模擬內(nèi)分泌和外分泌ANP對(duì)胃EC細(xì)胞5-HT合成與分泌的影響

徐貝貝，李春輝，張德利

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，河北承德 067000）

模擬內(nèi)分泌和外分泌ANP對(duì)胃EC細(xì)胞5-HT合成與分泌的影響

徐貝貝，李春輝△，張德利

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，河北承德 067000）

目的:觀察模擬內(nèi)分泌和外分泌心房鈉尿肽(ANP)對(duì)胃腸嗜鉻(EC）細(xì)胞合成與分泌5-羥色胺(5-HT）的影響。方法:通過胃腔直接注射ANP模擬外分泌，通過舌下靜脈注射ANP模擬內(nèi)分泌，采用免疫組織化學(xué)染色、透射電鏡超微結(jié)構(gòu)的測(cè)量學(xué)方法和高效液相色譜電化學(xué)檢測(cè)方法觀察ANP刺激后胃內(nèi)5-羥色胺免疫反應(yīng)細(xì)胞密度、內(nèi)分泌顆粒(SG）數(shù)密度及血清5-HT的含量。結(jié)果:模擬ANP外分泌，實(shí)驗(yàn)組5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞密度、SG數(shù)密度明顯高于對(duì)照組(P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組血清5-HT含量明顯低于對(duì)照組(P＜0.05）;模擬ANP內(nèi)分泌，實(shí)驗(yàn)組5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞密度、SG數(shù)密度明顯高于對(duì)照組(P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組血清5-HT含量明顯低于對(duì)照組(P＜0.05）。結(jié)論:模擬大鼠內(nèi)、外分泌ANP可抑制5-HT的分泌，促進(jìn)5-HT的合成。

心房鈉尿肽(ANP);腸嗜鉻細(xì)胞;5-羥色胺(5-HT);胃

自1981年de Bold等首次從心房中提取心房鈉尿肽(ANP）以來(lái)，人們又相繼發(fā)現(xiàn)了BNP、CNP、DNP、MNP和VNP[1-2]。它們不僅存在于心臟而且分布于全身許多部位[3-4]。本課題組的前期研究證實(shí)，大鼠胃中的ANP合成細(xì)胞是胃的腸嗜鉻細(xì)胞即EC細(xì)胞，EC細(xì)胞的分布密度與微血管的分布密度密切相關(guān);胃中的5-羥色胺(5-HT）也是由胃EC細(xì)胞合成并由EC細(xì)胞的分泌顆粒貯存和分泌[5]。ANP對(duì)胃EC細(xì)胞分泌5-HT有何影響，國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。為此，本研究通過胃腔直接注射ANP模擬外分泌產(chǎn)生的ANP，通過舌下靜脈注射ANP模擬內(nèi)分泌產(chǎn)生的ANP，采用免疫組織化學(xué)染色、透射電鏡超微結(jié)構(gòu)的測(cè)量學(xué)方法和高效液相色譜電化學(xué)檢測(cè)方法，觀察了ANP刺激后胃合成和分泌5-HT的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體重300-350g，3月齡雄性成年Wistar大鼠，由承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，術(shù)前24h禁食、自由飲水。

1.2 藥物與試劑 兔抗大鼠5-HT抗體，美國(guó)Santa Cruz公司;ANP標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司;5-HT標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司。

1.3 模型制作方法

1.3.1 制作模擬外分泌動(dòng)物模型:成年Wistar大鼠20只，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50mg/kg）麻醉，打開腹腔，分別結(jié)扎幽門、賁門。實(shí)驗(yàn)組(10只），胃內(nèi)直接注射ANP 28μg(14mg/L）;對(duì)照組(10只），胃內(nèi)注射2ml生理鹽水。手術(shù)后60min左心室取血，離心取血清;取胃，置中性甲醛和戊二醛的混合固定液固定，用于光鏡和電鏡觀察，血清用于高效液相色譜檢測(cè)。

1.3.1 制作模擬內(nèi)分泌動(dòng)物模型:另取成年Wistar大鼠20只，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50mg/kg）麻醉。實(shí)驗(yàn)組(10只），舌下靜脈注射ANP 14μg;對(duì)照組(10只），舌下靜脈注射1ml生理鹽水。注射后60min，左心室取血，離心取血清;取胃，置中性甲醛和戊二醛的混合固定液固定，用于光鏡和電鏡觀察，血清用于高效液相色譜檢測(cè)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 固定胃組織常規(guī)石蠟包埋，切片(5μm)。SP免疫組化法觀察胃EC細(xì)胞5-HT陽(yáng)性信號(hào)的表達(dá)，一抗稀釋濃度1:200，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以胞漿出現(xiàn)棕色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)。定量分析:每只大鼠隨機(jī)挑選5張切片，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400）進(jìn)行記數(shù)，以每個(gè)高倍視野5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的密度作為5-HT的相對(duì)表達(dá)水平，取平均值。

1.5 透射電鏡觀察和形態(tài)計(jì)量 固定胃組織Epon812包埋劑包埋，醋酸雙氧鈾染色和檸檬酸鉛染色，JEM-1200EX透射電鏡觀察。觀察胃EC細(xì)胞的分泌顆粒(SG），采用Chun-hui等[5]的方法計(jì)量SG的數(shù)密度。

