive MSCs without Tenofovir at 6 days after the recovery was more than 50% (Magnification, 200×). (E) and(J) As a control, lentiviral vectors infected SFV negative MSCs, and the infection efficiency was about 85% (Magnification, 100×).

    圖5 流式細(xì)胞儀檢測停用抗病毒藥物Tenofovir不同時間點(diǎn)慢病毒載體的感染效率Fig.5 Infection efficiency of SFV positive MSCs without Tenofovir at different time point after the recovery of by flow cytometry (**P<0.01).

    3 討論

    猴泡沫病毒 (SFV) 主要感染非人靈長類(NHPs),包括大猩猩、狒狒、猴等。SFV通過體液傳播,能感染經(jīng)常接觸 NHPs的人群或其他物種。雖然研究顯示捕獲的或野外的 3歲以上的 NHPs感染SFV比例高達(dá)100%[14],但至今尚未發(fā)現(xiàn)SFV對NHPs有致病性。SFV物種間的傳播會引起致病性的改變[18-19],但尚沒有確切的證據(jù)表明人類感染 SFV而致病[20]。與之前的研究一致,本研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)8~10歲食蟹猴MSCs均感染SFV,體外培養(yǎng)擴(kuò)增MSCs必須添加抗病毒藥物。

    慢病毒和 SFV均屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科,為 RNA病毒[21-22],病毒基因均包括gag、pol和env 3個基本結(jié)構(gòu)基因。目前,現(xiàn)有的慢病毒載體來源于多個物種,如HIV-1、2型和SIV等。對HIV來源的慢病毒載體構(gòu)建研究最廣泛和深入,它與一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不同的是,對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力,可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而達(dá)到持久性表達(dá)[23]。本研究發(fā)現(xiàn),體外構(gòu)建的GFP慢病毒載體,感染293T細(xì)胞和食蟹猴MSCs效率分別高達(dá) 95%和85%以上,并能在體外持續(xù)表達(dá)。

    MSCs可以自體取材,體外擴(kuò)增,可作為基因工程改造細(xì)胞,不存在免疫排斥,上述優(yōu)點(diǎn)使MSCs成為各種疾病基因治療中不可替代的重要載體[24-26]。研究顯示,MSCs作為基因工程細(xì)胞,易于接受外援基因。對比各種基因轉(zhuǎn)導(dǎo) MSCs的方法,慢病毒具有最高的感染效率,并能穩(wěn)定表達(dá)[27]。本研究發(fā)現(xiàn),成年食蟹猴MSCs均感染SFV,體外培養(yǎng)MSCs必須添加抗病毒藥物,但由于SFV感染和添加抗病毒藥物的影響,慢病毒感染效率非常低下。因此,為了提高慢病毒的感染效率,復(fù)蘇成年食蟹猴 MSCs后停用抗病毒藥物,停藥 6 d慢病毒轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到50%,大幅提高SFV陽性MSCs的感染效率。另一方面,停用抗病毒的時間不宜過長,超過8 d后,MSCs會出現(xiàn)因SFV感染而引起的融合細(xì)胞,MSCs將無法繼續(xù)傳代培養(yǎng)。本研究解決了因SFV感染而引起的食蟹猴 MSCs慢病毒感染效率低下的問題,為食蟹猴 MSCs作為基因工程載體細(xì)胞應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供了技術(shù)保證。

    REFERENCES

    [1] Abdallah BM, Kassem M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications.Gene Ther, 2008, 15(2): 109–116.

    [2] Barry FP, Murphy JM. Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization.Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36(4): 568–584.

    [3] Agata H, Watanabe N, Ishii Y,et al. Feasibility and efficacy of bone tissue engineering using human bone marrow stromal cells cultivated in serum-free conditions.Biochem Biophys Res Commun, 2009, 382(2): 353–358.

    [4] Porada CD, Zanjani ED, Almeida-Porad G. Adult mesenchymal stem cells: a pluripotent population with multiple applications.Curr Stem Cell Res Ther, 2006,1(3): 365–369.

