G-CSF對(duì)肌萎縮側(cè)索硬化細(xì)胞外谷氨酸攝取和抗自由基作用的影響

樸鐵花, 蔡鴻彥, 席中原, 盧 蕾, 宋 磊

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最主要的興奮性遞質(zhì)。任何原因引起的突觸間隙或細(xì)胞外谷氨酸的異樣積累都會(huì)造成谷氨酸受體的過(guò)度興奮從而引起神經(jīng)細(xì)胞損害-興奮性毒性作用[1]。肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是特異性累及上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的一種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,是最為常見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病[2]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)對(duì) ALS患者體內(nèi)谷氨酸含量測(cè)定顯示患者體內(nèi)有興奮性氨基酸的失衡,血中和腦脊液中谷氨酸含量較正常人明顯升高,認(rèn)為谷氨酸的興奮性毒性作用可能是ALS發(fā)病的重要機(jī)制之一[3]。隨后一系列對(duì) ALS發(fā)病與 Glu的體內(nèi)、體外研究發(fā)現(xiàn),任何原因引起的細(xì)胞外谷氨酸清除障礙均可能導(dǎo)致脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損傷及缺失[4]。

除了氨基酸的興奮性毒性,自由基的氧化作用在ALS發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵的角色[5]。Hall等應(yīng)用SOD1/G93A轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)脊髓的損害作用時(shí)發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中丙二醛的含量異常增高,提示脂質(zhì)過(guò)氧化是疾病進(jìn)程中的一個(gè)重要方面[6]。進(jìn)一步研究表明,運(yùn)用環(huán)氧化酶抑制劑 COX-2拮抗劑SC236可明顯減少脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的脫失[7]。Henderson等給 ALS患者服用谷胱甘肽過(guò)氧化物酶前體(NAC),發(fā)現(xiàn)可提高 GPX的含量,減輕運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性[8]。上述研究均顯示了ALS抗氧化治療的潛力。

發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性決定了 ALS治療非常困難,目前被認(rèn)為有效并上市的藥品只有力魯唑。但力魯唑是一種谷氨酸的拮抗劑,只能通過(guò)減輕谷氨酸興奮性毒性發(fā)揮作用[9,10]。為了彌補(bǔ)力魯唑治療 ALS的局限性,迫切需要尋找一種可以針對(duì) ALS多種發(fā)病機(jī)制的臨床新藥物。粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)是一種分子量為19.6kD的糖蛋白,主要由單核/巨噬細(xì)胞分泌,在體內(nèi)可以特異性調(diào)節(jié)粒細(xì)胞的增殖與分化,增強(qiáng)粒細(xì)胞功能[11]。目前研究表明,G-CSF還具有抗自由基和阻斷谷氨酸興奮毒性等抗凋亡作用[12,13],并可能對(duì)ALS的治療有效[14]。本實(shí)驗(yàn)以脊髓切片體外培養(yǎng)構(gòu)建 ALS模型,研究 G-CSF是否可以通過(guò)抗自由基和興奮氨基酸毒性作用發(fā)揮對(duì)脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)作用,為其進(jìn)一步應(yīng)用于治療 ALS提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 8日齡 SD乳鼠由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(吉)2003-0002。MS培養(yǎng)液(50%MEM含 25mmol Hepes+25%馬血清 +25%Hank平衡鹽液含 25.6mg/ml葡萄糖)、GBSS(Geys平衡鹽液含 6.4mg/ml葡萄糖)購(gòu)自美國(guó) Gibco公司,6孔培養(yǎng)板(Greiner bio-one公司),MilliporeMillicell-CM膜(美國(guó) Millipore公司),BX 51光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯),一抗(小鼠抗非磷酸化神經(jīng)絲單克隆抗體)、二抗(生物素化馬抗小鼠IgG)、SABC免疫組織化學(xué)試劑盒(武漢博士德公司 ),DAB(美國(guó) Sigma),Glu、SOD、MDA測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所),重組粒細(xì)胞集落刺激因子(長(zhǎng)春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司),McⅡWain組織切 片 刀 (Geneq),DL-threo-β-hydroxyaspartate、L-trans-pyrrolidine-2,4-dicarboxylate(Sigma)。

