局灶性腦缺血模型大鼠轉(zhuǎn)錄因子 Olig1的表達變化及其在髓鞘修復中的作用

王蘇平, 趙 紅, 王得新, 張擁波, 高曉玉

腦白質(zhì)損傷越來越受到人們的關注。軸突、少突膠質(zhì)細胞及由少突膠質(zhì)細胞形成的髓鞘是中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)的重要成份。與神經(jīng)元類似,少突膠質(zhì)細胞對于損傷也極為敏感,可導致髓鞘的脫失和變性[1]。臨床上許多疾病,如多發(fā)性硬化和腦白質(zhì)營養(yǎng)不良等都與脫髓鞘損傷相關。

少突膠質(zhì)前體細胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)廣泛存在于腦白質(zhì)和灰質(zhì),這類細胞在脫髓鞘損傷后能分化為成熟的少突膠質(zhì)細胞并參與新髓鞘的形成[2],研究者希望通過刺激更多的這類細胞的增殖來完成髓鞘修復,了解控制少突膠質(zhì)細胞階段性分化的分子機制至關重要。堿性-螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子 Olig1于 2000年首先被克隆,并證實其在少突膠質(zhì)細胞的成熟和髓鞘再生中發(fā)揮重要的作用[3～5]。本實驗系統(tǒng)地觀察了大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)2h后再灌注大鼠 Olig1在腦內(nèi)的分布及不同時間點的表達變化,結(jié)合髓鞘的損傷進一步探討 Olig1在腦缺血后髓鞘修復中的作用。

1 材料和方法

1.1 動物的分組和MCAO模型制備 雄性 SD大鼠由首都醫(yī)科大學實驗動物中心提供,體重 280～320g。隨機分成 6組,分別是正常對照組和缺血2h再灌注 1d、3d、7d、14d和 28d組。每組 12只 ,其中 4只用于免疫組織化學分析;8只用于 Western blot蛋白檢測。采用 Nagasawa[6]方法,改良線栓法制成 MCAO模型。大鼠用 10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300mg/kg),仰臥位固定,經(jīng)頸部正中切開皮膚暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈顱外段,結(jié)扎頸外動脈主干,分離頸內(nèi)動脈的翼腭動脈分支,在頸外動脈近頸總動脈分叉處剪一切口,將線栓向頸內(nèi)動脈顱內(nèi)方向插入 17～20mm,遇阻力時停止,栓子頭端即達大腦中動脈起始部并進入大腦前動脈,將大腦中動脈起始部和頸內(nèi)動脈末端同時堵塞,阻斷大腦中動脈的血流導致腦缺血,結(jié)扎入口處固定線栓。術(shù)后大鼠不能直行、向缺血對側(cè)劃圈爬行或傾倒、提尾懸空時患側(cè)前肢屈曲內(nèi)收,提示腦缺血制作成功;2h后直接拔出線栓恢復血流,實現(xiàn)再灌注。

1.2 免疫組織化學實驗 再灌注后 1d、3d、7d、14d和 28d,動物經(jīng) 10%水合氯醛 (300mg/kg/ip)麻醉后,打開胸腔,行左心室灌流。取出腦組織,放于恒冷切片機中做連續(xù)切片,切片厚度 20μm。腦片經(jīng)水化、滅活內(nèi)源性過氧化氫酶、封閉,加入Olig1單克隆抗體(Chem icon公司,MAB5540)1∶400過夜后,依次加入生物素標記的二抗(SP9002,北京中杉)、辣根過氧化酶標記鏈酶卵白素(SP9002,北京中杉),之后 3,3'聯(lián)苯二胺(DAB)顯色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,封片后顯微鏡下照相。

1.3 蛋白質(zhì)電泳檢測 各組大鼠于再灌注后按上述時間點斷頭,取出雙側(cè)紋狀體組織,每組組織中加入 0.5m l組織裂解液(50mmol/L-1Tris-HCl,40mmol/L-1NaF,2mmol/L-1EDTA,1mmol/L-1DTT),勻漿器研磨,取上清,按勻漿液∶氯仿∶乙醇 1∶1∶1的比例加入氯仿和乙醇,12,000g離心,棄去上下層液體,中間層膜狀固體置于 4℃冷風吹干。加入 2%SDS 120μl,煮沸 10min,溶解蛋白。按照 BCA法進行蛋白濃度測定。每一樣品按總蛋白 90μg,根據(jù)濃度計算出體積,加入上樣緩沖液,100℃煮沸5min。行 10%SDS-PAGE凝膠電泳,恒壓轉(zhuǎn)膜100V 60min,5%脫脂奶粉封閉 1h,Olig1單克隆抗體(Chemicon公司,MAB5540)1∶4000或 MBP多克隆抗體(Chemicon公司)1∶1000 4℃過夜。TBST洗膜,羊抗小鼠 IgG或羊抗兔 IgG二抗室溫孵育 1h,ECL發(fā)光液顯示后,暗室曝光于 X膠片上。