    [5] Krampera M, Pizzolo G, Aprili G,et al. Mesenchymal stem cells for bone, cartilage, tendon and skeletal muscle repair.Bone, 2006, 39(4): 678–683.

    [6] Bartholomew A, Patil S, Mackay A,et al. Baboon mesenchymal stem cells can be genetically modified to secrete human erythropoietinin vivo.Hum Gene Ther,2001, 12(12): 1527–1541.

    [7] Chan J, O’Donoghue K, de la Fuente J,et al. Human fetal mesenchymal stem cells as vehicles for gene delivery.Stem Cells, 2005, 23(1): 93–102.

    [8] Lee K, Majumdav MK, Buyaner D,et al. Human mesenchymal stem cells maintain transgene expression during expansion and differentiation.Mol Ther, 2001,3(6): 857–864.

    [9] Zhang XY, La Russa VF, Bao L,et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells.Mol Ther, 2002, 5(5Pt 1):555–565.

    [10] Boffelli D, McAuliffe J, Ovcharenko D,et al.Phylogenetic shadowing of primate sequences to find functional regions of the human genome.Science, 2003,299(5611): 1391–1394.

    [11] Dunbar CE. The use of nonhuman primate models to improve gene transfer into haematopoietic stem cells.J Intern Med, 2001, 249(4): 329–338.

    [12] Izadpanah R, Joswig T, Tsien F,et al. Characterization of multipotent mesenchymal stem cells from the bone marrow of rhesus macaques.Stem Cells Dev, 2005, 14(4):440–451.

    [13] Inaba M, Adachi Y, Hisha H,et al. Extensive studies on perfusion method plus intra-bone marrow-bone marrow transplantation using cynomolgus monkeys.Stem Cells,2007, 25(8): 2098–2103.

    [14] Jones-Engel L, Steinkraus KA, Murray SM,et al.Sensitive assays for simian foamy viruses reveal a high prevalence of infection in commensal, free-ranging Asian monkeys.J Virol, 2007, 81(14): 7330–7337.

    [15] Lee CC, Ye F, Tarantal AF. Comparison of growth and differentiation of fetal and adult rhesus monkey mesenchymal stem cells.Stem Cells Dev, 2006, 15(2):209–220.

    [16] Jones-Engel L, Engel GA, Schillaci MA,et al. Primate-tohuman retroviral transmission in Asia.Emerg Infect Dis,2005, 11(7): 1028–1035.

    [17] Jones-Engel L, May CC, Engel GA,et al. Diverse contexts of zoonotic transmission of simian foamy viruses in Asia.Emerg Infect Dis, 2008, 14(8): 1200–1208.

    [18] Murray SM, Picker LJ, Axthelm MK,et al. Expanded tissue targets for foamy virus replication with simian immunodeficiency virus-Induced immunosuppression.J Virol, 2006, 80(2): 663–670.

    [19] Cummins JE Jr, Boneva RS, Switzer WM,et al. Mucosal and systemic antibody responses in humans infected with Simian foamy virus.J Virol, 2005, 79(20): 13186–13189.

    [20] Switzer WM, Bhullar V, Shanmugam V,et al. Frequent simian foamy virus infection in persons occupationally exposed to nonhuman primates.J Virol, 2004, 78(6):2780–2789.

    [21] Neuman-Haefielin D. Foamy viruses.Intervirology, 1993,35: 196–207.

    [22] Lai Z, Brady RO. Gene transfer into the central nervous systemin vivousing a recombinant lentivirus vector.JNeurosci Res, 2002, 67(3): 363–371.

    [23] Chang LJ, Gay EE. The molecular genetics of lentiviral vectors--current and future perspectives.Curr Gene Ther,2001, 1(3): 237–251.

    [24] Himes BT, Neuhuber B, Coleman C,et al. Recovery of function following grafting of human bone marrow-derived stromal cells into the injured spinal cord.Neurorehabil Neural Repair, 2006, 20(2): 278–296.