1.2 器官型脊髓(organotypic spinal cord)的建立與培養(yǎng) 按Rothstein和Corse所報(bào)道的方法：將 8日齡 SD乳鼠分別快速地在碘酒、75%酒精中各浸泡消毒后斷頭處死。迅速分離并取出整條脊髓放入GBSS中,在解剖顯微鏡下分離并剪斷腰段脊髓的神經(jīng)根,小心剝離脊膜。無(wú)菌條件下用 McⅡWain組織切片刀將腰段脊髓切成 350μm厚的薄片后,轉(zhuǎn)移至 GBSS中室溫下慢慢分離成單片。取 6孔培養(yǎng)板,每孔內(nèi)放入 1ml MS培養(yǎng)液,并放置 Millipore-Millicell-CM多孔膜。用吸管將完好的脊髓片轉(zhuǎn)移至膜上,每孔放置 5片,移去膜表面多余的培養(yǎng)液,入 CO2培養(yǎng)箱(36.5℃,5%CO2+95%空氣),每 3d換 MS培養(yǎng)液 1次。

1.3 ALS模型的建立以及分組 10d后,將培養(yǎng)的脊髓切片從培養(yǎng)箱中拿出,隨機(jī)分為 3組：對(duì)照組、ALS模型組和 G-CSF組,每組 6孔。對(duì)照組不做任何處理,仍常規(guī)培養(yǎng);ALS組模型的建立按照 Matyja等[15]方法向每孔中加入 DL-threo-β-hydroxyaspartate(THA)至終濃度為 100μmol,以后加入 L-trans-pyrrolidine-2,4-dicarboxylate(PDC)至終濃度為 500μmol;G-CSF組在 ALS模型組處理的基礎(chǔ)上再加入重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)至終濃度 10ng/ml[16]。將各組重新放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每 3d換半液 1次。每次換液后 3組重復(fù)上述處理。

1.4 培養(yǎng)液中谷氨酸含量測(cè)定 培養(yǎng) 1w、2w、3w、4w時(shí)在每次換液前取培養(yǎng)液(每組 6份),按南京建成生物工程研究所提供的谷氨酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定,具體步驟如下：(1)取 0.2m l的培養(yǎng)液加0.6ml的試劑 1,充分混勻,離心 10min(3500r/min),取上清液待測(cè)。(2)設(shè)立空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管,在空白管中加入蒸餾水 0.5ml;在標(biāo)準(zhǔn)管中加入0.2mmol/L谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 0.5ml;在測(cè)定管中加入待測(cè)上清液 0.5ml。然后在各管中加入 1ml試劑 1、0.1m l試劑 2、0.01ml試劑 4和 0.39ml蒸餾水?；靹蚝笫覝胤胖?10min,340nm處,1cm光徑,蒸餾水調(diào)零,測(cè)各管吸光度 A1值。(3)在各管中再加入 0.02ml試劑 5,混勻,37℃水浴 40min,取出后于 340nm處,1cm光徑,蒸餾水調(diào)零,測(cè)各管吸光度A2值。計(jì)算公式：谷氨酸濃度(μmol/L)=[測(cè)定管(A2值 -A1值)-空白管(A2值 -A1值)]÷[標(biāo)準(zhǔn)管(A2值 -A1值)-空白管(A2值 -A1值)]×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(20μmol/L)×4。

1.5 脊髓取材 每組取 6孔(每孔 5片)脊髓組織切片,取右側(cè)腹前角組織稱(chēng)重后,應(yīng)用冰冷的生理鹽水制備成10%組織勻漿置 -40℃待測(cè)。余脊髓組織浸泡于 4%多聚甲醛緩沖液,用于免疫組化檢測(cè)。

