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      熱療對人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響

      2010-09-21 07:26:36李素杰王海松馬勝輝龔明玉承德醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系007級河北承德067000承德市中心醫(yī)院腫瘤外科指導(dǎo)教師
      關(guān)鍵詞:熱療肝癌誘導(dǎo)

      李素杰,周 瑾,王海松,馬勝輝,龔明玉(.承德醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系007級,河北承德 067000;.承德市中心醫(yī)院腫瘤外科;.指導(dǎo)教師)

      原發(fā)性肝癌是我國常見惡性腫瘤之一,在各種惡性腫瘤的死亡順序中居第二位,每年死亡20多萬人,約占世界肝癌死亡人數(shù)的一半以上[1]。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的過程,是細(xì)胞的過度增殖和細(xì)胞凋亡受到抑制的過程[2]。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已成為治療腫瘤的一個(gè)新熱點(diǎn)。應(yīng)用加熱治療腫瘤早已被臨床所接受,但加熱對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響未見報(bào)道。為此,我們以肝癌HepG2細(xì)胞為模型,觀察不同加熱時(shí)間對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響。

      1 材料與方法

      1.1 細(xì)胞與培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2:購自南京凱基生物科技有限公司,為單層貼壁生長。培養(yǎng)液為RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO公司產(chǎn)品),內(nèi)含10%新生牛血清,100u/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素。將HepG2細(xì)胞置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至指數(shù)生長期進(jìn)行實(shí)驗(yàn),隔2-3d傳代一次,細(xì)胞消化液為0.25%的胰酶。

      1.2 細(xì)胞處理及分組 取生長狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞若干瓶,采用隨機(jī)對照原則分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。(1)對照組:即加熱0h組(正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞);(2)實(shí)驗(yàn)組:根據(jù)加熱時(shí)間不同分為3組:即加熱0.5h組、加熱1h組、加熱1.5h組。將恒溫水浴箱調(diào)至所需溫度43℃對細(xì)胞進(jìn)行加熱,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞熱療后,棄上清,加入5ml新鮮培養(yǎng)基,置37℃繼續(xù)培養(yǎng)24h。

      1.3 膜聯(lián)蛋白(Annexin-V-EGFP)流式細(xì)胞儀檢測 用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化收集上述對照組及不同加熱時(shí)間處理組細(xì)胞(約5×105),PBS洗2遍,1500rpm、4℃、5min收集細(xì)胞,棄上清,加入500μl的Bingding Buffer懸浮細(xì)胞,加入5μl Annexin-V-EGFP及5μlPI混勻后,室溫避光反應(yīng)15min,采用流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞膜PS外翻的情況, 用Muticycle軟件分析計(jì)算凋亡心肌細(xì)胞的百分比。結(jié)果判定:Annexin V-/PI-為正常細(xì)胞,AnnexinⅤ+/PI-為凋亡細(xì)胞,Annexin V+/PI+為壞死細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均數(shù)。

      2 結(jié)果

      膜聯(lián)蛋白(Annexin-Ⅴ-EGFP)流式細(xì)胞儀檢測各組HepG2細(xì)胞的凋亡情況:Annexin-Ⅴ是一種細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸(PS)親和蛋白,經(jīng)EGFP熒光標(biāo)記后的熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞膜的PS密度,進(jìn)而反映細(xì)胞凋亡率。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測對照組HepG2細(xì)胞凋亡率僅為13.23,加溫處理組細(xì)胞凋亡率為20.07、25.52、32.83,實(shí)驗(yàn)組與對照組相比,細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01),隨著加熱時(shí)間的延長,細(xì)胞凋亡率增加。提示加熱可誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡,且凋亡情況與加熱時(shí)間有關(guān)見附表。

      附表 不同加熱時(shí)間對HepG2細(xì)胞凋亡的影響(±S)

      附表 不同加熱時(shí)間對HepG2細(xì)胞凋亡的影響(±S)

      與對照組比較:▲P<0.01

      組別 n 細(xì)胞凋亡率(%)對照組 8 13.23±1.89加熱0.5h組 8 20.07±4.50▲加熱1.0h組 8 25.52±2.70▲加熱1.5h組 8 32.83±4.93▲

      3 討論

      腫瘤熱療已成為繼手術(shù)、放療、化療之后的一種全新的治療腫瘤的“綠色療法”。腫瘤熱療即利用有關(guān)物理能量在組織中沉淀而產(chǎn)生熱效應(yīng),使腫瘤組織溫度上升到有效治療溫度,并維持一段時(shí)間以殺死癌細(xì)胞,又不損傷正常細(xì)胞的一種治療方法。熱對細(xì)胞的殺傷作用是由于熱可以引起蛋白質(zhì)的變性和細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的損害,熱療可以長時(shí)間抑制DNA的合成[3]。體外研究表明,熱療通常存在一個(gè)臨界溫度,在臨界溫度以下熱誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為熱作用的主要機(jī)制,而臨界溫度以上則主要引起細(xì)胞壞死[4]。熱療能增加腫瘤細(xì)胞的血流速度和細(xì)胞代謝,這樣能使更多的化療藥物、放射劑量、基因的靶向治療作用于腫瘤細(xì)胞能更加有效的控制腫瘤[5]。本實(shí)驗(yàn)采用43℃水浴不同的加熱時(shí)間處理細(xì)胞,用Annexin-Ⅴ-EGFP流式細(xì)胞儀檢測各組HepG2細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照組HepG細(xì)胞凋亡率僅為13.23,加溫處理組細(xì)胞凋亡率為20.0、25.52、32.83。實(shí)驗(yàn)組與對照組相比:細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01),隨著加熱時(shí)間的延長,細(xì)胞凋亡率增加。提示加熱可誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡,且凋亡情況與加熱時(shí)間有關(guān)。流式細(xì)胞儀是目前定量檢測細(xì)胞凋亡的常用方法,常用于檢測因DNA損傷而引起的細(xì)胞凋亡[6]。本實(shí)驗(yàn)為臨床應(yīng)用熱療治療腫瘤提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù),但熱療具體通過何種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有待進(jìn)一步研究。

      [1]劉連新,周津,王秀琴,等.凋亡相關(guān)基因在肝癌及正常肝組織表達(dá)的概況[J].中華腫瘤雜志,2001,23(4):273.

      [2]Cummings MC,Winterford CM,Walker NL.Apoptosis[J]Am J Surg Pathol,1997,21(1):88-101.

      [3]Hildebrandt B,Wust P,Ahlers O,et al.The cellular an molecular basis of hyperthermia [J].Crit Rev Oncol Hematol 2002,43(1):33-56.

      [4]Oneill KL,Fairbairn DW,Smith MJ,et al.Critical parameter influencing hyperthermia-induced apoptosis in huma lymphoid cell lines[J].Apotosis,1998,3(5):369-375.

      [5]Song CW,Park HJ,Lee CK,et al.Implication of increase tumor blood flow and oxygenation caused by mil temperature hyperthermia in tumor treatment[J]. Int J Hyper hermia,2005,21(8):761-767.

      [6]Wagner ED,Anderson D,Dhawan A,et al.Evaluatio of EMS-induced DNA damage in the single cell ge electrophoresis(Comet) assay and with flow cytometri analysis of micronuclei[J].Teratog Carcinog Mutagen 2003,Suppl 2:1-11.

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