    [25] Lee RH, Hsu SC, Munoz J,et al. A subset of human rapidly self-renewing marrow stromal cells preferentially engraft in mice.Blood, 2006, 107(5): 2153–2161.

    [26] Gregory CA, Prockop DJ, Spees JL. Non-hematopoietic bone marrow stem cells: molecular control of expansion and differentiation.Exp Cell Res, 2005, 306(2): 330–335.

    [27] McMahon JM, Conroy S, Lyons M,et al. Gene transfer into rat mesenchymal stem cells: a comparative study of viral and nonviral vectors.Stem Cells Dev, 2006, 15(1):87–96.

    Improving infection efficiency of adult cynomolgus monkey mesenchymal stem cells with lentiviral vectors

    Zhenhua Ren1,2, Shuyan Wang1, Ying Zhang1, Chunlin Zou1, and Y. Alex Zhang1

    1Cell Therapy Center,Xuanwu Hospital,Capital Medical University,Beijing100053,China
    2Department of Anatomy,Anhui Medical University,Hefei230032,China

    Received:January 27, 2010;Accepted:March 26, 2010

    Supported by:Scientific Project of Beijing Municipal Science & Technology Commission (No. D07050701350703).

    Corresponding author:Y. Alex Zhang. Tel: +86-10-63184557; Fax: +86-10-83198889; E-mail: yaz@bjsap.org