1.6 脊髓前角中 SOD測(cè)定 根據(jù)南京建成生物工程研究所提供的 SOD檢測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行脊髓前角中 SOD活性的測(cè)定和計(jì)算。測(cè)定步驟如下：(1)測(cè)定管中加試劑 1 lm l、10%組織勻漿 30μl、試劑 2 0.lm l、試劑 3 0.1ml、試劑 4 0.1m l;對(duì)照管中加試劑 1 1ml、試劑 2 0.1m l、試劑 3 0.1m l、試劑 4 0.1 m l。(2)用漩渦混勻器充分混勻,置 37℃恒溫水浴40min。(3)測(cè)定管、對(duì)照管中分別加顯色劑 2m l。(4)混勻,室溫放置 10min,于波長(zhǎng) 550nm處,1cm光徑比色杯,蒸餾水調(diào)零,測(cè)各管 OD值。計(jì)算公式：SOD活力(U/mgp rot)=(對(duì)照管OD值 -測(cè)定管 OD值)÷對(duì)照管 OD值 ÷50% ×3.83÷0.03÷0.67mgpor/tml÷對(duì)照管 OD值 ×0.465。

1.7 脊髓前角中 MDA測(cè)定 根據(jù)南京建成生物工程研究所提供的 MDA檢測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定脊髓前角中 MDA含量。測(cè)定步驟：(1)標(biāo)準(zhǔn)管中加10nmol/ml的標(biāo)準(zhǔn)品 0.1ml和試劑 1 0.1ml;標(biāo)準(zhǔn)空白管中加無(wú)水乙醇 0.1m l和試劑 10.1ml;測(cè)定管中加 10%腦組織勻漿 0.1ml和試劑 1 0.1ml;測(cè)定空白管中加 10%腦組織勻漿 0.1ml和試劑 1 0.1m l。(2)漩渦混勻器混勻,試管口用保鮮膜扎緊,用針頭刺一小孔,95℃水浴 80min,取出后流水冷卻,離心10min(4000r/min)后取上清,532nm下,1cm光徑,蒸餾水調(diào)零,測(cè)各管 OD值。組織中 MDA含量(nmol/mgport)=(測(cè)定管 OD值 -測(cè)定空白管 OD值)÷(標(biāo)準(zhǔn)管 OD值 -標(biāo)準(zhǔn)空白管 OD值)×10nmol/ml÷蛋白含量(mgprot/nmol)。

1.8 免疫組化染色計(jì)數(shù)前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元 取各組以 4%多聚甲醛固定的脊髓切片,按 Iwasaki等[5]使用的方法進(jìn)行脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的免疫組化染色,具體步驟如下：將脊髓切片先用 0.1mol/L PBS沖洗 3次,10%馬血清 /TBS阻斷 60min,加入單克隆抗非磷酸化抗體 SMI-32(含 0.5%TritonX-100)后,放置于在 4℃搖床過(guò)夜。次日使用 TBS洗3次(每次 10min)后,加入二抗生物素標(biāo)記的馬抗小鼠 IgG(1∶1000),25℃下 60min后 TBS洗 3次(每次 10m in),加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素(1∶200),25℃下 60m in后 TBS洗 3次(每次10min);DAB顯色 3～10min,TBS洗 3次(每次10min);脫水、透明、封片。以 TBS代替一抗為陰性對(duì)照。位于脊髓的腹側(cè)、SMI-32(+)、并且胞體直徑大于 30μm的細(xì)胞被認(rèn)定為 α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。每組取 6張切片,100倍鏡下每張切片取 5個(gè)視野,對(duì)前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)并取其平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS11.5 forWindows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。本組數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料,數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用方差分析及 q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 脊髓器官模型的形態(tài)學(xué) 培養(yǎng) 10d后的脊髓片在體外生長(zhǎng)良好,體積逐漸增大,組織邊緣有光暈。在相差顯微鏡下可見(jiàn)培養(yǎng)液清亮無(wú)混濁,脊髓切片的背角略暗,含有大量的密集的小體積細(xì)胞;脊髓腹角透光性較背角強(qiáng),細(xì)胞大、多角而稀疏。HE染色可清楚顯示脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(見(jiàn)圖1)。

