燙狗脊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

步顯坤， 許 枬， 袁 野， 單國(guó)順， 賈天柱

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧大連116600)

中藥狗脊為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotium baronetz(L.)T.sm.的干燥根莖。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為草部中品。具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、舒經(jīng)絡(luò)、除濕痛及利尿的功效，用于腰腿酸軟、下肢無(wú)力、風(fēng)濕痹痛［1］。狗脊炮制方法歷史悠久，初見(jiàn)于《雷公炮炙論》:“細(xì)剉了，酒拌蒸”，現(xiàn)行2005年版中國(guó)藥典只收載砂燙法［2］。傳統(tǒng)炮制理論認(rèn)為狗脊砂燙后其補(bǔ)肝腎作用增強(qiáng)［3］，與其他中藥配伍，在臨床中用于治療骨質(zhì)疏松癥［4］、頸椎?。?］、神經(jīng)脊髓炎［6］等老年性疾病。隨著社會(huì)人口的老齡化，老年性疾病日漸增多，狗脊的臨床用量也越來(lái)越多。2005版中國(guó)藥典狗脊炮制項(xiàng)下雖收載“燙狗脊”品種，但缺少質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，因此建立有效的方法用于燙狗脊質(zhì)量的控制，保證臨床療效十分必要。目前有關(guān)燙狗脊質(zhì)量控制研究鮮有報(bào)道。鑒于上述原因，本實(shí)驗(yàn)采用TLC法對(duì)燙狗脊進(jìn)行了定性鑒別研究，并采用HPLC測(cè)定了燙狗脊中原兒茶酸的含量，用于燙狗脊的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀;KQ-250BB型數(shù)控超聲波清洗器超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);FA1004B萬(wàn)分之一分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);sartorius-CP225D十萬(wàn)分之一分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。原兒茶醛對(duì)照品(供鑒別用，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):0810-9402);原兒茶酸對(duì)照品(供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110809-200503);薄層硅膠預(yù)制板(青島海洋化工品廠分廠、煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所、青島譜科分離器材有限公司);甲醇、乙腈均為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

試驗(yàn)所用燙狗脊分別產(chǎn)于湖南、廣東、廣西、云南、福建、江西、四川等地，共12批;藥材經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)王冰教授鑒定為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotium baronetz(L.)T.sm.的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 色譜條件

硅膠G預(yù)制板(青島海洋化工品廠分廠、煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所、青島譜科分離器材有限公司);展開(kāi)劑:三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(12∶2∶1∶0.8);顯色劑:1%三氯化鐵-2%鐵氰化鉀溶液(1∶1);點(diǎn)樣量:對(duì)照品溶液2μL，供試品溶液3～6μL。

2.1.2 供試品和對(duì)照品溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備精密稱取原兒茶醛和原兒茶酸對(duì)照品各2 mg，分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備取燙狗脊2 g，加入1%冰醋酸水配置的70%甲醇溶液50 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.3 色譜層析方法

精密吸取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各3～6μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，照薄層色譜法(中國(guó)藥典一部附錄VIB)操作，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(12∶2∶1∶0.8)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鐵-鐵氰化鉀溶液，放置至斑點(diǎn)顯色清晰。薄層色譜結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Cromasil柱(250 mm×4.6 mm;5 μm);流動(dòng)相:乙腈-1%醋酸水(5∶95);流速:1 mL/min;柱溫:25℃;檢測(cè)波長(zhǎng):260 nm;進(jìn)樣量:10μL。理論塔板數(shù)按原兒茶酸計(jì)算，不低于5 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定原兒茶酸對(duì)照品加70%甲醇(1%醋酸配制)制成0.053 7 mg/m L的溶液，作為原兒茶酸對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

圖1 燙狗脊薄層鑒別色譜圖

取藥材粉末(過(guò)20目篩)1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入1%冰醋酸水配置的70%甲醇溶液25 mL，密塞，稱重，超聲處理30 min，取出，放冷，稱重，必要時(shí)補(bǔ)重，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 測(cè)定方法

精密吸取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀中，測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算原兒茶酸的含量。供試品溶液與對(duì)照品溶液的色譜圖分別見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 燙狗脊中原兒茶酸含量測(cè)定高效液相色譜圖

圖3 原兒茶酸對(duì)照品高效液相色譜圖(3.22的色譜峰為溶劑峰)

2.3 含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.3.1 提取溶劑的選擇

經(jīng)對(duì)回流提取的方法與超聲處理的提取方法比較，結(jié)果表明提取效率相當(dāng)，因此提取方法選定較為簡(jiǎn)單的超聲處理提取法;另外，不同溶劑的提取效率考察的結(jié)果顯示70%甲醇的冰醋酸水溶液提取率最高;70%甲醇的冰醋酸水溶液不同提取時(shí)間考察發(fā)現(xiàn)，超聲處理30 min提取效率最高。因此確定提取方法為:70%甲醇的冰醋酸水溶液超聲處理30 min。

2.3.2 流動(dòng)相的選擇 通過(guò)對(duì)不同比例的乙腈-水、甲醇-水、乙腈-1%冰醋酸為流動(dòng)相考察色譜分離條件，結(jié)果顯示乙腈-1%冰醋酸系統(tǒng)色譜分離度最好，冰醋酸的用量對(duì)保留時(shí)間、分離度影響也較大。加入2%、1.5%、1.2%、1%冰醋酸后分離度的結(jié)果表明，乙腈-1%冰醋酸水(5∶95)色譜分離度最佳，理論板數(shù)最高，因此確定乙腈-1%冰醋酸水(5∶95)為流動(dòng)相。