1.6 高效液相色譜-電化學(xué)法(HPLC-ECD）檢測(cè)血清5-HT的含量 血清樣品1:10稀釋，過濾后加入Zorboxsb-C18色譜柱(4.6mm×15mm，3.5μm），上樣量5μl。洗脫液(流動(dòng)相）A:20mml/L的枸櫞酸三鈉(pH=4.50）、B:甲醇，A:B=85:15，柱溫25℃，流速1ml/min。

1.7 統(tǒng)計(jì)處理 SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 模擬ANP外分泌對(duì)大鼠胃5-HT分泌的影響

實(shí)驗(yàn)組5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞密度、SG數(shù)密度明顯高于對(duì)照組(P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組血清5-HT含量明顯低于對(duì)照組(P＜0.05）。見附表。

附表 模擬ANP內(nèi)、外分泌對(duì)胃EC細(xì)胞5-HT分泌的影響(±s）

附表 模擬ANP內(nèi)、外分泌對(duì)胃EC細(xì)胞5-HT分泌的影響(±s）

*與對(duì)照組比較:P＜0.05

組別 n 胃5-HT陽(yáng)性 SG數(shù)密度 血清5-HT含量細(xì)胞密度 (μg/ml）模擬外分泌 對(duì)照組 10 32.23±1.79 13.97±1.71 548.01±58.79實(shí)驗(yàn)組 10 46.17±1.77*19.98±3.19*446.12±37.7*模擬內(nèi)分泌 對(duì)照組 10 29.20±1.87 12.98±1.92 597.56±44.7實(shí)驗(yàn)組 10 56.15±2.23*22.27±3.40*324.34±24.3*

2.2 模擬ANP內(nèi)分泌對(duì)大鼠胃內(nèi)5-HT分泌的影響

實(shí)驗(yàn)組5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞密度、SG數(shù)密度明顯高于對(duì)照組(P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組血清5-HT含量明顯低于對(duì)照組(P＜0.05）。見附表。

3 討論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)ANP的研究主要集中在心肌細(xì)胞，ANP陽(yáng)性細(xì)胞主要集中在右心房，較少分布在左心房，左心室?guī)缀醪淮嬖赱6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，在胃組織中也有合成ANP的細(xì)胞，ANP合成細(xì)胞是胃中的腸嗜鉻細(xì)胞，即EC細(xì)胞[8-9]。ANP合成后儲(chǔ)存在高爾基復(fù)合體周圍的內(nèi)分泌顆粒中，并且ANP與5-HT共同在胃的EC細(xì)胞中合成并且存在于EC細(xì)胞的同一分泌顆粒中[5]。這種存在方式可能具有某些特殊的生理功能，但關(guān)于ANP對(duì)EC細(xì)胞5-HT合成與分泌影響的研究目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究通過在大鼠胃腔內(nèi)直接注射ANP，模擬研究外分泌產(chǎn)生的ANP對(duì)5-TH分泌的影響，以及通過在大鼠舌下靜脈注射ANP，模擬研究?jī)?nèi)分泌產(chǎn)生的ANP對(duì)5-TH分泌的影響，觀察ANP對(duì)5-HT合成及分泌的影響，探討EC細(xì)胞中的ANP和5-TH的相互關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，胃腔內(nèi)及舌下靜脈注射ANP后，胃組織5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞密度及分泌顆粒的數(shù)密度明顯增加，因此推測(cè)ANP可能對(duì)5-HT的合成起促進(jìn)作用，使5-HT在EC細(xì)胞內(nèi)的分泌顆粒內(nèi)積累，從而導(dǎo)致5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及分泌顆粒的數(shù)密度增多。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是模擬內(nèi)分泌、還是外分泌，血清中的5-HT含量卻明顯減少，因此推測(cè)ANP可能對(duì)5-HT的釋放具有抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)模擬內(nèi)、外分泌ANP均可影響胃內(nèi)5-HT的合成和分泌，而胃內(nèi)5-HT分泌異常可導(dǎo)致胃腸道疾病特別是胃動(dòng)力性疾病。因此本研究可為進(jìn)一步研究胃內(nèi)5-HT分泌異常導(dǎo)致的胃腸道疾病提供新思路，同時(shí)也可為消化生理與病理的研究提供理論依據(jù)。

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EFFECTS OF SIMULATING ENDOCRINE AND EXCRINE ANP ON SYNTHESIS AND SECRETION OF 5-HT OF EC CELLS IN STOMACH

XU Bei-bei, LI Chun-hui, ZHANG De-li
(Department of Pathology, the Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate effects of simulating endocrine and exocrine atrial natriuretic peptide (ANP) on synthesis and secretion of 5-HT of enterochromaffin cells (EC) in stomach. Methods:ANP was directly injected into the stomach to simulate exocrine secretion and ANP was injected into the sublingual vein to simulate endocrine secretion. Immunochemical staining, transmission electron microscope and high-performance liquid chromatography-electrochemical detection were used to observe 5-HT expression, dissector of secretory granules (SG) and 5-HT content in serum.Results:Simulating exocrine: compared with control group, the 5-HT expression, the disector of SG were obviously increased in EC cells of rats in experimental group (P＜0.05), but the 5-HT content obviously decreased (P＜0.05). Simulating endocrine: compared with control group, the 5-HT expression, the disector of SG were obviously increased in EC cells of rats in experimental group (P＜0.05), but the 5-HT content obviously decreased (P＜0.05).Conclusions:Simulating exocrine and endocrine of ANP all can inhibit secretion of 5-HT and promote synthesis of 5-HT.

ANP; Enterochromaff n cell; 5-HT; Stomach

R335

A

1004-6879(2010）04-0358-03

2010-05-27）

△ 通訊作者