2.2 培養(yǎng)液中 Glu濃度變化 結(jié)果顯示對(duì)照組培養(yǎng)液中 Glu濃度較低,并且隨時(shí)間變化(1w、2w、3w、4w)變化不大,基本維持在恒定水平;ALS模型組培養(yǎng)液中 Glu濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加,并顯著高于對(duì)照組;G-CSF組培養(yǎng)液 Glu濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加,顯著高于對(duì)照組,但在 2w后 Glu濃度顯著低于 ALS模型組(見(jiàn)圖2)。

2.3 脊髓前角中 SOD、MDA的含量 ALS模型組脊髓前角中 SOD活性顯著低于對(duì)照組(P＜0.05),G-CSF組 SOD、GSH-PX活性高于 ALS模型組(P＜0.05),但仍低于對(duì)照組(P＜0.05)。ALS模型組前角中 MDA含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.01),G-CSF組 MDA含量低于 ALS模型組(P＜0.05),但仍高于對(duì)照組(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。

2.4 脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量 免疫組化染色結(jié)果顯示,對(duì)照組脊髓切片腹側(cè)前角 α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分布稀疏,數(shù)量為 20±3.3,胞體呈多角形,深棕色,有細(xì)長(zhǎng)突起,彼此間可見(jiàn)突觸聯(lián)系;ALS模型組α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元極少,為 5±1.1,個(gè)別切片難以計(jì)數(shù);G-CSF組脊髓切片 α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量為 14±2.7,較對(duì)照組減少(P＜0.05),但明顯多于 ALS模型組(P＜0.05)(見(jiàn)圖3)。

表1 各組SOD和 GSH-PX活性數(shù)值(±s,n=6)

表1 各組SOD和 GSH-PX活性數(shù)值(±s,n=6)

與 ALS組相比*P＜0.05

組別(酶) 對(duì)照組 ALS模型組 G-CSF組SOD活性(U/mgprot)MDA含量(nmol/mgprot)159.04±2.34 1.16±0.09 108.91±2.84 3.66±0.92 138.76±3.16*1.93±0.13*

圖1 HE染色可清楚顯示脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,稀疏,呈深染(×40)

圖2 示不同時(shí)間點(diǎn)各組培養(yǎng)液中 Glu濃度的變化

圖3 A、B、C分別為對(duì)照組、ALS模型組和 G-CSF組,脊髓前角 SM-32染色(×100),可見(jiàn)G-CSF組脊髓切片 α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量較對(duì)照組減少(P＜0.05),但明顯多于 ALS模型組(P＜0.05)

3 討 論

目前 ALS的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯恐饕修D(zhuǎn)基因動(dòng)物模型、免疫介導(dǎo)的動(dòng)物模型和體外細(xì)胞或組織培養(yǎng)模型。以 Cu/Zn SOD基因突變和神經(jīng)絲過(guò)度磷酸化為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型主要針對(duì)發(fā)病率僅占 ALS 5%～10%左右的家族性 ALS,且對(duì)實(shí)驗(yàn)條件、設(shè)備、技術(shù)要求高,周期長(zhǎng),花費(fèi)大。而免疫介導(dǎo)動(dòng)物模型又不能精確地模擬 ALS的自然慢性發(fā)病過(guò)程。故本實(shí)驗(yàn)采用目前應(yīng)用最為廣泛的體外細(xì)胞(或組織、器官)培養(yǎng)模型對(duì) ALS進(jìn)行研究。在培養(yǎng)的脊髓切片中加入谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體拮抗劑 THA和 PDC,造成細(xì)胞外谷氨酸無(wú)法被攝取導(dǎo)致在培養(yǎng)液中濃度不斷增加,從而選擇性地?fù)p傷脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,較好地模擬了 ALS的發(fā)病過(guò)程,并可縮短整個(gè)實(shí)驗(yàn)的周期,易操作,干預(yù)條件易調(diào)控,有利于進(jìn)行下一步對(duì) GCSF神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行研究。