    北京市科委科技計(jì)劃 (No. D07050701350703) 資助。

    猜你喜歡
    食蟹抗病毒骨髓
    一起去食蟹
    Ancient stone tools were found
    慢性乙型肝炎抗病毒治療是關(guān)鍵
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:52
    抗病毒治療可有效降低HCC的發(fā)生及改善患者預(yù)后
    肝博士(2021年1期)2021-03-29 02:32:14
    抗病毒藥今天忘吃了,明天要多吃一片嗎?
    肝博士(2020年4期)2020-09-24 09:21:26
    宮頸癌術(shù)后調(diào)強(qiáng)放療中骨髓抑制與骨髓照射劑量體積的關(guān)系
    食蟹
    對抗病毒之歌
    融化的冰床
    中外文摘(2019年10期)2019-06-17 02:13:50
    贊美骨髓
    文苑(2018年18期)2018-11-08 11:12:42
    白带黄色成豆腐渣| 午夜亚洲福利在线播放| 人人妻人人澡人人看| 午夜久久久久精精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 丝袜在线中文字幕| 亚洲av成人av| 一区二区三区精品91| www.精华液| 757午夜福利合集在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| www日本黄色视频网| 午夜福利免费观看在线| 亚洲成人久久爱视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 精品国产美女av久久久久小说| 大型av网站在线播放| 十分钟在线观看高清视频www| 真人做人爱边吃奶动态| 成人国产一区最新在线观看| 在线天堂中文资源库| 男人的好看免费观看在线视频 | 校园春色视频在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲人成电影免费在线| 国产1区2区3区精品| 亚洲精品国产区一区二| 国产欧美日韩精品亚洲av| 俺也久久电影网| 法律面前人人平等表现在哪些方面| av电影中文网址| 日韩精品青青久久久久久| 99在线人妻在线中文字幕| 男人操女人黄网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 日本成人三级电影网站| 日韩欧美三级三区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产一区二区三区视频了| 国产91精品成人一区二区三区| 久久亚洲真实| 一本精品99久久精品77| 在线观看免费视频日本深夜| 日本精品一区二区三区蜜桃| 在线观看免费午夜福利视频| 在线国产一区二区在线| 村上凉子中文字幕在线| 国产成人精品无人区| 少妇的丰满在线观看| 韩国av一区二区三区四区| 午夜福利在线在线| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 最新在线观看一区二区三区| 岛国在线观看网站| 欧美午夜高清在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产爱豆传媒在线观看 | 99精品久久久久人妻精品| 99精品在免费线老司机午夜| 日韩精品青青久久久久久| or卡值多少钱| 91麻豆av在线| 在线观看免费视频日本深夜| 黄色视频不卡| 女警被强在线播放| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 91国产中文字幕| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产精品影院久久| 性色av乱码一区二区三区2| 国产成人欧美在线观看| 亚洲五月色婷婷综合| 久久中文看片网| 一本一本综合久久| 热re99久久国产66热| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲av电影在线进入| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 人人妻人人澡欧美一区二区| 大型av网站在线播放| 国产精品 欧美亚洲| 一级黄色大片毛片| 久久久水蜜桃国产精品网| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久久久久人人人人人| 免费看美女性在线毛片视频| 国产高清videossex| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲av美国av| 久久这里只有精品19| 国产成+人综合+亚洲专区| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久久久国内视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 男人舔奶头视频| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产精品久久电影中文字幕| 欧美日韩黄片免| 免费高清视频大片| e午夜精品久久久久久久| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 麻豆国产av国片精品| 中文字幕av电影在线播放| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产伦人伦偷精品视频| 中文字幕最新亚洲高清| 一区二区三区高清视频在线| 日本免费a在线| 人妻久久中文字幕网| 国产乱人伦免费视频| 久久天堂一区二区三区四区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲一区中文字幕在线| 99精品欧美一区二区三区四区| 久9热在线精品视频| 一区二区三区国产精品乱码| 91成人精品电影| 欧美成人性av电影在线观看| 人人澡人人妻人| www.自偷自拍.com| 黄频高清免费视频| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产精品亚洲一级av第二区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 女人被狂操c到高潮| 日韩精品中文字幕看吧| 香蕉av资源在线| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 免费一级毛片在线播放高清视频| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 999精品在线视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲精华国产精华精| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲全国av大片| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 天天添夜夜摸| 黄片播放在线免费| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 欧美乱妇无乱码| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 亚洲天堂国产精品一区在线| 最好的美女福利视频网| 久久久久九九精品影院| 免费一级毛片在线播放高清视频| 黄色女人牲交| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲专区国产一区二区| 久久久水蜜桃国产精品网| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 精品乱码久久久久久99久播| 国产v大片淫在线免费观看| 女同久久另类99精品国产91| 99在线人妻在线中文字幕| 久久久国产成人精品二区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 免费高清在线观看日韩| 国产精品永久免费网站| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久中文字幕一级| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲真实伦在线观看| 色播亚洲综合网| 精品国内亚洲2022精品成人| 午夜a级毛片| 青草久久国产| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 免费av毛片视频| 黄色片一级片一级黄色片| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 