2.3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

測(cè)定原兒茶酸甲醇溶液的紫外吸收光譜，結(jié)果表明，最大吸收在260 nm，因此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。

2.3.4 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

采用Kromasil，Diamond，Agilent ZOBAX 3 種ODS 填料色譜柱(4.6 mm×250 mm)，對(duì)所建立的燙狗脊含量測(cè)定色譜系統(tǒng)進(jìn)行考察，結(jié)果表明，原兒茶酸色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)大于3 000。

2.3.5 對(duì)照品的選擇

狗脊中含有大量的糖類和氨基酸類成分，但是目前沒(méi)有這類成分的單體化合物成分報(bào)道。而其酚酸類成分(狗脊中另一類主要成分［7］)中的原兒茶酸和原兒茶醛含量較高，其抗炎活性［8］與狗脊的藥理作用［9］相近。而且狗脊砂燙后原兒茶酸含量增高［9］，超過(guò)萬(wàn)分之二，因此本實(shí)驗(yàn)中采用原兒茶酸作為含量測(cè)定的對(duì)照品。

2.3.6 方法學(xué)考察

2.3.6.1 線性關(guān)系考察 分別吸取原兒茶酸對(duì)照品溶液2.5、5.0、7.5、10、12.5、15 μL 注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定色譜峰面積，以原兒茶酸的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程:Y=3 570.2X－48.345(r=0.999 4)。原兒茶酸進(jìn)樣量在0.064 5～0.516μg范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系。

2.3.6.2 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取上述原兒茶酸對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，按上述色譜條件測(cè)定色譜峰面積，RSD為1.64%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.3.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取湖南燙狗脊1 g(批號(hào):080703)，精密稱定，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、6、8 h 注入高效液相色譜儀，測(cè)定原兒茶酸峰面積，計(jì)算其RSD為1.11%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定湖南產(chǎn)燙狗脊5份(批號(hào):080703)，按2.2.3項(xiàng)下方法分別制備成供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下含量測(cè)定方法測(cè)定原兒茶酸的峰面積，計(jì)算RSD為1.32%，說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定湖南燙狗脊(批號(hào)080703)粉末0.5 g，共6份，分別加入原兒茶酸對(duì)照品溶液6、7.5、9.0 mL，按 2.2.3項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下含量測(cè)定方法測(cè)定原兒茶酸含量，計(jì)算回收率。原兒茶酸的平均回收率為99.10%，RSD為2.47%，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.6.6 樣品測(cè)定 分別取不同產(chǎn)地，不同批次的燙狗脊藥材粉末(過(guò)20目篩)1 g，精密稱定，按2.2.3項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，并按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 原兒茶酸回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表2 12批燙狗脊原兒茶酸含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 薄層鑒別對(duì)照品的選擇

狗脊化學(xué)成分研究表明，其主要含有為酚類、糖、蛋白質(zhì)、揮發(fā)油等成分。但是糖類成分和蛋白質(zhì)成分目前沒(méi)有可供定性鑒別使用的合適的對(duì)照品。而其酚類成分中以原兒茶醛和原兒茶酸的含量較高，而且二者的活性與狗脊的功效相近，這也是2005年版中國(guó)藥典狗脊定性鑒別項(xiàng)下采用原兒茶酸和原兒茶醛作為對(duì)照品的主要原因。鑒于狗脊砂燙后，原兒茶醛和原兒茶酸含量明顯增高，因此本實(shí)驗(yàn)在建立燙狗脊的薄層定性鑒別時(shí)，采用原兒茶醛和原兒茶酸為對(duì)照品。

3.2 薄層色譜展開(kāi)劑的選擇

經(jīng)對(duì)多批藥材反復(fù)試驗(yàn)，選定分離度較好的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(12∶2∶1∶0.8)為展開(kāi)劑。該展開(kāi)劑對(duì)原兒茶酸和原兒茶醛分離好，而且毒性小。通過(guò)三個(gè)廠家硅膠G預(yù)制板的平行實(shí)驗(yàn)，供試品色譜均有很好的分離度。

3.3 薄層鑒別顯色劑的確定

原兒茶酸和原兒茶醛均為酚性成分，與三氯化鐵-鐵氰化鉀顯色靈敏。因此顯色劑確定為2%三氯化鐵-1%鐵氰化鉀(1∶1)溶液。由于該顯色劑長(zhǎng)時(shí)間放置后，容易產(chǎn)生沉淀，因此最好預(yù)先分別配置2%三氯化鐵水溶液和1%鐵氰化鉀水溶液，臨用時(shí)現(xiàn)配制成1∶1的溶液。

本研究建立的燙狗脊的定性、定量檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，為燙狗脊的質(zhì)量控制提供可靠的方法。

［1］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:155.

［2］賈天柱，李 軍，黃 非，等.狗脊炮制歷史沿革的研究［J］.遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，3(2):136.

［3］葉定江.中藥炮制學(xué)［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002:131.

［4］辛效毅.中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥60例［J］.四川中醫(yī)，1997，15(7):46.

［5］賈存恩.頸安散治療頸椎病100例［J］.吉林中醫(yī)藥，1997，17(3):25.

［6］陰 健.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用(3)［M］.北京:中醫(yī)古籍出版社，1997:182.

［7］胡彥武，于俊林.中藥狗脊的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17(2):275-276.

［8］原 忠，余江天，蘇世文.用薄層掃描法測(cè)定中藥狗脊和黑狗脊中原兒茶酸及咖啡酸的含量［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，17(5):338.

［9］鞠成國(guó).中藥狗脊炮制原理研究［D］.大連:遼寧中醫(yī)學(xué)院，2002.