正常情況下,細(xì)胞外液中沒(méi)有使谷氨酸失活的水解酶系統(tǒng),將細(xì)胞外液谷氨酸快速攝取到細(xì)胞內(nèi)是清除 Glu毒性的唯一途徑,而這一作用是靠分布在谷氨酸能神經(jīng)元末梢和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體完成的[17]。實(shí)驗(yàn)顯示,在對(duì)照組的脊髓器官模型中,加入的 Glu可以被正常清除而不會(huì)引起細(xì)胞毒性,培養(yǎng)液中的 Glu濃度始終維持在一個(gè)恒定的水平。而在加入谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體拮抗劑THA和PDC的 ALS模型組培養(yǎng)液中,Glu濃度在 1w時(shí)測(cè)定即明顯高于對(duì)照組,隨時(shí)間變化逐漸增加。先前的研究發(fā)現(xiàn) G-CSF在體外實(shí)驗(yàn)中可以增加細(xì)胞外谷氨酸的攝取,在活體實(shí)驗(yàn)中可以明顯減輕缺血后谷氨酸的釋放[16,18,19]。在此次實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn) 1w后,GCSF組培養(yǎng)液中 Glu的濃度明顯低于 ALS模型組,說(shuō)明 G-CSF在谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體被一定拮抗的情況下同樣可以增加 Glu的攝取。我們認(rèn)為 G-CSF這一作用是通過(guò)與谷氨酸能神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的粒細(xì)胞集落刺激因子受體(G-CSF-R)相結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。G-CSF-R被認(rèn)為存在于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞上[20],GCSF與之結(jié)合后可激活 JAKs-STATs途徑,通過(guò)上調(diào)基因增加谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)而減輕細(xì)胞外谷氨酸的濃度[21]。

同前所述,氧自由基在 ALS發(fā)病機(jī)制中起到核心作用,并且和 Glu的興奮性毒性作用是密不可分的。Dawson等在原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),證實(shí)過(guò)量的NO有助于 Glu的毒性。而當(dāng)胞外 Glu升高時(shí),可以通過(guò)激活非 NMDA受體增加 Ca2+內(nèi)流,使細(xì)胞內(nèi)和線(xiàn)粒體內(nèi) Ca2+超載,造成電子溢出成為自由基,形成瀑布式鏈鎖反應(yīng),對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元造成不可逆性損害[22]。在我們先前對(duì) G-CSF的研究中,發(fā)現(xiàn)其可以增強(qiáng)缺血再灌注后抗氧化酶系統(tǒng)的活性,降低脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。在本次研究中,發(fā)現(xiàn)在 G-CSF組細(xì)胞中 SOD活性明顯高于 ALS模型組,而 MDA水平明顯下降。

最后我們還對(duì)所有的脊髓切片進(jìn)行 SMI-32染色。SMI-32染色可以很好地顯示神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的胞體、樹(shù)突和某些較粗大的軸突,目前已代替過(guò)去常用的抗乙酰膽堿酯酶抗體,作為脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元標(biāo)記物。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)認(rèn)定脊髓的腹側(cè) SMI-32(+)并且胞體直徑大于 30μm的細(xì)胞為 α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,發(fā)現(xiàn)在 G-CSF組脊髓前角的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目明顯多于 ALS模型組,證實(shí)了 G-CSF的神經(jīng)保護(hù)作用可以通過(guò)增加細(xì)胞外 Glu的攝取和抗自由基作用實(shí)現(xiàn),提示 G-CSF可能作為治療 ALS的新藥物值得進(jìn)一步研究。

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