1.4 圖像分析 免疫組化圖像采集應用 Spot Advanced軟件,選取缺血側(cè)紋狀體寬 1400μm和長1200μm的區(qū)域,采用 Metamorph軟件計數(shù)再灌注后不同時間點缺血側(cè)紋狀體區(qū)域 Olig1的陽性細胞數(shù)。每只大鼠選取 6張切片,計算出每張切片 Olig1的陽性細胞總數(shù),將 6張切片累加求其平均。每個時間點 4只動物。Western blot圖像資料采用 Scanwizard 5.0掃描系統(tǒng),條帶光密度分析使用 TotalLab 1.0軟件。β-actin為內(nèi)參照,以 Olig1或 MBP光密度掃描值與相應的 β-actin光密度掃描值的比值表示腦缺血再灌注后不同時間點Olig1或 MBP蛋白的變化,再以各不同時間點 Olig1或 MBP蛋白質(zhì)的變化與正常對照組相比[7]。

1.5 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用 Prism 4.0軟件,多組數(shù)據(jù)間差異用單因素方差分析(one way ANOVA)并繼之以 Dunnett's post-hoc檢驗。結(jié)果用平均值 ±標準差(±s)表示,P＜0.05作為檢驗水準。

2 結(jié) 果

2.1 正常和腦缺血大鼠 Olig1的表達變化圖1顯示正常和腦缺血模型大鼠 Olig1的免疫組化染色。Olig1免疫陽性細胞廣泛分布于腦白質(zhì)和灰質(zhì),如皮層、胼胝體和紋狀體等區(qū)域。正常腦組織中,Olig1陽性細胞主要位于少突膠質(zhì)細胞的細胞漿。腦缺血后,損傷區(qū)域周邊胞核表達的 Olig1明顯增多(見圖1)。這提示腦缺血損傷后,Olig1由胞漿移至胞核。我們對 MCAO大鼠腦缺血后不同時間點 Olig1的陽性表達進行細胞分析計數(shù)(見表1),結(jié)果顯示腦缺血再灌注后的 1d至 3d Olig1陽性細胞數(shù)下降,7d回到正常水平,并維持此水平至缺血后的 28d。

表1 MCAO大鼠腦缺血再灌注不同時間點缺血側(cè)紋狀體區(qū)域 Olig1陽性細胞數(shù)(±s)

表1 MCAO大鼠腦缺血再灌注不同時間點缺血側(cè)紋狀體區(qū)域 Olig1陽性細胞數(shù)(±s)

與正常對照組相比*P＜0.05,**P＜0.01

再灌注時間 Olig1陽性細胞數(shù)/平方毫米對照組MCAO 1d MCAO 3d MCAO 7d MCAO 14d MCAO 28d 402.5±17.79 271.5±24.99**315±19.14*339.5±20.53 344±21.07 338.5±14.93

2.2 腦缺血后 Olig1和 MBP的蛋白表達變化Western Blot方法檢測缺血側(cè)紋狀體區(qū)域 Olig1的蛋白表達。結(jié)果顯示,腦缺血后的 1d,Olig1蛋白表達明顯降低;3d回到接近正常水平,并維持此水平直至缺血后的 28d(見圖2)。然而,對側(cè)紋狀體中Olig1的蛋白表達未發(fā)生改變。這提示 Olig1蛋白表達水平的改變和損傷相關。堿性髓鞘蛋白(myelin basic protein,MBP)作為髓鞘的組成成分,用作髓鞘的標志物[8]。為了檢測大鼠腦缺血后白質(zhì)的損傷程度,我們觀察了腦缺血后 1d、3d、7d、14d和 28d缺血側(cè)紋狀體區(qū)域 MBP的表達變化。結(jié)果顯示,MBP的蛋白表達在腦缺血后 1～28d持續(xù)下降(見圖3)。這一結(jié)果提示腦缺血后髓鞘損傷發(fā)生較早,并持續(xù)進展。

圖1 正常和 MCAO大鼠 Olig1免疫組化染色,缺血側(cè)紋狀體區(qū)域。 Scale bar=10μm

圖2 MCAO大鼠缺血側(cè)紋狀體區(qū)域 Olig1的蛋白表達情況,actin為上樣量的內(nèi)參照,與正常對照組相比**P＜0.01

圖3 Western Blot檢測 MCAO大鼠缺血側(cè)紋狀體 MBP的蛋白表達情況,actin為上樣量的內(nèi)參照,與正常對照組相比*P＜0.05,**P＜0.01

