柴胡、郁金醇提工藝研究

鐘曉明， 潘愛娟， 馮春榮， 黃 真

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053)

蘇郁滴丸是根據(jù)臨床治療抑郁癥有效驗(yàn)方制備而成，主要由柴胡、郁金、石菖蒲和蘇梗等組成，具有舒肝解郁、理氣寬中、寧心安神之功效，主治肝氣郁結(jié)、痰火擾神所致的輕、中度抑郁癥。君藥柴胡為傘形科植物柴胡(Bupleurum chinense DC.)或狹葉柴胡(Bupleurum scorzonerfolium Willd.)，按性狀不同，分別習(xí)稱“北柴胡”及“南柴胡”［1］。戈宏焱等［2］研究表明，柴胡的主要成分柴胡皂苷具有抗驚厥、抗癲癇及抗細(xì)胞黏附等多種藥理作用，可使抑郁型大鼠腦中的高香草酸、去甲腎上腺素、多巴胺及5-羥色胺的含量升高，對(duì)抑郁癥起到治療作用。張峰等［3］研究表明，柴胡可能是通過降低腦組織中前額葉5-羥色胺和多巴胺含量而發(fā)揮抗抑郁作用的。郁金為姜科植物溫郁金(Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling)、姜黃(Curcuma longa L.)、廣西莪術(shù)(Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang)或蓬莪術(shù)(Curcuma phaeocaulis Val.)的干燥塊根。前兩者分別習(xí)稱“溫郁金”和“黃絲郁金”，其余按性狀不同習(xí)稱“桂郁金”或“綠絲郁金”。韓珍等［4］研究結(jié)果表明，郁金對(duì)小鼠抑郁癥的強(qiáng)迫游泳模型、懸尾模型和拮抗利血平所致的抑郁癥模型均有治療作用。本文優(yōu)選出柴胡、郁金的最佳醇提工藝，為蘇郁滴丸的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與儀器

柴胡皂苷a對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110777-200406)，柴胡藥材與郁金藥材均購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠提供，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)資源鑒定教研室陳孔榮副教授鑒定分別為傘形科的南柴胡和姜科的黃絲郁金;化學(xué)試劑均為分析純。

賽多利斯分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);752型紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)。

2 檢測方法的建立

2.1 評(píng)價(jià)指標(biāo)的確定

蘇郁滴丸方中以柴胡為君藥，郁金中起抗抑郁作用的成分為姜黃素，所占的含量極少。所以以柴胡總皂苷的提取率為指標(biāo)考察柴胡郁金的提取工藝。

2.2 對(duì)照品溶液的制備及測定波長的選擇

精密稱取柴胡皂苷a對(duì)照品3 mg，用甲醇定容到10 mL，作為對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品與供試品溶液適量，水浴揮干溶劑，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，60℃水浴15 min，取出，冰水冷卻數(shù)分鐘，各加入冰醋酸5.0 mL，搖勻，以空白做對(duì)照，在400～800 nm處進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果對(duì)照品與供試品溶液的最大吸收在603 nm處。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密吸取柴胡皂苷 a對(duì)照品溶液0.2，0.3，0.4，0.7，0.8 mL揮干溶劑，按2.2項(xiàng)下的顯色方法操作，在603 nm處測定吸光度(A)，以柴胡皂苷a對(duì)照品溶液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為A=18.094C+0.062 3，r=0.999 7。表明柴胡皂苷在0.06～0.24 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密吸取6份柴胡皂苷a對(duì)照品溶液0.3 mL，按2.2項(xiàng)下的顯色方法操作，在603 nm處測定吸光度，計(jì)算得RSD為1.29%。同法用6份柴胡、郁金提取液供試液檢查重復(fù)性，得RSD為2.15%。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取最佳工藝下的柴胡郁金提取液供試品每隔10 min測1次，共測定6次，計(jì)算得RSD為2.07%。表明本品在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

取柴胡、郁金供試液一定量3份，分別加入相當(dāng)于樣品量80%、100%和120%的柴胡皂苷a對(duì)照品，同法平行制備3份，共9份進(jìn)行吸光度的測定。