女警被强在线播放| 亚洲三区欧美一区| 亚洲av熟女| 国产在线精品亚洲第一网站| 村上凉子中文字幕在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美成人性av电影在线观看| 午夜日韩欧美国产| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 精品久久久久久成人av| 波多野结衣高清无吗| 久久亚洲真实| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲色图av天堂| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 在线播放国产精品三级| 日本免费一区二区三区高清不卡| 久久精品影院6| 免费搜索国产男女视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 午夜成年电影在线免费观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产视频一区二区在线看| 久久精品影院6| 人妻久久中文字幕网| 丝袜在线中文字幕| 又大又爽又粗| 日本熟妇午夜| 久久久久久久午夜电影| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产av不卡久久| 久久草成人影院| 999久久久精品免费观看国产| 精品国产乱码久久久久久男人| 日本一本二区三区精品| 国产高清激情床上av| 一进一出抽搐动态| 色哟哟哟哟哟哟| 欧美zozozo另类| 可以在线观看毛片的网站| 久久亚洲精品不卡| 国产单亲对白刺激| 午夜福利高清视频| 最近最新免费中文字幕在线| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产欧美日韩一区二区三| 手机成人av网站| 男女午夜视频在线观看| 在线天堂中文资源库| 午夜精品在线福利| 久久热在线av| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美成人性av电影在线观看| 国产亚洲精品一区二区www| 欧美激情 高清一区二区三区| 少妇的丰满在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产精品 国内视频| 亚洲av成人一区二区三| 免费高清视频大片| 两个人看的免费小视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 欧美日韩一级在线毛片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产高清视频在线播放一区| 午夜免费激情av| 中文字幕精品免费在线观看视频| 淫秽高清视频在线观看| 脱女人内裤的视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 99热这里只有精品一区 | 久久精品国产综合久久久| 18禁国产床啪视频网站| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲全国av大片| 黄片大片在线免费观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产成人精品无人区| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲无线在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 他把我摸到了高潮在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 国产三级在线视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 一本一本综合久久| 在线观看www视频免费| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 男女之事视频高清在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲无线在线观看| 一区二区三区国产精品乱码| 国产一区二区激情短视频| 精品第一国产精品| 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美中文综合在线视频| 丁香欧美五月| 国产单亲对白刺激| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 日韩欧美 国产精品| 99国产精品一区二区三区| 日韩三级视频一区二区三区| 九色国产91popny在线| 美女午夜性视频免费| 99热6这里只有精品| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 嫁个100分男人电影在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产亚洲精品久久久久5区| 成人欧美大片| 欧美激情极品国产一区二区三区| 淫妇啪啪啪对白视频| 无遮挡黄片免费观看| 久99久视频精品免费| 亚洲中文字幕日韩| 国产精华一区二区三区| 亚洲成人免费电影在线观看| 麻豆av在线久日| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲黑人精品在线| 岛国在线观看网站| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美乱色亚洲激情| 一夜夜www| 99久久99久久久精品蜜桃| 免费高清视频大片| 日日夜夜操网爽| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产av一区在线观看免费| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 日韩精品免费视频一区二区三区| 香蕉国产在线看| 亚洲熟女毛片儿| 最近最新免费中文字幕在线| 久久国产精品影院| 久久久久国内视频| 日本黄色视频三级网站网址| 色精品久久人妻99蜜桃| 午夜激情av网站| 人成视频在线观看免费观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精品1区2区在线观看.| 精品免费久久久久久久清纯| 又黄又爽又免费观看的视频| 精品免费久久久久久久清纯| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲精华国产精华精| 国语自产精品视频在线第100页| 国产成人精品无人区| 亚洲最大成人中文| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 在线观看一区二区三区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| avwww免费| 成人三级做爰电影| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久伊人香网站| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 精品日产1卡2卡| 精品久久久久久,| 十分钟在线观看高清视频www| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产精品久久电影中文字幕| 一进一出好大好爽视频| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久久精品欧美日韩精品| 一级毛片高清免费大全| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久精品国产综合久久久| 成在线人永久免费视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲中文字幕日韩| 1024手机看黄色片| 成人av一区二区三区在线看| 三级毛片av免费| 97碰自拍视频| 性欧美人与动物交配| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品久久蜜臀av无| 两个人免费观看高清视频| 高清在线国产一区| 在线免费观看的www视频| 91老司机精品| 国产一区二区激情短视频| 成人精品一区二区免费| 日韩视频一区二区在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| av视频在线观看入口| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美色视频一区免费| 国产爱豆传媒在线观看 | 国产伦在线观看视频一区| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产高清有码在线观看视频 | ponron亚洲| 三级毛片av免费| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 国产不卡一卡二| 久久伊人香网站| 久久中文看片网| 一级毛片女人18水好多| 嫩草影院精品99| 欧美乱色亚洲激情| 欧美黑人巨大hd| 黄色成人免费大全| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 午夜视频精品福利| 国产亚洲欧美98| 在线视频色国产色| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲精品国产区一区二| 操出白浆在线播放| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产乱人伦免费视频| 99riav亚洲国产免费| 色哟哟哟哟哟哟| 免费在线观看黄色视频的| 午夜免费成人在线视频| 亚洲avbb在线观看| 日韩欧美三级三区| 国产激情欧美一区二区| bbb黄色大片| 悠悠久久av| 午夜老司机福利片| 搡老岳熟女国产| 日本在线视频免费播放| 国产精品一区二区三区四区久久 | 亚洲精品色激情综合| 怎么达到女性高潮| 99国产综合亚洲精品| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 99久久无色码亚洲精品果冻| 妹子高潮喷水视频| 黄色片一级片一级黄色片| 91成人精品电影| 校园春色视频在线观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 真人做人爱边吃奶动态| 久久精品国产亚洲av高清一级| 一级a爱视频在线免费观看| 中国美女看黄片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 一进一出抽搐动态| 美女午夜性视频免费| 一本精品99久久精品77| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产伦一二天堂av在线观看| 中国美女看黄片| 黄色 视频免费看| 美女 人体艺术 gogo| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产成人啪精品午夜网站| 国产成年人精品一区二区| 看黄色毛片网站| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲成人久久爱视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美大码av| 成人免费观看视频高清| 欧美激情久久久久久爽电影| 一本一本综合久久| 久久人人精品亚洲av| 国产精品永久免费网站| 亚洲中文av在线| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 在线观看午夜福利视频| 97碰自拍视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 美国免费a级毛片| 色精品久久人妻99蜜桃| 精品电影一区二区在线| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久精品国产清高在天天线| 丁香六月欧美| 满18在线观看网站| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产亚洲欧美98| a级毛片a级免费在线| 欧美激情久久久久久爽电影| 欧美色视频一区免费| 村上凉子中文字幕在线| 最近最新中文字幕大全电影3 | 欧美大码av| 国产黄a三级三级三级人| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久久久九九精品影院| av天堂在线播放| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产一区二区在线av高清观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 制服诱惑二区| 丁香欧美五月| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 免费看美女性在线毛片视频| 一区二区三区激情视频| 国产亚洲欧美98| 国产一卡二卡三卡精品| 在线观看舔阴道视频| 亚洲精华国产精华精| 亚洲全国av大片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲精品美女久久av网站| 搞女人的毛片| tocl精华| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 99精品在免费线老司机午夜| cao死你这个sao货| 日韩免费av在线播放| 亚洲avbb在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 成人永久免费在线观看视频| 久久性视频一级片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 一夜夜www| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产免费男女视频| 1024手机看黄色片| 午夜福利欧美成人| 久久国产亚洲av麻豆专区| 母亲3免费完整高清在线观看| ponron亚洲| 亚洲国产中文字幕在线视频| videosex国产| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美日本视频| 一区二区三区精品91| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲在线自拍视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 999精品在线视频| 99久久综合精品五月天人人| АⅤ资源中文在线天堂| 欧美日韩精品网址| 99热6这里只有精品| 亚洲激情在线av| 亚洲av成人一区二区三| 一本久久中文字幕| 亚洲国产精品sss在线观看| 国内精品久久久久精免费| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 色哟哟哟哟哟哟| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产一区二区激情短视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 免费在线观看成人毛片| 香蕉av资源在线| 无限看片的www在线观看| 后天国语完整版免费观看| 国产在线观看jvid| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产精品 国内视频| 午夜福利在线在线| 亚洲人成网站高清观看| 满18在线观看网站| 欧美+亚洲+日韩+国产| 中文字幕最新亚洲高清| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美一区二区精品小视频在线| svipshipincom国产片| 90打野战视频偷拍视频| 一区二区三区激情视频| 老司机福利观看| 亚洲无线在线观看| 一区二区三区激情视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 久久国产精品影院| 久久久国产成人精品二区| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产精品免费视频内射| 在线av久久热| 亚洲av成人av| 一二三四在线观看免费中文在| 夜夜夜夜夜久久久久| 久久精品影院6| 婷婷精品国产亚洲av| 老司机午夜十八禁免费视频| 在线永久观看黄色视频| 脱女人内裤的视频| 91av网站免费观看| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲自拍偷在线| 国内精品久久久久久久电影| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产av一区二区精品久久| 久久热在线av| 久久精品影院6| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 丝袜美腿诱惑在线| 成人国产综合亚洲| 女警被强在线播放| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 亚洲精品av麻豆狂野| 久久久久国内视频| 欧美在线黄色| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲成av人片免费观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 欧美乱色亚洲激情| 人人妻人人澡人人看|