3 討 論

少突膠質(zhì)細胞形成的髓鞘是白質(zhì)的重要成分,其髓鞘形成的過程由轉(zhuǎn)錄因子 Olig1調(diào)控[9,10]。MBP是髓鞘的組成成分之一,用于檢測髓鞘損傷的程度。本實驗對 MCAO模型中 Olig1和 MBP的表達變化進行了系統(tǒng)研究,并就兩者之間的關系進行探討。

正常大鼠 Olig1陽性表達的細胞廣泛分布于腦白質(zhì)和灰質(zhì)(大腦皮層、胼胝體和紋狀體),典型地沿著髓鞘區(qū)域呈束狀排列。Olig1陽性染色主要位于少突膠質(zhì)細胞的胞漿。這與文獻中的報道相吻合[3,4]。另外,我們發(fā)現(xiàn)紋狀體區(qū)域有少數(shù)的 Olig1位于細胞核中。根據(jù) Olig1在不同發(fā)育時期的亞細胞定位,Olig1位于 OPCs的細胞核中,出生后 2w移至少突膠質(zhì)細胞的細胞漿,并持續(xù)存在于胞漿中。脫髓鞘損傷發(fā)生時,上述定位再次出現(xiàn),Olig1被轉(zhuǎn)移至細胞核中[5]。我們推測少數(shù) Olig1的胞核定位的細胞是少突膠質(zhì)的前體細胞,這符合 OPCs正常情況下即在腦組織中存在,且占膠質(zhì)群體的 5%～8%[11]。腦缺血后,缺血側(cè)紋狀體區(qū)域胞核定位的Olig1明顯增加,未缺血側(cè)未發(fā)現(xiàn)此種改變?？梢奙CAO模型中 Olig1的細胞內(nèi)定位發(fā)生了改變,由胞漿移至胞核,且發(fā)生改變的 Olig1僅位于缺血側(cè)。Olig1的胞核定位具有高度的部位損傷特異性,即損傷相關區(qū)域的 Olig1發(fā)生了核轉(zhuǎn)位[5]。胞核定位的Olig1對于轉(zhuǎn)錄因子活性的啟動至關重要,推測Olig1由胞核到胞漿的動態(tài)再分布有助于 OPCs成熟為成髓鞘的少突膠質(zhì)細胞。

本次實驗對 MCAO模型再灌注后各時間點缺血側(cè)紋狀體中 Olig1免疫陽性細胞進行了觀察。形態(tài)學結(jié)果顯示,再灌注后 1d和 3d,Olig1的表達明顯減少,7d恢復到接近正常水平,并維持此水平直到缺血后的 28d。Western blot方法檢測 Olig1的蛋白表達變化與免疫組化結(jié)果呈現(xiàn)一致的趨勢。

Olig1的表達在缺血再灌注后的 1d顯著降低,其具體機制是復雜而多樣的。Olig1主要在少突膠質(zhì)及其前體細胞中表達,少突膠質(zhì)細胞具有缺血易損性,缺血早期即發(fā)生死亡,推測少突膠質(zhì)及其前體細胞的死亡是 Olig1下降的主要原因,當然也不能排除 Olig1轉(zhuǎn)錄水平的下降對其的影響[12]。Olig1的表達在缺血后的 3d至 28d恢復到接近正常水平,可能是由于 OPCs遷移到損傷的部位,發(fā)生增殖、激活,彌補了少突膠質(zhì)細胞的死亡[2]。

MBP用作髓鞘的標志物[8],Western blot結(jié)果顯示,MBP在腦缺血后的 1d至 28d逐漸下降,28d達到最低點。這反應了髓鞘的脫失和破壞發(fā)生在缺血的早期,并隨著缺血時間的延長逐漸加重。有實驗表明缺血后髓鞘脫失、排列方向紊亂、神經(jīng)纖維間空洞形成以及染色強度下降,同時軸突也發(fā)生類似的改變,這種改變進行性加重直到損傷后的 21d[13]。髓鞘染色的變化和此次實驗檢測的 MBP蛋白表達結(jié)果相吻合。缺血時軸突也同時受累,神經(jīng)元軸突和少突膠質(zhì)細胞損傷之間存在因果關系。少突膠質(zhì)細胞缺血性損傷導致脫髓鞘病變,并使髓鞘包繞的軸突出現(xiàn)嚴重功能障礙。Olig1參與脫髓鞘損傷后的修復是在 2004年由 Arnett等人[5]首次發(fā)現(xiàn),可否通過 Olig1來治療脫髓鞘損傷性疾病一直處于探索之中。Olig1是髓鞘特異性蛋白的主要調(diào)節(jié)者,實驗中我們發(fā)現(xiàn) Olig1的表達和MBP的表達并不完全平行：Olig1在腦缺血后的 3d～28d恢復到正常水平,而 MBP的表達在腦缺血后持續(xù)下降,推測病理狀態(tài)下正常量的 Olig1對于髓鞘修復是不足夠的,進一步的研究顯示上調(diào) Olig1的表達可以促進髓鞘修復[14,15],其次 OPCs蓄積不足和受損髓鞘的殘骸未能被及時清除也對髓鞘的再生有抑制性的影響[16]。