由表1可知，柴胡、郁金提取液中柴胡皂苷a的加樣回收率為99.99%，RSD為2.65%，表明本方法回收率良好。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 柴胡、郁金醇提工藝研究

3.1 樣品溶液的制備

將濃縮后的柴胡、郁金提取液用水飽和正丁醇萃取4次，合并正丁醇液，減壓濃縮至干，用甲醇溶解并定容，作為供試品溶液。

3.2 提取溶媒的確定

精密稱取4份柴胡和郁金藥材各2.5 g，分別在兩份藥材中加入70%乙醇，其余兩份中加入純化水各50 mL，分別進(jìn)行回流提取2 h，超聲提取2 h，過濾，減壓濃縮，用水飽和正丁醇萃取4次，合并正丁醇液，減壓濃縮至干，用甲醇溶解并定容，按對(duì)照品方法顯色，于603 nm處測定A，計(jì)算提取率。由表2可知，采用乙醇回流提取法提取柴胡總皂苷的提取率最高。

表2 不同提取溶劑和方法對(duì)皂苷提取的影響

3.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.3.1 因素水平表

選用4個(gè)影響提取效果的主要因素:乙醇濃度(A)、乙醇用量(B)、提取次數(shù)(C)和回流提取時(shí)間(D)，每個(gè)因素各選3個(gè)水平，制定因素水平表。見表3。

表3 正交試驗(yàn)因素水平

3.3.2 樣品的制備

按處方1∶1的比例分別稱取9份柴胡、郁金混合藥材5 g，按L9(34)正交表所列條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，收集提取液，濃縮，用水飽和正丁醇萃取4次，減壓濃縮至干，用甲醇定容至25 mL量瓶中，備用。

3.3.3 提取工藝正交安排及結(jié)果分析

按正交設(shè)計(jì)表對(duì)樣品提取率進(jìn)行考察，結(jié)果見表4，表5。

表4 提取工藝正交安排及結(jié)果分析

從表4直觀分析得出各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響次序?yàn)镃>A>B>D。再從各因素水平來看(K值分析)A和D均為 K2>K1>K3，B 為 K2>K3>K1，C 為 K3>K2>K1，故選擇提取條件為A2B2C3D2。結(jié)合表5的方差分析，A，B因素均其中C因素對(duì)柴胡皂苷的提取影響顯著，其他因素未見有顯著性差異。為提高工作效率，采用D1，即提取1 h，故柴胡、郁金提取液以柴胡皂苷為評(píng)價(jià)指標(biāo)來看，采用柴胡、郁金的最佳提取條件是A2B2C3D1，即用相當(dāng)于藥材8倍量的70%的乙醇回流提取3 h，每次1 h。

表5 提取條件因素方差分析

3.3.4 優(yōu)選工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

取3批藥材按正交試驗(yàn)優(yōu)選出的最佳工藝提取，結(jié)果測得柴胡皂苷的提取率為1.86%、1.82%和1.79%，平均提取率為1.82% ，RSD為1.93%。結(jié)果表明該工藝良好。

4 討論

4.1 本實(shí)驗(yàn)將柴胡、郁金合提后測得姜黃素的量比郁金單提時(shí)增加，柴胡皂苷的量無變化，這可能與柴胡皂苷起表面活性劑作用增加了姜黃素的提取率有關(guān)，且有利于工業(yè)化生產(chǎn)，故可將柴胡、郁金合提。

4.2 通過正交試驗(yàn)和重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)確定柴胡、郁金的最佳提取工藝為采用相當(dāng)于藥材8倍量的70%乙醇提取3次，每次1 h。該工藝穩(wěn)定，提取效率高，適于工業(yè)化大生產(chǎn)。

［1］中國藥典［S］.一部.2005.

［2］戈宏焱，陳 博，許 丹，等.柴胡皂苷A對(duì)抑郁模型大鼠腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物含量的影響［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2008，29(8):1535-1538.

［3］張 峰，曹仲偉，張學(xué)杰，等.柴胡對(duì)大鼠慢性應(yīng)激抑郁模型腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物含量的影響［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，29(3):224-226.

［4］韓 珍，賀 弋，楊 艷，等.郁金抗抑郁作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.寧夏醫(yī)學(xué)院報(bào)，2008，30(3):275-288.