髓鞘的修復是由脫髓鞘軸突釋放的信號啟動的,其再生的過程依賴于 OPCs的蓄積、分化以及與脫髓鞘軸突間的相互作用。雖然體內(nèi)存在內(nèi)源性的髓鞘再生機制,但多數(shù)情況下髓鞘修復不能進行,推測與多種因素有關,如控制少突膠質(zhì)細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子間的平衡被打破(失調(diào)節(jié)假說)、環(huán)境因素和細胞表面抑制性分子的表達等。Olig1對于 OPCs的分化和髓鞘形成是至關重要的,了解損傷后 Olig1的變化規(guī)律并進行干預治療,將為脫髓鞘損傷性疾病的治療提供理論依據(jù)?？煞裢ㄟ^ OPCs的移植、上調(diào) Olig1基因和增加 Olig1的核移位來促進髓鞘的修復還不是很清楚,仍需進一步探索。

[1]Dewar D,Underhill SM,Goldberg MP.Oligodendrocytes and ischemic brain injury[J].JCereb Blood Flow Metab,2003,23：263-274.

[2]Tanaka K,Nogawa S,Suzuki S,etal.Upregulation of oligodendrocyte progenitor cellsassociated with restoration ofmature oligodendrocytes and myelination in peri-infarct area in the rat brain[J].Brain Res,2003,989：172-179.

[3]Zhou Q,Wang S,Anderson DJ.Identification of a novel family of oligodendrocyte lineage-specific basic helix-loop-helix transcription factors[J].Neuron,2000,25：331-343.

[4]Ross SE,Greenberg ME,Stiles CD.Basic helix-loop-helix factors in cortical development[J].Neuron,2003,39：13-25.

[5]Arnett HA,Fancy SP,Alberta JA,etal.bHLH transcription factor Olig1 is required to repair demyelinated lesions in the CNS[J].Science,2004,306：2111-2115.

[6]Nasagawa H,Kogure K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new ratmodel ofmiddle cerebralartery occlusion[J].Stroke,1989,20：1037-1043.

[7]Tu H,Deng L,Sun Q,etal.Hyperpolarization-activated,cyc lic nuc leotide-gated cation channels：roles in the differentialelectrophysiological propertiesof rat primaryafferent neurons[J].JNeurosic Res,2004,76：713-722.

[8]Stangel M,Hartung HP.Remyelinating strategies for the treatment of multiple sc lerosis[J].Prog Neurobiol,2002,68：361-376.

[9]趙 紅,高曉玉,張擁波,等.Olig家族調(diào)控腦白質(zhì)損傷后神經(jīng)修復的研究進展[J].中華神經(jīng)醫(yī)學雜志,2009,8：201-203.

[10]Ligon KL,Fancy SP,Franklin RJ,etal.Olig gene function in CNS development and disease[J].Glia,2006,54：1-10.

[11]Peters A.A fourth type ofneuroglial cell in the adult central nervous system[J].JNeurocytol,2004,33：345-357.

[12]Gong X,Lin T,Sun Z,etal.Olig1 is downregulated in oligodendrocyte progenitor celldifferentiation[J].Neuroreport,2008,19：1203-1207.

[13]高曉玉,王得新,張擁波.腦缺血再灌注后 Olig1、Nogo-A基因表達與白質(zhì)損傷[J].中華神經(jīng)科雜志,2009,42：808-812.

[14]Zhao H,Gao XY,Wang DX,etal.Effect of adenovirus-mediated gene transfer of Olig1 on oligodendrocytedifferentiation and remyelination in a ratmodelof focal cerebral ischemia[J].NeuralRegeneration Research,2009,4：862-867.

[15]Kotter MR,LiWW,Zhao C,etal.Myelin impairs CNS remyelination by inhibiting oligodendrocyte precursor cell differentiation[J].J Neurosci,2006,26：328-332.